Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן האתחול המסופקים על-ידי איווה סטייט ומאת הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (R35GM128747).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC, 8-16-8333-אני) של איווה סטייט.
1. סינתזה של החיישן המתח אינטגרטיבית
<ol><li>אישית, להזמין ssDNAs (ראה טבלה של חומרים). הערה: רצפי ssDNA הם כדלקמן. סטרנד העליון הוא AGG ACG חטיבתי CGG GCC /5ThioMC6-D/GGG/3BHQ_2 /. הגדי?...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ITS היא ונגישות גבוהה טכניקה חזקה עבור הסלולר לאלץ את מיפוי במונחים של סינתזה והן ביישום. עם כל החומרים מוכנים, ITS יכול להיות מסונתז בתוך יום אחד. במהלך הניסויים, נחוצים רק שלושה צעדים של ציפוי פני השטח לפני ציפוי התא. לאחרונה, אנחנו מפושט ההליך ציפוי צעד אחד נוסף על-ידי קישור ישירות את ITS אלבו?...

תאים להסתמך על אינטגרינים כדי לדבוק ולהפעיל כוחות הסלולר מטריצה חוץ-תאית. שידור אדהזיה וכוח בתיווך אינטגרין תא מכריעים עבור תא הפצת1,2,3,ההעברה4והישרדות5,6,7. בטווח הארוך, איתות biomechanical אינטגרין גם השפעות תא התפשטות8,9,10 ובידול11,12. חוקרים פיתחו שיטות שונות למדידת וכוחות מפה מסר אינטגרין סלולרי-הממשק תא-מטריקס. שיטות אלה מבוססות על תשתית גמישה13, מערך micropost14, או אטומי בכוח מיקרוסקופ (AFM)15,16. תשתית גמישה ושיטות micropost להסתמך על להרכב של סובסטרטים הדו ח הלחץ הסלולר, יש מגבלות מבחינת רזולוציה מרחבית, להכריח את הרגישות. AFM יש רגישות גבוהה כוח, אבל הוא אינו יכול לזהות כוח בנקודות מרובים בו זמנית, ולכן קשה למפות כוח הסלולר המועברת על ידי אינטגרינים.
בשנים האחרונות פותחו מספר טכניקות ללמוד הסלולר כוח ברמה המולקולרית. אוסף של חיישנים המתח מולקולרי המבוסס על17,פוליאתילן גליקול18, עכביש משי פפטיד19, ו DNA20,21,22,23 פותחו כדי דמיינו ונטר במתח המועברת על ידי חלבונים מולקולרית. בין שיטות אלה, DNA אומצה לראשונה כמו החומר סינתזה במתח להעריך את הקשר (TGT), rupturable מקשר זאת שמחליש את הגבול העליון של אינטגרין מתחים בתוך תאים חיים22,24. מאוחר יותר, טכניקת העברת DNA ו קרינה פלואורסצנטית תהודה היו המשולבות ליצירת סיכת ראש מבוסס DNA המתח פלורסנט חיישנים לראשונה על ידי קבוצה של חן23 של Salaita קבוצה20. החיישן מבוסס DNA המתח מכבנה מדווח אינטגרין המתח בזמן אמת, יושם בהצלחה במחקר של סדרת פונקציות הסלולר21. לאחר מכן, המעבדה של וואנג בשילוב ש- TGT עם הזוג fluorophore-כ'חטיף דו ח אינטגרין מתח. חיישן זה נקרא25,ITS26. ITS מבוסס על שני גדילי ה-DNA (dsDNA) ויש לו טווח דינמי רחב יותר (10-60 pN) לצורך כיול מתח אינטגרין. בניגוד סיכת ראש מבוסס DNA חיישנים, ITS אינו מדווח כוח הסלולר בזמן אמת אבל יקליט כל האירועים ההיסטוריים אינטגרין טביעת רגלו של כוח הסלולר; תהליך הצטברות אות זה משפר את הרגישות לכוח הסלולר הדמיה, שהופך אותו ריאלי לכוח הסלולר התמונה אפילו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות זולים. הסינתזה של ITS נוח יחסית יותר כמו זה נוצר על ידי hybridizing חד גדילי שני DNAs (ssDNA).
ITS הוא dsDNA 18-בסיס-לזווג מצומדת עם ביוטין, fluorophore, כ'חטיף (חור שחור כ'חטיף 2 [BHQ2])27arginylglycylaspartic מחזורית חומצה (RGD) פפטיד28 כמו ליגנד פפטיד integrin (איור 1). נמוך יותר סטרנד הוא מצומדת עם fluorophore (Cy3 משמש כתב יד זה, בעוד צבעים אחרים, כגון סדרת Cy5 או אלקסה, גם הוכחו ריאלי במעבדה שלנו) ואת התג ביוטין, שבה ITS ותשמרו על מצע מאת ביוטין-אבידין בונד. סטרנד העליונה היא מצומדת עם פפטיד את RGD, את כ'חטיף חור שחור, אשר המרווה Cy3 עם 98% שכבתה יעילות26,27. פרוטוקול שהוצגו במאמר זה, יש צפיפות ציפוי ITS על מצע בסביבות 1100/מיקרומטר2. זוהי צפיפות שלנו בעבר מכויל עבור 18 dsDNA biotinylated bp מצופה על המצע neutrAvidin functionalized על-ידי ביצוע זהה ציפוי פרוטוקול29. כאשר תאים לדבוק המצע מצופה של ITS, integrin נקשר את ITS דרך RGD ומעביר מתח ITS. ITS יש סובלנות מתח מסוים (Ttol) אשר מוגדר סף המתח שמפריד את dsDNA של ITS בתוך 2 s22מכנית. שלו להיקרע על-ידי מתח אינטגרין מוביל את ההפרדה של כ'חטיף לצבוע את זה לאחר מכן פולט קרינה פלואורסצנטית. כתוצאה מכך, המתח הבלתי נראה אינטגרין המרת אות פלורסצנטיות, הכוח הסלולר יכולים למפות על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה.
כדי להדגים את היישום של ITS, אנו משתמשים דגים keratocyte כאן, מודל תא בשימוש נרחב עבור תא העברה המחקר30,31,32, צ'ו-K1 תא, שורת התאים nonmotile נפוץ וכן NIH 3T3 פיברובלסט. Coimaging של אינטגרין המתח ותא מבנים גם מתנהל.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

מתח מולקולרית המועברת על ידי אינטגרין-ליגנד חוב זה האות מכני בסיסי במסלול אינטגרין שמשחק תפקידים משמעותיים בתוך התא פונקציות רבות התנהגויות. כדי לכייל תמונה אינטגרין מתח עם רגישות גבוהה כוח והרזולוציה המרחבית, פיתחנו חיישן המתח אינטגרטיבית (ITS), חיישן המתח פלורסנט מבוסס DNA. ITS מופעל כדי לזרוח אם הסדירה מתח מולקולרית, ובכך המרת כוח לאות פלורסנט ברמה המולקולרית. סף המתח להפעלה ITS הוא tunable בטווח של 10 – 60 pN שמכסה היטב את הטווח הדינמי של אינטגרין המתח בתאים. על מצע הושתל עם ITS, המתח אינטגרין של תאים חסיד דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית, עם תמונה ברזולוציה כחיוניים. ITS הוא גם תואם תא המבניות תאים חיים והן תאים קבוע. ITS יושם בהצלחה לחקר נדידת תאים להתכווצות של טסיות. מאמר זה מפרט את ההליך עבור סינתזה של יישום ITS במחקר של אינטגרין מסר כוח הסלולר.

עם ITS, נתפס על מפת המתח אינטגרין דגים keratocytes. זה מראה keratocyte נודד אינטגרין מתח על שני מסלולים לכוח (איור 2 א). הרזולוציה של המפה כוח היה מכויל כדי להיות 0.4 מיקרומטר (איור 2B). מתח גבוה אינטגרין מתרכזת בקצה תחום אחורי (איור 3 א). ITS מר?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

אינטגרין המתח ממלא תפקידים חשובים פונקציות שונות של התא. עם חיישן המתח אינטגרטיבית, המתח אינטגרין מכויל עם רגישות picoNewton (pN), עם תמונה ברזולוציה כחיוניים.

הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

חיישן מתח אינטגרטיבי מבוסס DNA זה, או ITS, המרת אות כוח פלואורסצנטיות באופן מקומי מאפשר הדמיה ישירה של כוח תאי עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ל-ITS רזולוציה מרחבית גבוהה ורגישות גבוהה. סף ההפעלה ניתן לכוונון, ומאפשר תמונה סלקטיבית של מתח אונטגרין ברמות שונות.לאחר קבלת ה- DNA החד-גדילי המותאם אישית, או ssDNA, מעניין, כדי להצטייד פפטיד RGD כדי quencher ssDNA thiolated, תחילה להוסיף 100 microliters של 0.5 טוחנת EDTA ב 400 microliters של מים על 450 microliters של פתרון TCEP מוכן טרי. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של פתרון TCEP-EDTA ל-20 מיקרוליטרים של quencher DNA של תיול מילימולרי אחד ב-PBS עבור דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להצמיע אמין RGD עם סולפו-SMCC, להוסיף 40 microliters של 23 מילימטרים טריים sulfo-SMCC כדי 100 microliters של 11 מילימולרית טרי RGD אמין פתרון עבור דגירה 20 דקות בטמפרטורת החדר.כדי להצטלב RGD אמין SMCC עם quencher ssDNA thiolated, לערבב את כל הנפח של פתרון quencher ssDNA thiolated עם כל הנפח של פתרון SMCC אמין RGD עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מעבירים את הפתרון לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, מערבבים נתרן כלורי טוחנת עם תספורת הדנ"א של תיול ומינוס 20 מעלות צלזיוס, מצונן, 100%אתנול ביחס של 1 עד 10 ל-25, ומניחים את התגובה במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך כ-30 דקות.כאשר הדנ"א זירז, לאסוף את ה-DNA על ידי צנטריפוגה, ולתלות מחדש את גלולה PBS למדידת ריכוז ה-DNA על ספקטרומטר. עבור חיישן מתח אינטגרטיבי, או ITS, סינתזה, מערבבים את פתרונות הדנ"א של הגדיל העליון והתחתון ביחס של 1.1 ל-1 טוחן, ודגירה את התגובה בן לילה בארבע מעלות צלזיוס לפני הנחת אליצים של התערובת במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. עבור קיבוע שלה, מעיל 29 מילימטר קוטר, צלחת פטרי תחתון זכוכית עם 200 microliters של 0.1 מיליגרם למיליליטר biotinylated סרום בסרום אלבומין, או BSA-ביוטין, במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.כאשר BSA-ביוטין יש סופח פיזית על משטח הזכוכית, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם 200 microliters של PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו דגירה עם 200 microliters של 50 מיקרוגרם למיליליטר של חלבון אבידין במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם PBS כפי שהוכח, ולהוסיף 200 microliters של 0.1-micromolar ITS עבור דגירה נוספת של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את המנה שלוש פעמים עם PBS, משאיר את הכביסה האחרונה בצלחת עד ציפוי התא.כדי ליזום תרבות קרטוציטים של דגים, השתמשו בטווייזר שטוח קצה כדי לתלוש חתיכת קנה מידה מדג, וללחוץ בעדינות את הסולם על באר של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית, כאשר הצד הפנימי של הסולם יוצר קשר עם הזכוכית. המתן כ-30 שניות עד שקנה הדגים ייצמד למשטח הזכוכית של המנה לפני שיכסה את הסולם במילימטר אחד של המדיום השונה של איסקוב. לאחר מכן, הדגירה את הסולם בתיבה כהה ולחה במשך שש עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.כדי צלחת keratocytes על פני השטח של ITS, להחליף את המדיום מן צלחת תרבות keratocyte עם פתרון ניתוק תא 1X עבור דגירה של שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, החלף את פתרון הניתוק במדיום שלם טרי, ונתק את התאים בצינורות עדינים. לאחר מכן, להתאים את התאים לריכוז המתאים לציפוי, וזרע אותם על צלחת מצופה ITS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני הדמיה.להדמיית מתח מעין-בזמן אמת בתאים חיים, העבר את התאים לשלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחר את המטרה 40 או 100 פעמים. בתוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה לשנייה אחת ואת מרווח המסגרת של 20 שניות כדי לקבל וידאו של תמונות ITS. לאחר מכן, השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח תמונות כדי להחסיר מסגרת קודמת של הווידאו ITS ממסגרת נוכחית כדי לחשב את אות ITS שהופק לאחרונה במרווח המסגרות האחרון.אות ITS החדש המיוצר מייצג את המתח האטרגרי שנוצר במרווח המסגרת האחרון, ובכך מדווח על הכוח הסלולרי בזמן אמת. כאן, מיפוי מתח integrin מדגים את ההטבה של מתח integrin בשני מסלולי כוח במהלך נדידת keratocyte. הרזולוציה של מפת הכוח יכולה להיות מכוילת ל-0.4 מיקרומטר.מתח איטגרין גבוה מתרכז בשוליים האחוריים של קרטוציטים דגים מוטילים. בתאים לא מוטיבציה, נוצרת תבנית מתח איטגרית ספציפית השונה למדי מזה שנצפה בקרטוציטים הנודדים במהירות. הידבקויות מוקד ואת המתח integrin של קרטוציטים דגים ניתן דימוי משותף כדי להעריך את הקשר בין מתח integrin ומבנה התא בתאים של עניין.עם ITS, כוח הידבקות התא הופך גלוי עם רזולוציה ורגישות דומה הדמיה מבנית התא. טכניקה זו סוללת את הדרך לחקר יחסי מין של מבנה כוח בתאים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

רזולוציה גבוהה סיבים אופטיים עבור Microendoscopy באתרו נייד הדמיה

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomolecular איתור העסקת ההחזרה interferometric דימות חיישן (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

מדידה לשחרר מתח בנגע לייזר מושרה אקסון להעריך הידבקות axonal למצע בpiconewton והאלפית השני רזולוציה

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...