Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

यह काम स्टार्टअप कोष द्वारा समर्थित किया गया था आयोवा राज्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की और राष्ट्रीय सामांय चिकित्सा विज्ञान संस्थान (R35GM128747) ।

यहां वर्णित सभी तरीकों को आयोवा राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC, 8-16-8333-I) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. एकीकृत तनाव सेंसर का संश्लेषण
<ol><li>अनुकूलित और आदेश ssDNAs ( स?...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

अपने दोनों संश्लेषण और आवेदन के संदर्भ में सेलुलर फोर्स मानचित्रण के लिए एक उच्च सुलभ अभी तक शक्तिशाली तकनीक है. सभी के लिए तैयार सामग्री के साथ, इसके 1 दिन के भीतर संश्लेषित किया जा सकता है । प्रयोगों के...

कोशिकाओं का पालन करने के लिए integrins पर निर्भर करते हैं और कोशिकीय मैट्रिक्स के लिए सेलुलर बलों डालती. Integrin-मध्यस्थता सेल आसंजन और सेना संचरण1,2, प्रवास3,4, और जीवन रक्षा5,6,7फैल सेल के लिए महत्वपूर्ण हैं । लंबी अवधि में, integrin biomechanical संकेतन भी प्रभावित करता है सेल प्रसार8,9,10 और विभेदन11,12। शोधकर्ताओं ने कोशिका-मैट्रिक्स इंटरफेस पर integrin-संचारित सेलुलर बलों को मापने और मैप करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए हैं । इन पद्धतियों के आधार पर कर रहे है लोचदार बुनियाद13, सरणी micropost14, या परमाणु फोर्स micropost (afm)15,16। लोचदार बुनियाद और micropost तरीकों सेलुलर तनाव की रिपोर्ट के लिए बुनियाद के विरूपण पर भरोसा करते हैं और स्थानिक संकल्प और बल संवेदनशीलता के मामले में सीमाएं हैं. AFM उच्च शक्ति की संवेदनशीलता है, लेकिन यह एक साथ कई स्थानों पर बल का पता लगाने के लिए, यह मुश्किल सेलुलर integrins द्वारा प्रेषित बल मैप करने के लिए कर सकते हैं ।
हाल के वर्षों में, आणविक स्तर पर सेलुलर बल का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था । पॉलीथीन ग्लाइकोल17,18, स्पाइडर सिल्क पेप्टाइड19, और डीएनए20,21,22,23 पर आधारित आणविक तनाव सेंसर का एक संग्रह विकसित किया गया कल्पना और आणविक प्रोटीन द्वारा प्रेषित तनाव की निगरानी । इन तकनीकों में, डीएनए पहले तनाव गेज तार में संश्लेषण सामग्री के रूप में अपनाया गया था (TGT), एक rupturable linker कि जीवित कोशिकाओं में integrin तनाव की ऊपरी सीमा modulates22,24. बाद में, डीएनए और प्रतिदीप्ति अनुनाद अंतरण तकनीक को संयुक्त रूप से हेयरपिन डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर बनाया गया, जो चेन के समूह23 और सबिता के समूह20द्वारा पहले किया गया था । हेयरपिन डीएनए आधारित तनाव सेंसर रीयल-टाइम में इंटीरिइन टेंशन की रिपोर्ट करता है और इसे सेलुलर फंक्शन्स21की एक सीरीज के अध्ययन में सफलतापूर्वक लागू किया गया है । इसके बाद, वांग की प्रयोगशाला ने एक TGT को फ्लूओफोर-क्वान्चर जोड़ी के साथ एकीकृत करके तनाव की रिपोर्ट की । इस सेंसर का नाम है एक इसके25,26। इसकी डबल-फंसे डीएनए (dsDNA) पर आधारित है और integrin तनाव अंशांकन के लिए एक व्यापक गतिशील रेंज (10-60 pN) है । हेयरपिन डीएनए-आधारित सेंसरों के विपरीत, यह वास्तविक समय में सेलुलर बल की रिपोर्ट नहीं करता है, लेकिन सेलुलर बल के पदचिह्न के रूप में सभी ऐतिहासिक integrin घटनाओं रिकॉर्ड; यह संकेत संचय प्रक्रिया सेलुलर फोर्स इमेजिंग के लिए संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है, यह एक कम अंत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ भी छवि सेलुलर बल के लिए व्यवहार्य बना रही है । इसका संश्लेषण अपेक्षाकृत अधिक सुविधाजनक होता है क्योंकि यह दो एकल-असहाय DNAs (ssDNA) को संकरित करके बनाया जाता है ।
इसकी एक 18-बेस-युग्मित dsdna biotin के साथ संयुग्मित, एक fluorophore, एक शामक (ब्लैक होल शामक 2 [BHQ2])27, और एक चक्रीय arginylglycylaspartic एसिड (rgd) के रूप में28 पेप्टाइड एक integrin पेप्टाइड लिगामेंट (चित्रा 1). लोअर strand फ्लोरोफोर (Cy3 इस पांडुलिपि में प्रयोग किया जाता है के साथ संयुग्मित है, जबकि अंय रंगों, जैसे Cy5 या Alexa श्रृंखला के रूप में, यह भी हमारे प्रयोगशाला में संभव सिद्ध किया गया है) और बायोटिन टैग, जिसके साथ अपने बायोटिन-avidin बांड द्वारा एक सब्सट्रेट पर immobilized है । ऊपरी किनारा rgd पेप्टाइड और ब्लैक होल quencher, जो लगभग ९८% शमन क्षमता के साथ Cy3 quencher के साथ संयुग्मित है26,27। इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, एक सब्सट्रेट पर इसकी कोटिंग घनत्व 1100/μm2के आसपास है । यह घनत्व हम पहले 18 बीपी biotinylated dsDNA के लिए calibrated है neutrAvidin-functionalized सब्सट्रेट पर लेपित उसी कोटिंग प्रोटोकॉल29का पालन करके । जब कोशिकाओं को अपने साथ लेपित सब्सट्रेट का पालन, integrin अपने RGD के माध्यम से बांधता है और इसके लिए तनाव पहुंचाता । इसकी एक विशिष्ट तनाव सहिष्णुता (टीटोल) जो तनाव सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है कि यंत्रवत् 2 एस22के भीतर के dsdna अलग है । Integrin तनाव द्वारा इसका टूटना डाई कि बाद में प्रतिदीप्ति उत्सर्जित से शामक के जुदाई की ओर जाता है । परिणामस्वरूप, अदृश्य समांतक तनाव प्रतिदीप्ति संकेत में परिवर्तित हो जाता है और सेलुलर बल प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा प्रतिचित्रित किया जा सकता है ।
इसके लिए आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम मछली keratocyte यहां का उपयोग करें, सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सेल मॉडल30,31,३२, चो-K1 सेल, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया अचल सेल लाइन, और nih 3t3 फाइलब्लास्ट । Integrin तनाव और कोशिका संरचनाओं के कोइन्एजिंग भी आयोजित किया जाता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
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imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Integrin-ligand बांड द्वारा प्रेषित आणविक तनाव integrin मार्ग है कि कई सेल कार्यों और व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता में मौलिक यांत्रिक संकेत है । जांच करने के लिए और उच्च बल संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प के साथ छवि integrin तनाव, हम एक एकीकृत तनाव संवेदक (इसके), एक डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर विकसित की है । इसकी फ्लोरेस्क को सक्रिय किया जाता है यदि एक आणविक तनाव को बनाए रखने, इस प्रकार आणविक स्तर पर प्रतिदीप्त संकेत करने के लिए बल परिवर्तित । इसके सक्रियकरण के लिए तनाव सीमा 10 – 60 पीएन की श्रेणी में स्वरित्र है जो अच्छी तरह से कोशिकाओं में integrin तनाव की गतिशील रेंज को शामिल किया गया है । एक सब्सट्रेट के साथ grafted पर, आसंन कोशिकाओं के integrin तनाव प्रतिदीप्ति और सब्सट्रेट संकल्प पर imaged द्वारा कल्पना की है । इसके अलावा दोनों जीवित कोशिकाओं और स्थिर कोशिकाओं में कोशिका संरचनात्मक इमेजिंग के साथ संगत है । इसकी सफलतापूर्वक प्लेटलेट संकुचन और कोशिका प्रवास के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । इस कागज के संश्लेषण और integrin-संचारित सेलुलर बल के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए प्रक्रिया का विवरण ।

इसके साथ, मछली keratocytes के integrin तनाव नक्शा कब्जा कर लिया गया था । यह दर्शाता है कि स्वच्छपटणु दो बल पथों (चित्र 2a) पर समाकनन तनाव उत्पन्न करता है । बल मानचित्र के विभेदन को ०.४ μm (चि...

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Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin तनाव विभिंन सेल कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक एकीकृत तनाव संवेदक के साथ, integrin तनाव picoNewton (पीएन) संवेदनशीलता के साथ calibrated है और submicron संकल्प पर imaged ।

इमेजिंग Integrin तनाव और सेलुलर बल Submicron संकल्प पर एक एकीकृत तनाव सेंसर के साथ

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

यह डीएनए आधारित एकीकृत तनाव सेंसर, या आईटीएस, फ्लोरेसेंस के लिए बल संकेत को बदलने से स्थानीय रूप से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ सेलुलर बल की प्रत्यक्ष इमेजिंग सक्षम बनाता है। इसके एक उच्च स्थानिक संकल्प और एक उच्च संवेदनशीलता है । सक्रियण सीमा ट्यून करने योग्य है, जिससे विभिन्न स्तरों पर स्टीग्रिन तनाव की चयनात्मक छवि की अनुमति है।अनुकूलित एकल फंसे डीएनए, या एसएसडीएनए, ब्याज की प्राप्त करने के बाद, थियालेटेड एसएसडीएनए क्वेंचर को आरजीडी पेप्टाइड को संयोजित करने के लिए, पहले 400 माइक्रोलीटर पानी में 0.5-मोलर एडटा के 100 माइक्रोलीटर को ताजा तैयार टीएमईपी समाधान के लगभग 450 माइक्रोलीटर में जोड़ें। फिर, कमरे के तापमान पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए पीबीएस में एक मिलीमोलर थिओल डीएनए क्वेंचर के 20 माइक्रोलीटर के लिए टीसीईपी-EDTA समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। सल्फो-एसएमसीसी के साथ आरजीडी अमीन को संयोजित करने के लिए, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए हौसले से तैयार 11-मिलीमोलर आरजीडी अमीन समाधान के 100 माइक्रोलीटर को ताजा तैयार 23-मिलीमोलर सल्फो-एसएमसीसी के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें।थियोलेटेड एसएसडीएनए क्वेंचर के साथ आरजीडी अमीन एसएमसीसी को संयोजित करने के लिए, कमरे के तापमान पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए आरजीडी अमीन एसएमसीसी समाधान की पूरी मात्रा के साथ थिओलेटेड एसएसडीएनए क्वेंचर समाधान की पूरी मात्रा को मिलाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, समाधान को रातोंरात चार डिग्री सेल्सियस भंडारण में स्थानांतरित करें। अगली सुबह, थिओल-संयुग्मित डीएनए समाधान और शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस के साथ तीन-मोलर सोडियम क्लोराइड मिलाएं, ठंडा, एक-से-10-से-25 अनुपात में 100% इथेनॉल, और प्रतिक्रिया को लगभग 30 मिनट के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।जब डीएनए उपजी है, अपकेंद्रित्र द्वारा डीएनए इकट्ठा, और एक स्पेक्ट्रोमीटर पर डीएनए एकाग्रता के माप के लिए पीबीएस में गोली पुनर्व्यवित । एकीकृत तनाव सेंसर, या इसके लिए, संश्लेषण, ऊपरी और निचले स्ट्रैंड डीएनए समाधानों को 1.1-से-एक-मोलर अनुपात में मिलाएं, और दीर्घकालिक भंडारण के लिए शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण के aliquots रखने से पहले चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें। इसके स्थिरीकरण के लिए, 0.1 मिलीग्राम-प्रति-मिलीलीटर बायोटिनाइलेटेड गोजातीय सीरम एल्बुमिन, या बीएसए-बायोटिन के 200 माइक्रोलीटर के साथ 29 मिलीमीटर व्यास, ग्लास-बॉटम पेट्री डिश को चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोट करें।जब बीएसए-बायोटिन ने कांच की सतह पर शारीरिक रूप से सोख लिया हो, तो डिश को प्रति वॉश ताजा पीबीएस के २०० माइक्रोलीटर के साथ तीन बार धोएं, इसके बाद इनक्यूबेशन ५० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ 30 मिनट तक एविडिन प्रोटीन के चार डिग्री सेल्सियस पर । इनक्यूबेशन के अंत में, प्रदर्शन के रूप में PBS के साथ तीन बार पकवान धोने, और चार डिग्री सेल्सियस पर एक और 30 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए ०.१-micromolar ITS के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । इनक्यूबेशन के अंत में, डिश को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, सेल प्लेटिंग तक डिश में आखिरी वॉश छोड़ दें।एक मछली keratocyte संस्कृति शुरू करने के लिए, एक फ्लैट इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग करने के लिए एक मछली से पैमाने का एक टुकड़ा बांधना, और धीरे एक असंशोधित ग्लास के कुएं पर पैमाने पर प्रेस नीचे पेट्री पकवान, गिलास से संपर्क पैमाने के भीतरी पक्ष के साथ । मछली के पैमाने के लिए लगभग 30 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें पूरा इस्कोव संशोधित Dulbecco माध्यम के एक मिलीमीटर के साथ पैमाने को कवर करने से पहले पकवान के कांच की सतह का पालन करने के लिए । फिर, कमरे के तापमान पर छह से 48 घंटे के लिए एक अंधेरे और आर्द्र बॉक्स में पैमाने को इनक्यूबेट करें।इसके 100 की सतह पर keratocytes थाली के लिए, कमरे के तापमान पर तीन मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 1X सेल अलग समाधान के साथ keratocyte संस्कृति पकवान से माध्यम की जगह । इनक्यूबेशन के अंत में, अलग समाधान को ताजा पूर्ण माध्यम से प्रतिस्थापित करें, और कोशिकाओं को कोमल पिपटिंग के साथ अलग करें। फिर, चढ़ाना के लिए उपयुक्त एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को समायोजित करें, और इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ITS लेपित पकवान पर बीज ।लाइव कोशिकाओं में अर्ध-वास्तविक समय इंटेग्रीन टेंशन इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के चरण में स्थानांतरित करें, और 40 या 100 बार उद्देश्य का चयन करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, आईटीएस छवियों का एक वीडियो प्राप्त करने के लिए एक्सपोजर समय को एक सेकंड और 20 सेकंड के फ्रेम अंतराल पर सेट करें। फिर, नवीनतम फ्रेम अंतराल में नए उत्पादित इसके संकेत की गणना करने के लिए एक वर्तमान फ्रेम से इसके वीडियो के पिछले फ्रेम को घटाना करने के लिए एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करें।नए उत्पादित इसके संकेत नवीनतम फ्रेम अंतराल में उत्पन्न इंटीग्रिन तनाव का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे अर्ध-वास्तविक समय तरीके से सेलुलर बल की रिपोर्टिंग होती है। यहां, इंटीग्रिन टेंशन मैपिंग केराटोसाइट माइग्रेशन के दौरान दो फोर्स ट्रैक्स पर इंटीग्रीन टेंशन को शामिल करने को दर्शाती है । इसके बाद फोर्स मैप के रिजॉल्यूशन को ०.४ माइक्रोमीटर कैलिब्रेट किया जा सकता है ।उच्च इंटीग्रिन तनाव मोटिवल फिश केराटोसाइट्स में रियर मार्जिन पर केंद्रित है। गैर-रोगी कोशिकाओं में, एक विशिष्ट इंटीग्रलिन टेंशन पैटर्न जो तेजी से माइग्रेट करने वाले केराटासाइट में मनाए गए से काफी अलग है। फोकल आसंजन और मछली केराटोसाइट्स के इंटीग्रीन तनाव को ब्याज की कोशिकाओं में इंटीग्रीन तनाव और कोशिका संरचना के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए सह-छवि की जा सकती है।इसके साथ, सेल आसंजन बल एक संकल्प और सेल संरचनात्मक इमेजिंग के तुलनीय संवेदनशीलता के साथ दिखाई देता है। यह तकनीक कोशिकाओं में एक बल संरचना परस्पर क्रिया के अध्ययन के लिए सड़क प्रशस्त करती है।

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रासायनिक Epigenetic संशोधक के साथ सेलुलर मशीनरी को पुनः निर्देशित करके जीन प्रतिलेखन का दमन

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