Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio fornito da Iowa State University e dal National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso (IACUC, 8-16-8333-I) della Iowa State University e istituzionali Animal Care.
1. sintesi del sensore tensione integrativa
<ol><li>Personalizzare e ordinare ssDNAs (Vedi la Tabella materiali). Nota: Le sequenze di ssDNA sono come segue. Il filo superiore è /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. I fili inferiori sono come segue. 12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/ 23 pN ITS: / 5...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

L'ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l'ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell...

Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione1,2, migrazione3,4e sopravvivenza5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione8,9,10 e differenziazione11,12. I ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per misurare e cellulare di integrina-trasmessa mappa forze all'interfaccia cellula-matrice. Questi metodi sono basati su substrato elastico13, matrice di micropost14, o atomico forza microscopia (AFM)15,16. Elastico substrato e micropost metodi si basano sulla deformazione di substrati per segnalare lo stress cellulare e hanno limitazioni in termini di risoluzione spaziale e forzare la sensibilità. AFM ha forza elevata sensibilità, ma non può rilevare la forza in più punti contemporaneamente, rendendo difficile la mappa cellulare forza trasmessa da integrine.
Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate per studiare la forza cellulare a livello molecolare. Un insieme di sensori di tensione molecolare basato su polietilene glicole17,18, ragno seta peptide19e DNA20,21,22,23 sono stati sviluppati per visualizzare e monitorare la tensione trasmessa dalle proteine molecolari. Tra queste tecniche, DNA fu adottato come il materiale di sintesi nella tensione gauge tether (TGT), un linker rupturable che modula il limite superiore delle tensioni delle integrine in cellule vive22,24. Più tardi, tecnica di trasferimento di risonanza di fluorescenza e di DNA sono stati combinati per creare tornante sensori basati sul DNA fluorescente tensione prima gruppo23 di Chen e gruppo20 di Salaita. Il sensore di tensione basati sul DNA tornante segnala integrina tensione in tempo reale e ha applicato con successo per lo studio di una serie di funzioni cellulari21. In seguito, laboratorio di Wang combinato un TGT con la coppia di fluorophore-quencher per tensione di integrin di relazione. Questo sensore è denominato un ITS25,26. L'ITS è basato sul DNA a doppia elica (dsDNA) e ha una gamma dinamica più ampia (pN 10-60) per la calibrazione di tensionamento di integrina. A differenza dei sensori basati sul DNA di tornante, l'ITS non segnala forza cellulare in tempo reale ma registra tutti gli eventi di integrina storico come l'impronta della forza cellulare; Questo processo di accumulazione di segnale migliora la sensibilità per forza cellulare imaging, rendendo così possibile alla forza cellulare immagine anche con un microscopio a fluorescenza di fascia bassa. La sintesi dell'ITS è relativamente più conveniente in quanto è creato da ibridare due DNAs singola elica (ssDNA).
L'ITS è un dsDNA 18-base-accoppiato coniugato con biotina, un fluoroforo e un quencher (buco nero Quencher 2 [BHQ2])27un ciclico arginylglycylaspartic acido (RGD) peptide28 come un ligando di peptide integrina (Figura 1). Il filo inferiore è coniugato con il fluoroforo (Cy3 è usato in questo manoscritto, mentre altri coloranti, come serie di Cy5 o Alexa, inoltre sono stati dimostrati fattibile nel nostro laboratorio) e il tag di biotina, con cui l'ITS è immobilizzato su un substrato di legame biotina-avidina. Il filo superiore è coniugato con il peptide RGD e il Quencher di buco nero, che disseta Cy3 con circa 98% dissetante efficienza26,27. Con il protocollo presentato in questa carta, la densità di rivestimento dell'ITS su un substrato è circa 1.100/µm2. Questa è la densità che abbiamo precedentemente tarati per 18 bp biotinilati dsDNA rivestito sul substrato neutrAvidin-funzionalizzate seguendo lo stesso protocollo29del rivestimento. Quando le cellule aderiscono al substrato rivestito con l'ITS, integrina associa l'ITS attraverso RGD e trasmette tensione per l'ITS. L'ITS ha una tolleranza di tensione specifico (Ttol) che è definita come la soglia di tensione che separa meccanicamente il dsDNA dell'ITS entro 2 s22. SUA rottura da integrina tensione conduce alla separazione del quencher dal colorante che successivamente emette fluorescenza. Di conseguenza, la tensione di integrina invisibile viene convertita in un segnale di fluorescenza e la forza di cellulare possa essere mappata da formazione immagine di fluorescenza.
Per illustrare l'applicazione dell'ITS, utilizziamo pesce del keratocyte qui, un modello ampiamente usato cella per cella migrazione Studio30,31,32, CHO-K1 cellulare, una linea cellulare immobili comunemente utilizzati e dei fibroblasti NIH 3T3. Coimaging delle strutture di tensione e cella di integrina è anche condotto.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell'integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L'ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l'attivazione di ITS è accordabile nell'intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L'ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L'ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l'applicazione dell'ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.

Con l'ITS, la mappa di tensione integrina dei keratocytes di pesce è stata catturata. Dimostra che un keratocyte migra e genera tensione integrina alle due tracce di forza (Figura 2A). La risoluzione della mappa forza è stata calibrata per essere 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensione si concentra sul margine posteriore (Figura 3A). L'ITS Mostra anche diversi modelli specifici di cellule dive...

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Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.

Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Questo sensore di tensione integrativa basato sul DNA, o ITS, che converte il segnale di forza in fluorescenza localmente consente l'imaging diretto della forza cellulare con microscopia a fluorescenza. Its ha un'alta risoluzione spaziale e un'alta sensibilità. La soglia di attivazione è tonnibile, consentendo un'immagine selettiva della tensione dell'integrina a diversi livelli.Dopo aver ricevuto il DNA a singolo filamento personalizzato, o ssDNA, di interesse, per coniugare il peptide RGD al quencher di ssDNA tiolato, aggiungere prima 100 microlitri di EDTA 0,5 molare in 400 microlitri di acqua a circa 450 microlitri di soluzione TCEP appena preparata. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione TCEP-EDTA a 20 microlitri di quencher di DNA tiolo millimolare in PBS per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Per coniugare l'ammina RGD con sulfo-SMCC, aggiungere 40 microlitri di solfato-SMCC da 23 millimolare appena preparato a 100 microlitri di soluzione di ammina RGD da 11 millimolare preparata al momento per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente.Per coniugare l'ammina RGD SMCC con il quencher di ssDNA tiolato, mescolare l'intero volume della soluzione di quencher di ssDNA tiolata con l'intero volume della soluzione SMCC di ammina RGD per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, trasferire la soluzione allo stoccaggio di quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, mescolare il cloruro di sodio trimolare con la soluzione di DNA coniugato al tiolo e meno 20 gradi Celsius, refrigerato, 100% etanolo con un rapporto uno-10-25, e posizionare la reazione a meno 20 gradi Celsius per circa 30 minuti.Quando il DNA è precipitato, raccogliere il DNA per centrifugazione e rimescolare il pellet nel PBS per misurare la concentrazione di DNA su uno spettrometro. Per la sintesi del sensore di tensione integrativo, o ITS, mescolare le soluzioni di DNA a filamento superiore e inferiore a un rapporto 1,1-molare e incubare la reazione durante la notte a quattro gradi Celsius prima di posizionare aliquote della miscela a meno 20 gradi Celsius per lo stoccaggio a lungo termine. Per l'immobilizzazione ITS, rivestire una piastra di Petri con fondo di vetro di 29 millimetri di diametro con 200 microlitri di albumina di siero bovino biotinilata da 0,1 milligrammi per millilitro, o BSA-biotina, per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Quando la BSA-biotina si è fisicamente assorbita sulla superficie del vetro, lavare il piatto tre volte con 200 microlitri di PBS fresco per lavaggio, seguito da incubazione con 200 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di proteina avidina per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS come dimostrato e aggiungere 200 microlitri di ITS 0,1 micromolare per un'altra incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS, lasciando l'ultimo lavaggio nel piatto fino alla placcatura cellulare.Per avviare una coltura di cheratociti di pesce, utilizzare una pinzetta a punta piatta per strappare un pezzo di scala da un pesce e premere delicatamente la bilancia sul pozzo di una piastra di Petri con fondo di vetro non modificato, con il lato interno della bilancia che contatta il vetro. Attendere circa 30 secondi affinché la scala del pesce aderisca alla superficie in vetro del piatto prima di coprire la bilancia con un millimetro di mezzo dulbecco modificato completo di Iscove. Quindi, incubare la bilancia in una scatola scura e umida per sei-48 ore a temperatura ambiente.Per placcare i cheratociti sulla superficie ITS, sostituire il mezzo dal piatto di coltura del cheratocita con una soluzione di staccamento cellulare 1X per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di distacco con un mezzo fresco e completo e dissociare le cellule con una tubazione delicata. Quindi, regolare le cellule alla concentrazione appropriata per la placcatura e seminarle sul piatto rivestito ITS per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging.Per l'imaging della tensione dell'integrina quasi in tempo reale nelle cellule vive, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 40 o 100 volte. Nel software di imaging, impostare il tempo di esposizione su un secondo e l'intervallo di fotogrammi di 20 secondi per ottenere un video delle immagini ITS. Quindi, utilizzare un programma software di analisi delle immagini appropriato per sottrarre un fotogramma precedente del video ITS da un fotogramma corrente per calcolare il segnale ITS appena prodotto nell'ultimo intervallo di fotogrammi.Il segnale ITS di nuova produzione rappresenta la tensione di integrina generata nell'ultimo intervallo di fotogrammi, segnalando così la forza cellulare in modo quasi in tempo reale. Qui, la mappatura della tensione dell'integrina dimostra l'induzione della tensione dell'integrina in due tracce di forza durante la migrazione dei cheratociti. La risoluzione della mappa di forza potrebbe quindi essere calibrata per essere di 0,4 micrometri.L'alta tensione dell'integrina si concentra sul margine posteriore nei cheratociti di pesce motile. Nelle cellule nonmotili si forma uno specifico schema di tensione dell'integrina che è molto diverso da quello osservato nel cheratocita migratore veloce. Le aderenze focali e la tensione dell'integrina dei cheratociti di pesce possono essere co-immagini per valutare la relazione tra tensione dell'integrina e struttura cellulare nelle cellule di interesse.Con l'ITS, la forza di adesione cellulare diventa visibile con una risoluzione e una sensibilità paragonabile all'imaging strutturale cellulare. Questa tecnica apre la strada allo studio di un'interazione forza-struttura nelle cellule.

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