Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
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이 작품은 아이오와 주립 대학 그리고에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 (R35GM128747) 제공 시작 기금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC, 8-16-8333-나) 아이오와 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 통합 긴장 센서의 합성
<ol><li>사용자 지정 하 고 ssDNAs ( 테이블의 자료를 참조)을 주문. 참고: ssDNA 시퀀스는 다음과 같습니다. 위 물가 /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. 낮은 물가 다음과 같습니다. 12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CC...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ITS는 휴대에 대 한 강력한 기술 강제로 합성 및 응용 프로그램 매핑 아직 매우 액세스할 수 있습니다. 모든 재료 준비, 1 일 이내 ITS는 합성 수 있습니다. 실험, 동안 표면 코팅의 3 단계 셀 도금 전에 필요 합니다. 최근, 우리는 더 ITS 소 혈 청 알 부 민, 유리 또는 폴리스 티 렌 표면33ITS의 직접적인 물리적 흡착 수에 직접 연결 하 여 한 단계로 코팅 절차를 단순화. ITS는 셀룰러 구조 ...

셀은 integrins 준수 및 셀룰러 힘 세포 외 기질을 발휘에 의존 합니다. Integrin 중재 하는 세포 접착 및 힘 전송 셀1,2, 마이그레이션3,4및 생존5,,67확산에 대 한 중요 한 있습니다. 긴 기간에 또한 셀 확산8,,910 와 차별화11,12영향 integrin biomechanical 신호. 연구원은 측정 하는 다양 한 방법을 개발 했다 하며 지도 integrin 전송 휴대 세포-매트릭스 인터페이스에서. 이러한 메서드는 탄성 층13, 배열 micropost14또는 원자 힘 현미경 (AFM)15,16. 탄성 층 및 micropost 방법 세포 스트레스를 보고와 공간적 해상도 측면에서 제한이 감도 강제 하는 기판의 변형에 의존 합니다. AFM은 높은 힘 감도, 하지만 그것은 동시에 여러 장소에서 힘을 감지할 수 없습니다, 그리고 integrins 전송한 셀룰러 힘을 지도 하 고 어려운.
최근 몇 년 동안, 여러 기술 분자 수준에서 세포 힘 연구 개발 되었다. 폴 리 에틸렌 글리콜17,18, 거미 실크 펩 티 드19및 DNA20,21,,2223 에 따라 분자 긴장 센서의 컬렉션을 개발 되었다 시각화 하 고 분자 단백질에 의해 전송 하는 긴장을 모니터링 합니다. 이러한 기법 중 DNA 합성 물자는 긴장에 밧줄 (TGT), 변조 라이브 셀22,24integrin 긴장의 상한 rupturable 링커 측정으로 처음 채택 되었다. 나중에, DNA와 형광 공명 전송 기술을 결합 했다 만드는 머리 핀 형광 긴장 DNA 기반 센서 먼저 첸의 그룹23 , Salaita의 그룹20여. 헤어핀 긴장 DNA 기반 센서 integrin 긴장 실시간으로 보고 하 고 세포 기능21의 일련의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 그 후, 왕 실험실 보고서 integrin 긴장 fluorophore 끄는 쌍 한 TGT 결합. 이 센서 는25,26이름은입니다. ITS 이중 가닥 DNA (dsDNA)에 기반 하 고 integrin 긴장 교정에 대 한 광범위 한 동적 범위 (10-60 pN) 있다. 헤어핀 DNA 기반 센서, 달리 ITS 실시간 세포 힘을 보고 하지 않습니다 하지만 셀룰러 힘;의 발자국으로 모든 역사적인 integrin 이벤트 기록 이 신호 축적 과정 영상, 그것을 만드는 가능한 이미지 셀룰러 힘도 저가형 형광 현미경으로 세포 힘에 대 한 감도 향상 시킵니다. ITS의 합성은 두 개의 단일 가닥 DNAs (ssDNA)을 교배 시키기 의해 만들어집니다 더 상대적으로 편리 합니다.
ITS는 18 베이스 결합 dsDNA integrin 펩타이드 리간드 (그림 1)으로 biotin, fluorophore는, 끄는 (블랙 홀을 끄는 2 [BHQ2])27와는 순환 arginylglycylaspartic 산 (RGD) 펩 티 드28 활용 이다. 낮은 물가 fluorophore와 활용 (Cy3 Cy5 또는 알 렉 사 시리즈 다른 염료 동안이 원고에 사용 됩니다, 또한 입증 된 우리의 실험실에서 가능한)는 ITS biotin avidin 본드로 기판에 움직일는 biotin 태그. 위쪽 가닥 RGD 펩타이드와 약 98% 냉각 효율26,27와 Cy3 냉각 블랙홀 끄는 활용 이다. 이 문서에 소개 된 프로토콜, 기판에 ITS의 코팅 밀도 1100 / µ m2주위에 이다. 이것은 우리가 이전 18 혈압 biotinylated dsDNA 같은 프로토콜29코팅에 따라 neutrAvidin 기능성된 기판에 코팅에 대 한 보정 밀도 이다. 셀 ITS 코팅 기판에 준수 때 integrin RGD 통해 ITS 한다 장력 ITS 전송. ITS는 기계적으로 분리 2 s22내 ITS의 dsDNA 긴장 임계값으로 정의 된 특정 긴장 공차 (T톨). Integrin 긴장으로 그것의 파열 리드는 끄는의 분리 이후 형광을 방출 하는 염료에서. 결과적으로, 보이지 않는 integrin 긴장 형광 신호에 변환 되 고 셀룰러 힘 형광 이미징으로 매핑할 수 있습니다.
ITS의 응용 프로그램 입증, 우리 물고기 keratocyte 여기, 셀 마이그레이션 연구30,,3132널리 셀 모델, 조-K1 셀, 일반적으로 사용 되는 nonmotile 셀 라인, 및 NIH 3T3 섬유를 사용 합니다. Integrin 긴장과 셀 구조의 coimaging는 또한 실시 하 고 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Integrin 리간드 결합에 의해 전송 분자 긴장은 많은 세포 기능 및 동작에 중요 한 역할을 재생 integrin 통로에 근본적인 기계 신호입니다. 보정 고 integrin 긴장 높은 힘 감도와 해상도 이미지, 우리는 통합 긴장 센서 (ITS), 형광 긴장 DNA 기반 센서 개발. ITS 힘 분자 수준에서 형광 신호에 따라서 변환 형광 분자 긴장을 유지 하는 경우에 활성화 됩니다. ITS 활성화에 대 한 긴장 임계값은 10-60 pN 잘 셀에서 integrin 긴장의 동적 범위를 커버 하는 범위에서 조정할 수 있습니다. ITS와 융합 하는 기판에 부착 세포의 integrin 긴장 형광에 의해 시각 이며 서브 마이크론 해상도 몇 군데. ITS는 또한 라이브 셀에 고정된 셀 셀 구조 이미징에 호환 됩니다. ITS는 혈소판 수축 및 세포의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. 이 문서는 합성 및 ITS integrin 전송 셀룰러 힘의 연구에의 응용에 대 한 절차를 자세히 설명합니다.

ITS와 물고기 keratocytes integrin 긴장 지도 체포 됐다. 그것은 표시는 keratocyte 마이그레이션합니다 integrin 긴장 두 힘 트랙 (그림 2A)에서 생성 됩니다. 힘 지도의 해상도 0.4 µ m (그림 2B) 되도록 보정 했다. 높은 integrin 긴장 뒤쪽 여백 (그림 3A)에 집중 한다. ITS는 또한 다른 세포의 다른 특정 패턴을 보여 줍니다. ...

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Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin 긴장 다양 한 세포 기능에 중요 한 역할을 담당합니다. 통합 긴장 센서 integrin 긴장은 picoNewton (pN) 감도 보정와 서브 마이크론 해상도 몇 군데.

Integrin 긴장과 셀룰러 힘 통합 긴장 센서와 서브 마이크론 해상도 이미징

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

이 DNA 기반 통합 장력 센서 또는 ITS는 힘 신호를 형광으로 로컬로 변환하여 형광 현미경 검사를 통해 세포력의 직접적인 이미징을 가능하게 합니다. ITS는 높은 공간 해상도와 높은 감도를 가지고 있습니다. 활성화 임계값은 튜닝할 수 있으므로 서로 다른 수준에서 통합 장력의 선택적 이미지를 허용합니다.맞춤형 단일 좌초 DNA 또는 ssDNA를 받은 후 RGD 펩타이드를 티오졸트 ssDNA 대기체에 접합한 후, 먼저 400 마이크로리터에 0.5-마이크로리터의 100마이크로리터를 새로 준비된 TCEP 용액의 약 450 마이크로리터에 추가한다. 그런 다음, 실온에서 30분 배양에 PBS에 1밀리머 티올 DNA 대기기의 20 마이크로리터에 TCEP-EDTA 용액의 10 마이크로리터를 추가합니다. RGD 아민을 sulfo-SMCC로 컨쥬게이트하려면, 신선하게 준비된 23밀리머 설포-SMCC 40마이크로리터를 100마이크로리터에 11밀리머 RGD 아민 용액을 실온에서 20분 간 배양합니다.RGD 아민 SMCC를 thiolated ssDNA 대기열에 결합하려면, 실온에서 1시간 배양에 대한 RGD 아민 SMCC 솔루션의 전체 부피와 티오레이트 ssDNA quencher 용액의 전체 부피를 혼합한다. 인큐베이션이 끝나면 솔루션을 하룻밤 동안 섭씨 4도까지 전송합니다. 다음 날 아침, 3마리의 어금니 나트륨을 티올 컨쥬게이드 DNA 용액과 영하 20도, 100%에탄올을 1대 10대 25비율로 혼합하고, 약 30분간 영하 20도의 반응을 나타낸다.DNA가 침전되면 원심분리에 의해 DNA를 수집하고 분광계에서 DNA 농도를 측정하기 위해 PBS의 펠릿을 다시 중단합니다. 통합 장력 센서 또는 ITS, 합성의 경우 상부 및 하부 가닥 DNA 용액을 1.1 대 1-1-대구 비율로 혼합하고, 장기간 보관을 위해 혼합물의 알리쿼트를 영하 20도에서 넣기 전에 4°C에서 밤새 반응을 배양한다. ITS 고정을 위해 직경 29mm의 유리 바닥 페트리 접시에 밀리리터 당 0.1밀리그램의 200 마이크로리터를 코팅하여 밀리리터 당 0.1밀리그램의 바이오틴 소 살부 또는 BSA-비오틴을 섭씨 4도에서 30분간 코팅합니다.BSA-비오틴이 유리 표면에 물리적으로 흡착되면 세척당 200 마이크로리터의 신선한 PBS로 3회 세척한 다음 아비딘 단백질의 밀리리터 당 50마이크로그램의 200 마이크로리터를 4도에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 접시를 세 번 씻고, 섭씨 4도에서 또 다른 30분 동안 0.1 마이크로몰라 ITS 200 마이크로리터를 첨가합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS로 세 번 접시를 씻고 마지막 세척을 세포 도금까지 접시에 남깁니다.물고기 각질 각질 문화를 시작하려면 평평한 트위저를 사용하여 물고기에서 스케일조각을 뽑아내고, 스케일을 수정되지 않은 유리 바닥 페트리 접시의 우물에 부드럽게 누르고, 스케일의 안쪽면이 유리에 닿습니다. 물고기 스케일이 접시의 유리 표면에 부착될 때까지 약 30초 동안 기다렸다가 이스코브의 수정된 덜벡코 의 매체를 1밀리미터로 가리고 있었다. 그런 다음 실온에서 6~48시간 동안 어둡고 습한 상자에 스케일을 배양합니다.각질 세포를 ITS 표면에 플레이트하려면 각질 세포 배양 접시에서 매질을 실온에서 3분 동안 잠식할 수 있도록 1X 세포 분리 용액으로 교체하십시오. 인큐베이션이 끝나면 분리 용액을 신선한 완전한 매체로 교체하고 세포를 부드러운 파이펫팅으로 분리합니다. 그런 다음, 도금에 적합한 농도로 세포를 조정하고, 이미징 전에 실온에서 30 분 동안 ITS 코팅 접시에 씨앗을 드시면.살아있는 세포에서 준-실시간 통합 장력 화상 진찰을 위해, 형광 현미경의 단계로 세포를 전송하고, 40 또는 100 배 목표를 선택합니다. 이미징 소프트웨어에서 노출 시간을 1초로 설정하고 프레임 간격을 20초로 설정하여 ITS 이미지의 비디오를 가져옵니다. 그런 다음 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 현재 프레임에서 ITS 비디오의 이전 프레임을 빼서 최신 프레임 간격으로 새로 생성된 ITS 신호를 계산합니다.새로 생성된 ITS 신호는 최신 프레임 간격에서 생성된 인테그린 장력을 나타내므로 셀룰러 력을 준 실시간 방식으로 보고한다. 여기서, 통합장력 매핑은 각질 세포 이동 중 두 개의 힘 트랙에서 인테그린 장력의 유도를 보여줍니다. 그런 다음 힘 맵의 해상도를 0.4 마이크로미터로 보정할 수 있습니다.높은 통합장력은 운동성 생선 각질세포의 후면 여백에 집중됩니다. 비운동성 세포에서, 빠른 마이그레이션 각질세포에서 관찰된 것과 는 매우 다른 특정 통합장력 패턴이 형성된다. 초점 접착력과 물고기 각질 세포의 통합 장력은 관심 있는 세포에서 인테그린 장력과 세포 구조 사이의 관계를 평가하기 위해 공동 적으로 이미지될 수 있다.ITS를 사용하면 세포 접착력은 세포 구조 이미징에 필적하는 해상도와 감도로 볼 수 있게 됩니다. 이 기술은 세포에서 힘 구조 상호 작용의 연구를위한 길을 포장합니다.

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High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

레이저 유도 축삭 병변 동안 긴장 릴리스의 측정 Piconewton 및 밀리 초 단위의 해상도로 기판에 축삭 접착을 평가하는

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...