Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av oppstart fondet ved Iowa State University og ved National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC, 8-16-8333-I) ved Iowa State University.
1. syntese av integrerende spenning sensoren
<ol><li>Tilpasse og bestille ssDNAs (se Tabell for materiale). Merk: SsDNA sekvensene er som følger. Den øvre stranden er /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Lavere tråder er som følger: 12 pN ITS: 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/ 23 pN ITS: 5Cy3/GGC CCG CTG CGT C...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ITS er en svært tilgjengelig ennå kraftfull teknikk for mobilnettet tvinge kartlegging både syntese og program. Med alle materialer klar, kan ITS syntetiseres innen 1 dag. Under eksperimenter, er bare tre trinn av overflate belegg nødvendig før cellen plating. Nylig forenklet vi ytterligere belegg prosedyren til ett trinn ved å koble direkte ITS til storfe serum albumin, som muliggjør direkte fysisk adsorpsjon av ITS glass eller polystyren overflater33. ITS bringer fluorescerende intensitet...

Celler er avhengige av integrins å følge og utøve mobilnettet styrker til ekstracellulær matrix. Integrin-mediert celle vedheft og kraft overføring er avgjørende for celle spredning1,2, overføring3,4og overlevelse5,6,7. På lang sikt påvirker integrin biomekaniske signalering også celle spredning8,9,10 og differensiering11,12. Forskere har utviklet ulike metoder for å måle og kart integrin overførte mobilnettet styrker på cellen matrise grensesnittet. Disse metodene er basert på elastiske undergrunnen13, matrise av micropost14, eller atomic force mikroskopi (AFM)15,16. Elastisk undergrunnen og micropost metoder stole på deformasjon av underlag å rapportere mobilnettet stress og har begrensninger i romlig oppløsning og tvinge følsomhet. AFM har høy kraft følsomhet, men det kan ikke oppdage styrken på flere steder samtidig, gjør det vanskelig å tilordne mobilnettet makt overføres av integrins.
De siste årene, ble flere teknikker utviklet for å studere mobilnettet kraft på molekylært nivå. En samling av molekylære spenning sensor basert på polyetylenglykol17,18, edderkopp silke peptid19og DNA20,21,22,23 ble utviklet for å visualisere og overvåke spenningen av molekylære proteiner. Blant disse teknikkene, ble DNA først vedtatt som syntese materialet i spenningen måle tjore (TGT), et rupturable linker som modulerer øvre grense for integrin spenninger i lever celler22,24. Senere, DNA og fluorescens resonans overføring teknikk var kombinert for å skape hårnål DNA-baserte fluorescerende spenning sensorer først Chens gruppe23 og Salaita's group20. Hårnål DNA-baserte spenning sensoren rapporter integrin spenning i sanntid og har vært anvendt til studiet av en rekke cellulære funksjoner21. Etterpå kombinert Wangs lab en TGT med fluorophore-avsluttes paret å rapporten integrin spenning. Denne sensoren kalles en ITS25,26. ITS er basert på double-strandet DNA (dsDNA) og har et bredere dynamisk område (10-60 pN) for integrin spenning kalibrering. I motsetning til hårnål DNA-baserte sensorer, ITS rapporterer ikke mobilnettet kraft i sanntid, men registrerer alle historiske integrin hendelser som fotavtrykk av mobilnettet force; Dette signalet opphopning prosessen forbedrer sensitiviteten for mobilnettet styrke tenkelig, gjør det mulig å bilde mobilnettet force selv med en low-end fluorescens mikroskop. Syntese av ITS er relativt mer praktisk da det er skapt av hybridizing to single-strandet DNAs (ssDNA).
ITS er en 18-base-sammen dsDNA konjugert med biotin, en fluorophore, en avsluttes (svart hull avsluttes 2 [BHQ2])27og en syklisk arginylglycylaspartic syre (RGD) peptid28 som en integrin peptid ligand (figur 1). Den lavere stranden er konjugert med fluorophore (Cy3 brukes i dette manuskriptet, mens andre fargestoffer, som Cy5 eller Alexa serien, har også vært påvist mulig i vår lab) og biotin koden, som ITS er blokkert på et substrat av biotin-avidin bånd. Den øvre stranden er konjugert med RGD peptid og svart hull avsluttes, som slukker Cy3 med ca 98% slukke effektivitet26,27. Med protokollen presentert i dette papiret, er belegg tettheten av ITS på et substrat rundt 1100/µm2. Dette er tettheten vi tidligere kalibrert for 18 bp biotinylated dsDNA belagt på neutrAvidin-functionalized underlaget ved å følge samme belegg protokollen29. Når celler overholder underlaget belagt med ITS, integrin binder ITS gjennom RGD og overfører spenning til ITS. ITS har en bestemt spenning toleranse (Ttol) som er definert som spenningen terskelen som mekanisk skiller dsDNA av ITS innen 2 s22. DENS ruptur av integrin spenning fører til separasjon av avsluttes fra fargestoff som senere avgir fluorescens. Som et resultat, usynlig integrin spenningen konverteres til et fluorescens signal og mobilnettet styrken kan tilordnes av fluorescens tenkelig.
For å demonstrere anvendelsen av ITS, bruker vi fisk keratocyte her, brukte celle modell for celle migrasjon studie30,31,32, CHO-K1 celle, brukte nonmotile celle linje og NIH 3T3 fibroblast. Coimaging av integrin spenning og celle strukturer er også gjennomført.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Molekylær spenningen av integrin-ligand obligasjoner er grunnleggende mekanisk signalet i integrin veien som spiller viktige roller i mange celle-funksjoner og atferd. Hvis du vil kalibrere og image integrin spenning med høy kraft følsomhet og romlig oppløsning, utviklet vi en integrerende spenning sensor (ITS), en DNA-baserte fluorescerende spenning sensor. ITS er aktivert for å fluoresce Hvis opprettholde en molekylær spenning, således omdanner force fluorescerende signalet på molekylært nivå. Spenning terskelen for dens aktivisering er tunable mellom 10 til 60 pN som også dekker dynamikkområdet integrin spenning i celler. På et substrat podet med en ITS er integrin spenningen av tilhenger celler visualisert ved fluorescens og fotografert submicron oppløsning. ITS er også kompatibel med cellen strukturelle imaging i både live cellene og fast. ITS har vært anvendt til studiet av blodplater sammentrekning og celle migrasjon. Dette papiret detaljer prosedyren for syntese og anvendelse av ITS i studiet av integrin overførte mobilnettet kraft.

Med ITS, ble integrin spenning kart over fisk keratocytes fanget. Det viser at en keratocyte overfører og genererer integrin spenning på to force spor (figur 2A). Oppløsningen av force kartet ble kalibrert skal 0,4 µm (figur 2B). Høy integrin spenning konsentrerer til bakre marg (figur 3A). ITS viser også ulike spesifikke mønstre av andre celler. En nonmotile celle, NIH-3T3, danner et bestemt ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin spenning spiller viktige roller i ulike celle-funksjoner. En integrerende spenning, sensoren er integrin spenning kalibrert med picoNewton (pN) følsomhet og fotografert submicron oppløsning.

Imaging Integrin spenning og mobilnettet Force Submicron oppløsning med en integrerende spenning Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Denne DNA-baserte integrative spenningssensoren, eller ITS, konvertere kraftsignal til fluorescens lokalt muliggjør direkte avbildning av cellulær kraft med fluorescensmikroskopi. ITS har en høy romlig oppløsning og høy følsomhet. Aktiveringsterskelen er justerbar, slik at selektivt bilde av integrinsk spenning på forskjellige nivåer.Etter å ha mottatt det tilpassede entrådet DNA, eller ssDNA, av interesse, for å konjugere RGD peptid til thiolated ssDNA quencher, legger du først til 100 mikroliter med 0,5-molar EDTA i 400 mikroliter vann til ca 450 mikroliter nylaget TCEP-løsning. Deretter legger du til 10 mikroliter av TCEP-EDTA-løsningen til 20 mikroliter av en millimolar tiol DNA-quencher i PBS for en 30-minutters inkubasjon ved romtemperatur. For å konjugere RGD-amin med sulfo-SMCC, tilsett 40 mikroliter nylaget 23-millimolar sulfo-SMCC til 100 mikroliter nyoppfattede 11-millimolar RGD-aminløsning for en 20-minutters inkubasjon ved romtemperatur.For å konjugere RGD-amin SMCC med den thiolated ssDNA quencheren, bland hele volumet av den thiolated ssDNA quencher-løsningen med hele volumet av RGD-amin SMCC-løsningen for en times inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, overfør løsningen til fire graders Celsius lagring over natten. Neste morgen blander du tre-molarnatriumklorid med den tiolkonjugerte DNA-løsningen og minus 20-graders Celsius, kjølt, 100% etanol ved et 1-til-10-til-25-forhold, og plasser reaksjonen på minus 20 grader Celsius i ca 30 minutter.Når DNA har fremskyndet, samle DNA ved sentrifugering, og gjenbruke pellet i PBS for måling av DNA-konsentrasjonen på et spektrometer. For integrativ spenningssensor, eller ITS, syntese, bland de øvre og nedre tråd DNA-løsningene med et 1,1-til-en-molarforhold, og inkuber reaksjonen over natten ved fire grader Celsius før du plasserer aliquots av blandingen på minus 20 grader Celsius for langsiktig lagring. For IMmobilisering, belegge en 29-millimeter-diameter, glass-bunn Petri parabolen med 200 mikroliter på 0,1-milligram per milliliter biotinyler biotinylerer serum albumin, eller BSA-biotin, i 30 minutter ved fire grader Celsius.Når BSA-biotin har fysisk adsorbert på glassoverflaten, vask parabolen tre ganger med 200 mikroliter frisk PBS per vask, etterfulgt av inkubasjon med 200 mikroliter på 50 mikrogram per milliliter av ivrig protein i 30 minutter ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask parabolen tre ganger med PBS som demonstrert, og legg til 200 mikroliter på 0,1 mikromos ITS for ytterligere 30-minutters inkubasjon ved fire grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask parabolen tre ganger med PBS, og la den siste vasken i parabolen til cellen plating.For å starte en fiske keratocyttkultur, bruk en flat-tipped pinsett for å plukke et stykke skala fra en fisk, og trykk forsiktig skalaen på brønnen til en umodifisert glassbunn Petriskål, med innsiden av skalaen som kontakter glasset. Vent i ca 30 sekunder for at fiskeskalaen holder seg til parabolens glassoverflate før du dekker skalaen med en millimeter komplett Iscove's Modified Dulbecco's Medium. Deretter inkubere skalaen i en mørk og fuktig boks i seks til 48 timer ved romtemperatur.For å plate keratocytter på DENS overflaten, erstatt mediet fra keratocytt kulturfatet med 1X celle løsne løsning for en tre minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen erstatter du løsrivelsesløsningen med friskt komplett medium, og dissosier cellene med mild pipettering. Deretter justerer du cellene til riktig konsentrasjon for plating, og frø dem på ITS-belagt parabolen i 30 minutter ved romtemperatur før avbildning.For kvasi-real-time integrin spenning avbildning i levende celler, overføre cellene til scenen av en fluorescens mikroskop, og velg 40 eller 100 ganger målet. I bildeprogramvaren angir du eksponeringstiden til ett sekund og rammeintervallet på 20 sekunder for å få en video av ITS-bildene. Deretter bruker du et passende bildeanalyseprogram til å trekke en tidligere ramme av ITS-videoen fra en gjeldende ramme for å beregne ITS-signalet som nylig ble produsert i det nyeste rammeintervallet.Det nyproduserte ITS-signalet representerer den integrinske spenningen som genereres i det siste rammeintervallet, og rapporterer dermed mobilkraften på kvasi-sanntidsmåte. Her demonstrerer integrinsk spenningskartlegging induksjon av integrinsk spenning på to kraftspor under keratocyttmigrasjon. Oppløsningen på kraftkartet kan deretter kalibreres til å være 0,4 mikrometer.Høy integrin spenning konsentrater på bakre margin i motile fisk keratocytter. I ikke-motile celler dannes et bestemt integrinsk spenningsmønster som er ganske forskjellig fra det som observeres i den raske migrerende keratocytten. Fokale adhesjoner og den integrinske spenningen av fisk keratocytter kan være co-imaged for å evaluere forholdet mellom integrin spenning og cellestruktur i celler av interesse.Med ITS blir cellevedheftskraft synlig med en oppløsning og en følsomhet som kan sammenlignes med cellestrukturell bildebehandling. Denne teknikken baner veien for studiet av et kraftstruktur-samspill i celler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Måling av spenningen slipper Under Laser Induced Axon Lesion å evaluere aksonal feste til overflaten på Piconewton og Millisekund Oppløsning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Den Innkapsling av Cell-free transkripsjon og oversettelse Machinery i Blemmer for bygging av Cellular Etterligner

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Høyoppløselig Spatiotemporal Analyse av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescens mikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging and Force spektroskopi av Supported lipidbilag

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Innledende vurdering av antistoff-conjugates endret med Viral-avledet peptider for øke mobilnettet akkumulering og forbedre svulst målretting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...