Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo fundo de inicialização fornecido pela Iowa State University e pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências (R35GM128747).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC, 8-16-8333-eu) de Iowa State University e institucional Cuidado Animal.
1. síntese do sensor de tensão Integrativa
<ol><li>Personalizar e ordem ssDNAs (consulte a Tabela de materiais). Nota: As sequências ssDNA são como segue. A vertente superior é /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. As vertentes mais baixas são os seguintes. pN 12 ITS: / 5Cy3//3Bio/ GGC CCG CTG CGT CCT CCC p...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

O SIB é um altamente acessível ainda poderosa técnica para celular mapeamento em termos de síntese e a aplicação de força. Com todos os materiais prontos, o ITS podem ser sintetizados dentro de 1 dia. Durante as experiências, apenas três passos do revestimento de superfície são necessários antes de chapeamento de célula. Recentemente, simplificou ainda mais o procedimento de revestimento de um passo vinculando diretamente o ITS a albumina de soro bovino, que permite a adsorção física direta do SIB para vi...

Células dependem de integrinas de aderir e exercer forças celulares de matriz extracelular. Transmissão de força e adesão celular mediada por integrina são cruciais para a célula espalhando1,2, migração3,4e sobrevivência5,6,7. A longo prazo, integrina biomecânico sinalização também influi na célula proliferação8,9,10 e diferenciação11,12. Pesquisadores desenvolveram vários métodos para medir e celular de integrina transmissíveis mapa forças na interface célula-matriz. Estes métodos baseiam-se em substrato elástico13, matriz de micropost14, ou atômica força microscopia (AFM)15,16. Elástica substrato e micropost métodos dependem da deformação de substratos para relatar o estresse celular e têm limitações em termos de resolução espacial e forçar a sensibilidade. AFM tem força alta sensibilidade, mas que não consigo detectar a força em vários pontos simultaneamente, dificultando a mapear celular força transmitida por integrinas.
Nos últimos anos, várias técnicas foram desenvolvidas para estudar a força celular a nível molecular. Uma coleção de sensores de tensão molecular baseado em polietileno glicol17,18, aranha de seda peptídeo19e DNA20,21,22,23 foram desenvolvidos para Visualizar e monitorar a tensão transmitida por proteínas moleculares. Entre essas técnicas, o DNA foi adotado inicialmente como o material de síntese na tensão calibre baraço (TGT), um rupturable vinculador que modula o limite superior da integrina tensões em células vivas22,24. Mais tarde, técnica de transferência de ressonância de DNA e fluorescência foram combinados para criar prendendor sensores de tensão fluorescente baseado em DNA primeiro por grupo23 de Chen e grupo20 do Salaita. O sensor de tensão baseado em DNA prendendor relata integrina tensão em tempo real e tem sido aplicado com sucesso para o estudo de uma série de funções celulares21. Depois, o laboratório de Wang combinado um TGT com o par de fluoróforo-quencher para tensão de integrina relatório. Este sensor é chamado um ITS25,26. O SIB é baseado em DNA de cadeia dupla (dsDNA) e tem um alcance dinâmico mais amplo (pN 10-60) para a calibração de tensão integrina. Em contraste com o gancho de cabelo DNA baseado em sensores, o SIB não relata força celular em tempo real mas registra todos os eventos de integrina histórico como a pegada da força celular; Este processo de acumulação de sinal melhora a sensibilidade para celular força de imagem, tornando-o viável para celular força de imagem mesmo com um microscópio de fluorescência low-end. A síntese de ITS é relativamente mais conveniente, pois ele é criado pelo cruzamento de dois single-stranded DNA (ssDNA).
O ITS é uma 18-base-emparelhado dsDNA conjugado com biotina, um fluoróforo, um quencher (buraco negro Quencher 2 [BHQ2])27e um ácido (RGD) cíclico arginylglycylaspartic peptídeo28 como um ligante de peptídeo de integrina (Figura 1). O fio inferior é conjugado com o fluoróforo (Cy3 é usado neste manuscrito, enquanto outros corantes, tal como a série Cy5 ou Alexa, também têm sido comprovada viável em nosso laboratório) e a tag de biotina, com o qual o SIB é imobilizado em um substrato por ligação biotina-avidina. A vertente superior é conjugada com o peptídeo RGD e o buraco negro Quencher, que sacia Cy3 com aproximadamente 98% têmpera eficiência26,27. Com o protocolo apresentado neste trabalho, a densidade de revestimento do SIB em um substrato é em torno de 1.100/µm2. Esta é a densidade de que nós previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA revestido no substrato neutrAvidin-acrescida, seguindo o mesmo protocolo29de revestimento. Quando as células aderem ao substrato revestido com o SIB, integrina vincula o SIB através de RGD e transmite a tensão para o SIB. O ITS tem uma tolerância de tensão específica (Ttol) que é definida como o limiar de tensão que separa mecanicamente o dsDNA do SIB dentro 2 s22. SUA ruptura por tensão integrina leva à separação do quencher da tintura que posteriormente emite fluorescência. Como resultado, a tensão de integrina invisível é convertida para um sinal de fluorescência e a força de celular pode ser mapeada por imagens de fluorescência.
Para demonstrar a aplicação do SIB, usamos keratocyte peixe aqui, um modelo de célula amplamente utilizada para a migração celular estudo30,31,de32, células CHO-K1, uma linhagem celular de imóveis usados e fibroblastos de NIH 3T3. Coimaging de estruturas de tensão e célula de integrina também é conduzida.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Tensão molecular transmitido pelos títulos de integrina-ligante é o sinal mecânico fundamental na via da integrina que tem um papel significativo em muitas funções celulares e comportamentos. Para calibrar e imagem integrina tensão com força alta sensibilidade e resolução espacial, desenvolvemos um sensor de tensão Integrativa (ITS), um sensor de tensão fluorescente baseado em DNA. O SIB é ativado para fluorescência se sustentar uma tensão molecular, convertendo assim força de sinal fluorescente a nível molecular. O limite de tensão para sua ativação é ajustável na faixa de 10 a 60 pN que cobre bem a gama dinâmica de integrina tensão nas células. Sobre um substrato enxertado com um ITS, a integrina tensão das células aderentes é visualizada por fluorescência e fotografada em resolução de submicron. O SIB é também compatível com imagem estrutural de célula em células vivas e células fixas. O SIB foi aplicado com êxito para o estudo da contração das plaquetas e a migração celular. Este documento detalha o procedimento para a síntese e a aplicação do SIB no estudo da força celular integrina-transmitidos.

Com o seu, o mapa de tensão integrina de keratocytes de peixe foi capturado. Isso mostra que um keratocyte migra e gera tensão integrina em duas faixas de força (Figura 2A). A resolução do mapa força foi calibrada para ser 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensão se concentra na margem posterior (Figura 3A). O SIB também mostra diferentes padrões específicos de células diferentes. Uma c?...

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Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Tensão de integrina tem um papel importante em várias funções da célula. Com um sensor de tensão Integrativa, integrina tensão é calibrado com sensibilidade de picoNewton (pN) e cuja imagem em resolução de submicron.

Imagem latente integrina tensão e força celular com resolução de Submicron com um Sensor de tensão Integrativa

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Este sensor de tensão integrativa baseado em DNA, ou ITS, convertendo sinal de força em fluorescência localmente permite a imagem direta da força celular com microscopia de fluorescência. Its tem uma alta resolução espacial e uma alta sensibilidade. O limiar de ativação é incapaz, permitindo imagem seletiva de tensão integrin em diferentes níveis.Depois de receber o DNA de um único fio personalizado, ou SSDNA, de interesse, para conjugar peptídeo RGD ao ssDNA quencher thiolado, adicione primeiro 100 microliters de 0,5-molar EDTA em 400 microliters de água para cerca de 450 microliters de solução DEP recém-preparada. Em seguida, adicione 10 microliters da solução TCEP-EDTA a 20 microliters de um mililitro de DNA thiol de um mililitro em PBS para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. Para conjugar amina RGD com sulfo-SMCC, adicione 40 microliters de sulfo-SMCC recém-preparado de 23 milimolares a 100 microliters de uma solução de amina RGD de 11 mililitros recém-preparada para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente.Para conjugar o RGD amine SMCC com o ssDNA quencher thiolado, misture todo o volume da solução ssDNA quencher com todo o volume da solução RGD amine SMCC para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. No final da incubação, transfira a solução para o armazenamento Celsius de quatro graus durante a noite. Na manhã seguinte, misture o cloreto de sódio de três molares com a solução de DNA conjugada com tiol e menos 20 graus Celsius, refrigerado, 100% etanol em uma proporção de 1 a 10 a 25, e coloque a reação a menos 20 graus Celsius por cerca de 30 minutos.Quando o DNA tiver precipitado, colete o DNA por centrifugação, e resuspenque a pelota na PBS para medir a concentração de DNA em um espectrômetro. Para o sensor de tensão integrativa, ou ITS, síntese, misture as soluções de DNA do fio superior e inferior a uma relação de 1,1 para um molar, e incubar a reação durante a noite a quatro graus Celsius antes de colocar alíquotas da mistura a menos 20 graus Celsius para armazenamento a longo prazo. Para a imobilização its, cubra uma placa de Petri de 29 milímetros de diâmetro, com 200 microliters de 0,1 miligrama por mililitro biotinilado, ou BSA-biotina, por 30 minutos a quatro graus Celsius.Quando a BSA-biotina tiver adsorvida fisicamente na superfície do vidro, lave o prato três vezes com 200 microliters de PBS fresco por lavagem, seguido de incubação com 200 microliters de 50 microgramas por mililitro de proteína avidina por 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave o prato três vezes com PBS como demonstrado, e adicione 200 microliters de 0,1 micromolar ITS para outra incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave o prato três vezes com PBS, deixando a última lavagem no prato até a cela emplacando.Para iniciar uma cultura de ceratocito de peixe, use uma pinça de ponta plana para arrancar um pedaço de escala de um peixe, e pressione suavemente a balança para o poço de uma placa petri de fundo de vidro não modificada, com o lado interno da balança entrando em contato com o vidro. Aguarde cerca de 30 segundos para que a balança de peixe adera à superfície de vidro do prato antes de cobrir a balança com um milímetro de Meio Modificado de Dulbecco de Iscove completo. Em seguida, incubar a balança em uma caixa escura e úmida por seis a 48 horas em temperatura ambiente.Para emplacar os ceratocitos na superfície ITS, substitua o meio do prato de cultura de ceratocitos por uma solução de desapego de células 1X para uma incubação de três minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, substitua a solução de desapego por meio completo fresco e dissocia as células com tubulação suave. Em seguida, ajuste as células à concentração apropriada para chapeamento e semee-as no prato revestido de ITS por 30 minutos à temperatura ambiente antes da imagem.Para imagens de tensão integrin quase em tempo real em células vivas, transfira as células para o estágio de um microscópio de fluorescência e selecione o objetivo de 40 ou 100 vezes. No software de imagem, defina o tempo de exposição para um segundo e o intervalo de quadros de 20 segundos para obter um vídeo das imagens ITS. Em seguida, use um programa de software de análise de imagem apropriado para subtrair um quadro anterior do vídeo ITS de um quadro atual para calcular o sinal ITS recém-produzido no intervalo de quadro mais recente.O sinal ITS recém-produzido representa a tensão integrin gerada no último intervalo de quadros, relatando assim a força celular de forma quase em tempo real. Aqui, o mapeamento da tensão integrin demonstra a indução da tensão integrin em duas faixas de força durante a migração de ceratocitos. A resolução do mapa de força poderia então ser calibrada para 0,4 micrômetros.A alta tensão integrin concentra-se na margem traseira em ceratocitos de peixe motile. Em células não-ltil, forma-se um padrão específico de tensão integrin bastante diferente do observado no ceratocito migratório rápido. Aderências focais e a tensão integrin de ceratocitos de peixe podem ser co-imagens para avaliar a relação entre tensão integrin e estrutura celular em células de interesse.Com o ITS, a força de adesão celular torna-se visível com uma resolução e uma sensibilidade comparável à imagem estrutural celular. Essa técnica abre caminho para o estudo de uma interação de estrutura de força nas células.

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