Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фондом запуска, Университет штата Айова и от национального института Генеральной медицинских наук (R35GM128747).

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC, 8-16-8333-я) из университета штата Айова.
1. синтез интегративной напряжение датчика
<ol><li>Настройка и заказать ssDNAs (см. Таблицу материалов). Примечание: SsDNA послед...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ЕЕ является весьма доступным, но мощный метод для сотовых силу сопоставление с точки зрения синтез и применение. Со всеми материалами готова ее может быть синтезирован в течение 1 дня. Во время экспериментов необходимы только три шага поверхности покрытия до ячейки покрытия. Недавно мы ...

Клетки полагаются на интегринов присоединиться и оказывают сотовой силы внеклеточного матрикса. При посредничестве Интегрин клеток адгезии и силы передачи имеют решающее значение для ячейки, распространение1,2,3,миграции4и выживания5,6,7. В долгосрочной перспективе Интегрин биомеханических сигнализации также влияет на клетки распространения8,9,10 и дифференциации11,12. Исследователи разработали различные методы для измерения и карта Интегрин передаются сотовый сил в интерфейсе ячейки матрицы. Эти методы основаны на упругие субстрат13, массив micropost14, или атомных сил микроскопии (АСМ)15,16. Эластичные субстрат и micropost методы полагаются на деформации субстратов сообщать клеточного стресса и имеют ограничения с точки зрения пространственного разрешения и заставить чувствительность. AFM имеет чувствительность высокой силы, но он не может обнаружить силы в нескольких местах одновременно, что затрудняет карта сотовой силы передано интегринов.
В последние годы были разработаны несколько методик для изучения клеточных силы на молекулярном уровне. Коллекция молекулярных напряжение датчиков на основе полиэтиленгликоля17,18, паук Шелковый пептид19и ДНК-20,-21,-22,-23 были разработаны для визуализации и мониторинга напряжения, передано низкомолекулярных белков. Среди этих методов ДНК был впервые принят как синтез материала в напряжение датчика троса (TGT), rupturable компоновщик, который модулирует верхний предел Интегрин напряженности в живые клетки22,24. Позже ДНК и флуоресценции техника передачи резонанса были объединены для создания шпильки на основе ДНК флуоресцентные напряжение датчиков сначала Чэня группы23 и Salaita в группы20. Шпилька напряженности на основе ДНК датчик сообщает Интегрин напряженность в режиме реального времени и успешно применяется для изучения ряда клеточных функций21. Потом Ван лаборатории комбинированный TGT с парой Флюорофор утоления доклад Интегрин напряженность. Этот датчик с именем его25,26. Основан на двойной спирали ДНК (dsDNA) и имеет более широкий динамический диапазон (pN 10-60) для калибровки Интегрин напряженности. В отличие от шпильки на основе ДНК датчики ее не сообщают сотовой силы в режиме реального времени, но записывает все события исторического Интегрин как след клеточных сил; Этот процесс накопления сигнала улучшает чувствительность для сотовых силу визуализации, что делает его возможным сотовой силам изображения даже с low-end флуоресцентным микроскопом. Синтез его относительно более удобным, как она создается гибридизировать двух одноцепочечной ДНК (ssDNA).
ЕЕ это 18-base паре dsDNA, конъюгированных с биотин, Флюорофор, утоления (черная дыра утоления 2 [BHQ2])27и циклических Аргинилглициласпарагиновая кислота (РГД) пептида28 как Интегрин пептидных лигандов (рис. 1). Нижняя нить проспряганное с Флюорофор (Cy3 используется в этой рукописи, в то время как другие красители, например Cy5 или Alexa серии, также оказались в нашей лаборатории) и биотин тега, с которым ее это иммобилизованные на подложке биотин авидин Бонд. Верхние пряди проспряганное с пептидной РСЗ и утоления черная дыра, которая утоляет Cy3 с приблизительно 98% тушения эффективности26,27. С протоколом, представленных в настоящем документе плотность покрытия ее на подложке составляет около 1100/мкм2. Это плотность, которую мы ранее калиброванные для 18 bp биотинилированным dsDNA покрытием на подложке neutrAvidin функционализированных следуя то же покрытие протокол29. Когда клетки присоединиться к подложке, с покрытием с ее, Интегрин привязывает ее через РСЗ и передает напряженность для ее. ЕЕ имеет конкретные напряженности терпимости (ТолT), который определяется как порог напряжения, который механически отделяет dsDNA ее в течение 2 s22. ЕГО разрыв Интегрин напряженности приводит к разделение утоления от красителя, который впоследствии испускает флуоресценции. В результате невидимый Интегрин напряжения преобразуется в сигнал флуоресценции и клеточных силы могут быть сопоставлены с флуоресцентным изображений.
Чтобы продемонстрировать применение ее, мы используем рыбы Кератоцит здесь, широко используемых ячеечная модель для клеток миграции исследование30,,3132, Чо-K1 ячеек, часто используемых аэробны клеточной линии и низ 3T3 фибробластов. Также проводится coimaging Интегрин напряженности и клеток структур.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Молекулярные напряженности, переданные Интегрин лиганд облигаций — основных механических сигнал в Интегрин путь, который играет важную роль во многих функций клеток и поведения. Для калибровки и изображения Интегрин напряженности с высокой силой чувствительность и пространственным разрешением, мы разработали интегративной напряжение датчик (СТС), на основе ДНК флуоресцентные напряженности. ЕЕ активируется для флуоресцировать если поддержания молекулярной напряжение, таким образом преобразование силы в флуоресцентного сигнала на молекулярном уровне. Порог напряжения для ее активации перестраиваемой в диапазоне pN 10-60, который также охватывает весь динамический диапазон Интегрин напряженности в клетках. На подложке, привитый с СТС Интегрин напряженности адэрентных клеток визуализированное флуоресценции и отражаться на субмикронном резолюции. ЕЕ также совместим с структурных изображений клеток в живых клеток и фиксированные клетки. ЕЕ успешно применяется для изучения миграции клеток и тромбоцитов сужением. Этот документ подробно описывает процедуры для синтеза и применения ее в исследовании Интегрин передаются сотовый силы.

С ее был захвачен Интегрин напряженности карта рыбы кератиноцитах. Он показывает, что Кератоцит переносит и генерирует Интегрин напряжение на две силы треков (рисунок 2A). Разрешение карты силы был калиброванные быть 0,4 мкм (рис. 2B). Интег?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Интегрин напряженности играет важную роль в различных функций клеток. С датчиком интегративной напряженности Интегрин напряженности калибруется с чувствительностью picoNewton (pN) и образы на субмикронном резолюции.

Интегрин напряженности и клеточных силы на субмикронном резолюции с датчиком интегративной напряженности

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Этот интегративный датчик напряжения на основе ДНК, или ITS, преобразовывающий силовой сигнал в флуоресценцию локально, обеспечивает прямую визуализацию клеточной силы с помощью микроскопии флуоресценции. ITS имеет высокое пространственное разрешение и высокую чувствительность. Порог активации настраивается, что позволяет выборочное изображение напряжения интегрина на разных уровнях.После получения индивидуальной одноцепочечей ДНК, или ssDNA, представляющих интерес, чтобы спрягать пептид РГД в thiolated ssDNA утоличить, сначала добавить 100 микролитров 0,5-молар EDTA в 400 микролитров воды около 450 микролитров свежеприготовленного раствора TCEP. Затем добавьте 10 микролитров раствора TCEP-EDTA в 20 микролитров одномимиллярного тиола ДНК в PBS для 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Чтобы спрягать RGD амин с сульфо-SMCC, добавьте 40 микролитров свежеприготовленного 23-миллимолярно-SMCC до 100 микролитров свежеприготовленного 11-миллимолярского раствора амина РГД для 20-минутной инкубации при комнатной температуре.Чтобы спрягать RGD амин SMCC с thiolated ssDNA утоления, смешать весь объем тиадированных ssDNA утоления раствор со всем объемом RGD амин SMCC решение для одного часа инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации перенесите раствор на четырехградумное хранение по Цельсию на ночь. На следующее утро смешайте трехмяхлолярный хлорид натрия с раствором ДНК с тиолом и минус 20 градусов по Цельсию, охлажденным, 100%-ным этанолом в соотношении от 1 до 10 к 25, и поместите реакцию при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение примерно 30 минут.Когда ДНК осаждается, собирать ДНК путем центрифугации, и повторно гранулы в PBS для измерения концентрации ДНК на спектрометре. Для датчика интегративного напряжения, или ITS, синтез, смешать верхнюю и нижнюю нить ДНК решений на 1,1 к одному молярного соотношения, и инкубировать реакцию на ночь на четыре градуса по Цельсию, прежде чем поместить aliquots смеси при минус 20 градусов по Цельсию для длительного хранения. Для иммобилизации ITS, пальто 29-миллиметровый диаметр, стекло-дно Петри блюдо с 200 микролитров 0,1 миллиграмма на миллилитр биотинилированных крупного рогатого скота сыворотки альбумин, или BSA-биотин, в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.Когда BSA-биотин физически адсорбирован на поверхности стекла, мыть блюдо три раза с 200 микролитров свежего PBS на стирку, а затем инкубации с 200 микролитров 50 микрограмм на миллилитр белка авидин в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть блюдо три раза с PBS, как попродемонстрировано, и добавить 200 микролитров 0,1-микромолярной ITS еще 30-минутной инкубации при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации, мыть блюдо три раза с PBS, оставляя последнюю стирку в блюдо, пока ячейка покрытие.Чтобы инициировать культуру кератоцитов рыбы, используйте пинцет с плоским наконечником, чтобы вырвать кусок шкалы из рыбы, и осторожно нажмите шкалу на колодец неизмененной стеклянной нижней чашки Петри, с внутренней стороны шкалы, контактной со стеклом. Подождите около 30 секунд для рыбной шкалы придерживаться стеклянной поверхности блюда, прежде чем покрыть шкалу с одним миллиметром полного Iscove в модифицированной Dulbecco's Medium. Затем инкубировать шкалу в темной и влажной коробке в течение шести-48 часов при комнатной температуре.Чтобы выть кератоциты на поверхность ITS, замените среду из блюда культуры кератоцитов раствором 1X-клеток для трехминутной инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации замените отсоединеющий раствор свежей полной средой и отмежевать клетки от нежной трубы. Затем, настроить клетки к соответствующей концентрации для покрытия, и семена их на ITS покрытием блюдо в течение 30 минут при комнатной температуре перед визуализацией.Для визуализации интегрина в живых клетках в режиме реального времени перенесите клетки на стадию флуоресцентного микроскопа и выберите цель в 40 или 100 раз. В программном обеспечении для визуализации установите время экспозиции до одной секунды и интервал кадра в 20 секунд, чтобы получить видео изображений ITS. Затем используйте соответствующую программу анализа изображений, чтобы вычесть предыдущий кадр видео ITS из текущего кадра для вычисления сигнала ITS, недавно произведенного в последнем интервале кадра.Недавно произведенный сигнал ITS представляет собой интегринированное напряжение, генерируемое в последнем интервале кадра, тем самым сообщая о клеточной силе в квази-реальном времени. Здесь интегринное картирование напряжения демонстрирует индукцию интегринного напряжения на двух силовых путях во время миграции кератоцитов. Разрешение карты силы может быть откалибрована до 0,4 микрометра.Высокое напряжение интегрина концентрируется на задней марже в разношерстных кератоцитах рыб. В немотильные клетки, конкретные интегрин напряженности картина, которая сильно отличается от наблюдаемых в быстро мигрирующих кератоцитов формируется. Координационные спайки и интегринное напряжение рыбных кератоцитов могут быть со-изображения для оценки взаимосвязи между интегрином напряженности и клеточной структуры в клетках, представляющих интерес.С ITS сила клеточной адгезии становится видимой с разрешением и чувствительностью, сравнимой с клеточной структурной визуализацией. Этот метод прокладывает путь для изучения взаимодействия силовой структуры в клетках.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Биомолекулярных Обнаружение использованием интерферометрических датчиков изображения отражения (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Инкапсуляция Бесклеточные транскрипции и трансляции в машинный Пузырьки, для построения клеточных Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Первоначальная оценка антител конъюгаты изменения с пептидами вирусный производные для повышения сотовой накопления и ориентации опухоли

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Репрессии транскрипции гена, перенаправив клеточными с химической эпигеномные модификаторы

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...