Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el fondo de arranque proporcionado por la Universidad Estatal de Iowa y por el Instituto Nacional del General médica Ciencias (R35GM128747).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC, 8-16-8333-I) de la Universidad Estatal de Iowa.
1. síntesis del sensor tensión integradora
<ol><li>Personalizar y ordenar ssDNAs (véase la Tabla de materiales). Nota: Las secuencias de ssDNA son como sigue. El filamento superior es /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG CCG/3BHQ_2 /. Los filamentos más bajos son los siguientes. 12 pN ITS: / 5Cy3/CGG CCG CTG C...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

El ITS es muy accesible pero poderosa técnica para celulares asignación en términos de síntesis y aplicación de la fuerza. Con todos los materiales listos, el ITS pueden ser sintetizado dentro de 1 día. Durante los experimentos, se necesitan sólo tres pasos de la capa superficial antes de la galjanoplastia de la célula. Recientemente, lo más habían simplificado el procedimiento de recubrimiento para un paso vinculando directamente el su con albúmina de suero bovino, lo que permite la adsorción física directa...

Las células dependen de las integrinas cumplir y ejercer fuerzas celulares a la matriz extracelular. Transmisión de fuerza y adhesión celular mediada por integrinas son cruciales para la célula de difusión de1,2, migración3,4y supervivencia5,6,7. En el largo plazo, integrina biomecánica señalización también influye célula proliferación8,9,10 y diferenciación11,12. Los investigadores han desarrollado varios métodos para medir y celular integrina transmitida mapa las fuerzas en la interfase célula-matriz. Estos métodos se basan en sustrato elástico13, matriz de micropost14, o atómica microscopía (AFM)15,16de la fuerza. Métodos elásticos de sustrato y micropost dependen de la deformación de sustratos a informe el estrés celular y tienen limitaciones en términos de resolución espacial y sensibilidad de la fuerza. AFM tiene fuerza de alta sensibilidad, pero no puede detectar la fuerza en puntos múltiples simultáneamente, haciendo difícil mapa celular fuerza transmitida por las integrinas.
En los últimos años, se desarrollaron varias técnicas para estudiar la fuerza celular a nivel molecular. Una colección de sensores de tensión molecular basados en glicol de polietileno17,18, péptido de seda de araña19y ADN20,21,22,23 fueron desarrolladas para visualizar y monitorizar la tensión transmitida por las proteínas moleculares. Entre estas técnicas, DNA primero fue adoptado como el material de síntesis en la tensión de la correa (TGT), un enlazador rupturable que modula el límite de las tensiones de la integrina en células vivas22,24. Más tarde, técnica de transferencia de ADN y fluorescencia resonancia se combinan para crear horquilla sensores basados en ADN fluorescente tensión primero por Chen grupo23 y grupo20 de Salaita. El sensor de tensión basado en el ADN de horquilla informes integrina tensión en tiempo real y ha sido aplicado con éxito al estudio de una serie de funciones celulares21. Después, laboratorio de Wang había combinado un TGT con el par fluoróforo-extintor a tensión de integrina de informe. Este sensor lleva un su25,26. El ITS se basa en ADN de doble cadena (dsDNA) y tiene un rango dinámico más amplio (pN 10-60) para la calibración de la tensión de la integrina. En contraste con sensores basados en el ADN de la horquilla, el su informe no fuerza celular en tiempo real pero registra todos los acontecimientos histórico integrinas como la huella de la fuerza celular; Este proceso de acumulación de señal mejora la sensibilidad para la fuerza celular imágenes, lo que es factible a fuerza celular imagen incluso con un microscopio de fluorescencia bajo. La síntesis de ITS es relativamente más conveniente que se constituya por cruzamiento por hibridación dos ADN monocatenario (ssDNA).
El ITS es un dsDNA 18-base-emparejado conjugado con biotina, un fluoróforo, un extintor (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27y un arginylglycylaspartic cíclico ácido (RGD) péptido28 como un ligando de péptido de integrina (figura 1). El hilo inferior se conjuga con el fluoróforo (Cy3 se utiliza en este manuscrito, mientras que otros tintes, tales como serie del Cy5 o Alexa, también se han demostrado viables en nuestro laboratorio) y la etiqueta de biotina, con el que el su es inmovilizado sobre un sustrato por enlace biotina-avidina. El hilo superior se conjuga con el péptido RGD y el Quencher del agujero negro, que sacia Cy3 con aproximadamente 98% amortiguamiento eficiencia26,27. Con el protocolo presentado en este trabajo, la densidad de la capa de su substrato es alrededor de 1.100/μm2. Esto es la densidad que previamente calibrados para 18 bp biotinilado dsDNA cubierto sobre el sustrato funcionalizados neutrAvidin siguiendo el mismo protocolo29de la capa. Cuando las células se adhieren al substrato cubierto con el su, integrina une el ITS a través de RGD y transmite la tensión a la su. El su tiene una tolerancia de tensión específico (Ttol) que se define como el umbral de tensión que separa mecánicamente el dsDNA de ITS dentro de 2 s22. SU ruptura por tensión de integrina conduce a la separación del extintor de la tintura que posteriormente emite fluorescencia. Como resultado, la tensión de la integrina invisible se convierte en una señal de fluorescencia y la fuerza celular puede asignarse por proyección de imagen de fluorescencia.
Para demostrar la aplicación de lo ITS, utilizamos peces keratocyte aquí, un modelo de celular utilizado para celular migración estudio30,31,32, células CHO-K1, utilizado células inmóviles y fibroblastos 3T3 de NIH. Coimaging de las estructuras de tensión y celular integrina también se lleva a cabo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

La tensión molecular transmitida por bonos de integrina ligando es la señal mecánica fundamental en la vía de la integrina que juega un papel importante en muchas funciones celulares y los comportamientos. Para calibrar y tensión de integrina de la imagen con fuerza alta sensibilidad y resolución espacial, se desarrolló un sensor de tensión integradora (ITS), un sensor de tensión fluorescente basado en el ADN. El su se activa para emitir fluorescencia si mantener una tensión molecular, así conversión de fuerza a la señal fluorescente a nivel molecular. El umbral de tensión para su activación es ajustable en el rango de pN 10 – 60 que cubre bien el rango dinámico de tensión de integrinas en las células. Sobre un sustrato injertado con una ITS, la tensión de integrinas de las células adherentes es visualizada por fluorescencia y reflejada en la resolución del submicron. El ITS también es compatible con la proyección de imagen estructural de célula en células fijas y células vivas. El ITS se ha aplicado con éxito al estudio de la migración celular y la contracción de la plaqueta. Este documento detalla el procedimiento para la síntesis y aplicación de lo ITS en el estudio de la fuerza celular integrina-transmitida.

Con el ITS, el mapa de la tensión de integrina de keratocytes pescado fue capturado. Muestra que un keratocyte migra y genera tensión integrina en dos pistas de fuerza (figura 2A). La resolución del mapa de fuerza fue calibrada para ser 0,4 μm (figura 2B). Integrina alta tensión se concentra en el margen posterior (Figura 3A). El ITS también demuestra diferentes patrones específicos de las dif...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrina tensión juega un papel importante en diversas funciones celulares. Con un sensor de tensión integradora, integrina tensión es calibrada con sensibilidad picoNewton (pN) y reflejada en la resolución del submicron.

Proyección de imagen integrina tensión y fuerza celular en la resolución del Submicron con un Sensor de tensión integradora

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Este sensor de tensión integrativa basado en el ADN, o ITS, convirtiendo la señal de fuerza a fluorescencia localmente permite la imagen directa de la fuerza celular con microscopía de fluorescencia. ITS tiene una alta resolución espacial y una alta sensibilidad. El umbral de activación es sintonizable, permitiendo una imagen selectiva de la tensión de integrina a diferentes niveles.Después de recibir el ADN de una sola cadena personalizado, o ssDNA, de interés, para conjugar el péptido RGD al quencher de ssDNA tiolado, agregue primero 100 microlitros de 0.5-molar EDTA en 400 microlitros de agua a unos 450 microlitros de solución TCEP recién preparada. A continuación, añada 10 microlitros de la solución TCEP-EDTA a 20 microlitros de un quencher de ADN tiol mililitrolar en PBS para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. Para conjugar la amina RGD con sulfo-SMCC, agregue 40 microlitros de sulfo-SMCC 23 mililo-SMCC recién preparados a 100 microlitros de solución de amina RGD de 11 milímetros recién preparada para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente.Para conjugar RGD amine SMCC con el quencher ssDNA tiolado, mezcle todo el volumen de la solución de quencher ssDNA tiolada con todo el volumen de la solución SMCC de amina RGD para una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera la solución al almacenamiento de cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, mezcle el cloruro de sodio de tres molares con la solución de ADN conjugado con tiol y menos 20 grados Celsius, refrigerado, 100% etanol en una proporción de uno a 10 a 25, y coloque la reacción en menos 20 grados Celsius durante unos 30 minutos.Cuando el ADN se ha precipitado, recoger el ADN por centrifugación, y resuspender el pellet en PBS para la medición de la concentración de ADN en un espectrómetro. Para el sensor de tensión integrativa, o ITS, síntesis, mezcle las soluciones de ADN de hebra superior e inferior en una relación de 1,1 a uno molar, e incubar la reacción durante la noche a cuatro grados centígrados antes de colocar alícuotas de la mezcla a menos 20 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo. Para la inmovilización DE ITS, cubra un plato Petri de 29 milímetros de diámetro, con fondo de vidrio con 200 microlitros de 0,1 miligramos por mililitro de albúmina sérica bovina biotinilada, o BSA-biotina, durante 30 minutos a cuatro grados Centígrados.Cuando la BSA-biotina se haya adsorbido físicamente en la superficie de vidrio, lave el plato tres veces con 200 microlitros de PBS fresco por lavado, seguido de incubación con 200 microlitros de 50 microgramos por mililitro de proteína avidin durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave el plato tres veces con PBS como se ha demostrado, y agregue 200 microlitros de 0,1 micromolares DE STI para otra incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave el plato tres veces con PBS, dejando el último lavado en el plato hasta el revestimiento de la célula.Para iniciar un cultivo de queratocito de pescado, utilice una pinza de punta plana para arrancar un pedazo de escama de un pez, y presione suavemente la báscula sobre el pozo de un plato Petri de fondo de vidrio sin modificar, con el lado interno de la báscula en contacto con el vaso. Espere unos 30 segundos para que la escama de pescado se adhiera a la superficie de vidrio del plato antes de cubrir la báscula con un milímetro de medio completo de Dulbecco modificado de Iscove. Luego, incubar la báscula en una caja oscura y húmeda durante seis a 48 horas a temperatura ambiente.Para placar los queratocitos sobre la superficie ITS, reemplace el medio del plato de cultivo de queratocitos por una solución de desprendimiento de células 1X para una incubación de tres minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, reemplace la solución desmontable por un medio fresco completo y disocia las células con pipeteo suave. Luego, ajuste las células a la concentración adecuada para el revestimiento, y sembrarlas en el plato recubierto de ITS durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de tomar imágenes.Para imágenes de tensión de integrina casi en tiempo real en células vivas, transfiera las células a la etapa de un microscopio de fluorescencia y seleccione el objetivo de 40 o 100 veces. En el software de imágenes, establezca el tiempo de exposición en un segundo y el intervalo de fotogramas de 20 segundos para obtener un vídeo de las imágenes ITS. A continuación, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para restar un fotograma anterior del vídeo ITS de un fotograma actual para calcular la señal ITS recién producida en el intervalo de fotogramas más reciente.La señal ITS recién producida representa la tensión de integrina generada en el último intervalo de trama, reportando así la fuerza celular de manera casi en tiempo real. Aquí, el mapeo de tensión de integrina demuestra la inducción de la tensión de integrina en dos vías de fuerza durante la migración de queratocitos. La resolución del mapa de fuerza podría calibrarse para que sea de 0,4 micrómetros.La alta tensión de integrina se concentra en el margen posterior en queratocitos de peces motiles. En las células no móviles, se forma un patrón de tensión de integrina específico que es muy diferente del observado en el queratocito de rápida migración. Las adherencias focales y la tensión de integridad de los queratocitos de peces se pueden co-imagen para evaluar la relación entre la tensión de la integrina y la estructura celular en las células de interés.Con ITS, la fuerza de adhesión celular se hace visible con una resolución y una sensibilidad comparable a la imagen estructural celular. Esta técnica pavimenta el camino para el estudio de una interacción fuerza-estructura en las células.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Investigación

Bioingeniería

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...