Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Detta arbete stöds av fondens start tillhandahålls av Iowa State University och av National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC, 8-16-8333-jag) från Iowa State University.
1. Sammanfattning av integrativ spänningar sensorn
<ol><li>Anpassa och beställa ssDNAs (se Tabell för material). Obs: SsDNA sekvenser är följande. Den övre strand är /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De nedersta delarna är följande. 12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 / 23 pN I...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

ITS är en mycket tillgänglig men ändå kraftfull teknik för cellulära tvinga kartläggning både syntes och ansökan. Med alla material redo, kan ITS syntetiseras inom 1 dag. Under experiment behövs bara tre steg av ytbeläggning före cellen plätering. Nyligen har förenklat vi ytterligare beläggning förfarandet till ett steg genom att direkt länka ITS till bovint serumalbumin, som möjliggör direkt fysiska adsorption av ITS till glas eller polystyren ytor33. ITS ger fluorescerande int...

Celler är beroende av integriner till följa och utöva cellulära styrkor till extracellulärmatrix. Integrin-medierad cell adhesion och kraft överföring är avgörande för cell spridning1,2, migration3,4och överlevnad5,6,7. På lång sikt influenser integrin biomekaniska signalering också cell spridning8,9,10 och differentiering11,12. Forskare har utvecklat olika metoder för att mäta och karta integrin överförbara cellular styrkor på cell-matrix gränssnittet. Dessa metoder bygger på elastisk underskikt13, array micropost14, eller atomic force microscopy (AFM)15,16. Elastiska underlaget och micropost metoder är beroende av deformationen av substrat att rapportera cellulär stress och har begränsningar när det gäller rumslig upplösning och tvinga känslighet. AFM har hög kraft känslighet, men den kan inte upptäcka kraft på flera ställen samtidigt, vilket gör det svårt att kartlägga cellulära kraft överförs av integriner.
Under de senaste åren utvecklades flera tekniker för att studera cellulära kraft på molekylär nivå. En samling av molekylär spänning sensorer baserat på polyetylenglykol17,18, spider silk peptid19och DNA20,21,22,23 utvecklades till visualisera och övervaka spänningar överförs av molekylära proteiner. Bland dessa tekniker antogs först DNA som syntes materialet i spänningen spårvidd tjuder (TGT), en rupturable länkare som modulerar den övre gränsen för integrin spänningar i levande celler22,24. Senare, kombinerades DNA och fluorescens resonans överföra teknik för att skapa hårnål DNA-baserade fluorescerande spänning sensorer först av Chens grupp23 och Salaitas grupp20. Hårnål DNA-baserade spänningar sensorn rapporterar integrin spänningen i realtid och har tillämpats framgångsrikt till studien av en rad cellulära funktioner21. Efteråt, kombinerat Wang's lab en TGT med fluorophore-törstsläckare paret till rapporten integrin spänning. Denna sensor heter en ITS25,26. ITS är baserad på dubbelsträngat DNA (dsDNA) och har ett bredare dynamiskt omfång (10-60 pN) för integrin spänning kalibrering. I motsats till hårnål DNA-baserade sensorer, ITS redovisar inte cellular kraft i realtid men registrerar alla historiska integrin händelser som fotavtryck av cellulära kraft; Denna signal ackumulationsprocessen förbättrar känsligheten för cellulära kraft imaging, gör det möjligt att bilden cellular kraft även med low-end fluorescens Mikroskop. Syntesen av ITS är relativt mer praktiskt eftersom det är skapat av korsa två enkelsträngade DNAs (ssDNA).
ITS är en 18-base-parat dsDNA konjugerat med biotin, en fluorophore, en törstsläckare (svart hål törstsläckare 2 [BHQ2])27och en cyklisk arginylglycylaspartic syra (RGD) peptid28 som ett integrin peptid ligand (figur 1). Den nedersta delen är konjugerat med fluorophore (Cy3 används i detta manuskript, medan andra färgämnen, såsom Cy5 eller Alexa-serien, har också visat genomförbart i vårt labb) och biotin taggen, som ITS är orörlig på ett substrat av biotin-metoden bond. Den övre delen är konjugerat med RGD peptiden och det svarta hålet törstsläckare, som släcker Cy3 med cirka 98% släcka effektivitet26,27. Med protokollet presenteras i denna uppsats, är beläggning tätheten av ITS på ett substrat runt 1100/µm2. Detta är den täthet som vi tidigare kalibrerade för 18 bp biotinylerade dsDNA belagd på neutrAvidin-functionalized substratet genom att följa samma beläggning protokoll29. När celler följer underlaget belagd med ITS, integrin binder ITS genom RGD och överför spänning till ITS. ITS har en viss spänning tolerans (Ttol) som definieras som tröskeln spänning som mekaniskt skiljer dsDNA av ITS inom 2 s22. DESS bristning av integrin spänning leder till avskiljandet av törstsläckare från färgämnet som därefter avger fluorescens. Som ett resultat, osynliga integrin spänningen omvandlas till en fluorescens signal och den cellulära kraften kan mappas av fluorescens imaging.
För att demonstrera tillämpning av ITS, använder vi fisk keratocyte här, en allmänt använd cell modell för cell migration studie30,31,32, CHO-K1 cell, vanliga nonmotile cellinje och NIH 3T3 fibroblast. Coimaging av integrin spänning och cellen strukturer bedrivs också.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Molekylär spänning överförs av integrin-ligand obligationer är grundläggande mekaniska signalen i integrin väg som spelar viktiga roller i många cellfunktioner och beteenden. För att kalibrera och bild integrin spänning med hög kraft känslighet och rumslig upplösning, utvecklade vi en integrativ spänningar sensorn (ITS), en DNA-baserad fluorescerande spänningar sensorn. ITS aktiveras så för att fluorescera om upprätthålla en molekylär spänning, således konvertera kraft till fluorescerande signal på molekylär nivå. Spänning tröskelvärdet för ITS aktiveringen är avstämbara i intervallet 10 – 60 pN som väl täcker det dynamiska omfånget av integrin spänningen i cellerna. På ett substrat som ympats med en ITS, är integrin spänningen av vidhäftande celler visualiseras av fluorescens och avbildas på submicron upplösning. ITS är också kompatibel med cell strukturella imaging i både live och fasta celler. ITS har tillämpats framgångsrikt till studien av trombocyter kontraktion och cellmigration. Detta papper specificerar förfarandet för syntes och tillämpningen av ITS i studien av integrin överförbara cellular kraft.

Med ITS tillfångatogs integrin spänning karta över fisk keratocyter. Det visar att en keratocyte migrerar och genererar integrin spänning på två kraft spår (figur 2A). Resolution av kraft karta var kalibrerade för att vara 0,4 µm (figur 2B). Hög integrin spänning koncentrerar sig på den bakre marginalen (figur 3A). ITS visar också olika specifika mönster i olika celler. En nonmotile cel...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin spänning spelar viktiga roller i olika cellfunktioner. Med en integrativ spänning sensor, är integrin spänning kalibrerad med picoNewton (pN) känslighet och avbildas på submicron upplösning.

Imaging Integrin spänningar och cellulära kraft på Submicron upplösning med en integrativ spänningar sensorn

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Denna DNA-baserade integrativ spänningssensor, eller ITS, konvertera kraftsignal till fluorescens lokalt möjliggör direkt avbildning av cellulär kraft med fluorescensmikroskopi. ITS har en hög rumslig upplösning och en hög känslighet. Aktiveringströskeln är avstämbar, vilket möjliggör selektiv bild av integrinspänning på olika nivåer.Efter att ha fått den anpassade enkelsträngade DNA, eller ssDNA, av intresse, att konjugera RGD peptid till den tiolerade ssDNA-quencher, först lägga till 100 mikroliter av 0,5-molar EDTA i 400 mikroliter vatten till cirka 450 mikroliter av nyberedda TCEP lösning. Lägg sedan till 10 mikroliter av TCEP-EDTA-lösningen till 20 mikroliter av en millimolar thiol DNA-quencher i PBS för en 30-minuters inkubation vid rumstemperatur. Till konjugat RGD-amin med sulfo-SMCC, tillsätt 40 mikroliter av nyberedda 23-millimolar sulfo-SMCC till 100 mikroliter av nyberedda 11-millimolar RGD-aminlösning för en 20-minuters inkubation vid rumstemperatur.För att konjugera RGD-amin SMCC med den tiolerade ssDNA-quencher, blanda hela volymen av den tioolerade ssDNA-quencher-lösningen med hela volymen av RGD-amine-SMCC-lösningen för en timmes inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen överför du lösningen till fyrgradig Celsiuslagring över natten. Nästa morgon, blanda tre-molar natriumklorid med thiol-konjugerad DNA-lösning och minus 20-graders Celsius, kyld, 100%etanol vid en en-till-10-till-25 förhållande, och placera reaktionen på minus 20 grader Celsius i ca 30 minuter.När DNA:t har fällts upp, samla in DNA genom centrifugering, och återanvänd pelleten i PBS för mätning av DNA-koncentrationen på en spektrometer. För integrativ spänningssensor, eller ITS, syntes, blanda den övre och nedre strängen DNA-lösningar vid en 1,1-till-en-molar förhållande, och inkubera reaktionen över natten vid fyra grader Celsius innan du placerar alikvoter av blandningen på minus 20 grader Celsius för långsiktig lagring. För ITS immobilisering, päls en 29-millimeters diameter, glas-botten Petriskål med 200 mikroliter av 0,1-milligram-per-milliliter biotinylerade nötkreatur serum albumin, eller BSA-biotin, i 30 minuter vid fyra grader Celsius.När BSA-biotin fysiskt har adsorberat på glasytan, tvätta skålen tre gånger med 200 mikroliter färska PBS per tvätt, följt av inkubation med 200 mikroliter på 50 mikrogram per milliliter avidinprotein i 30 minuter vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tvätta skålen tre gånger med PBS som visats, och tillsätt 200 mikroliter av 0,1-mikromolar ITS för ytterligare 30-minuters inkubation vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tvätta skålen tre gånger med PBS, lämnar den sista tvätten i skålen tills cellen plätering.För att initiera en fisk keratocyte kultur, använd en platt-tippade pincett för att plocka en bit skala från en fisk, och försiktigt trycka på vågen på brunnen av en omodifierad glas-botten Petriskål, med den inre sidan av skalan kontakta glaset. Vänta i ca 30 sekunder för fiskskalan att ansluta sig till glasytan av skålen innan du täcker vågen med en millimeter av komplett Iscove's Modified Dulbecco's Medium. Sedan, inkubera skalan i en mörk och fuktig låda i sex till 48 timmar vid rumstemperatur.För att pläter keratocyterna på ITS-ytan, byt ut mediet från keratocytodlingsfatet med 1X cells lossande lösning för en tre minuters inkubering vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, byt ut den avtagbara lösningen med färskt komplett medium, och separera cellerna med skonsam pipettering. Justera sedan cellerna till lämplig koncentration för plätering och så dem på den ITS-belagda skålen i 30 minuter vid rumstemperatur före avbildning.För kvasi-realtid integrin spänning imaging i levande celler, överföra cellerna till scenen i ett fluorescens mikroskop, och välj 40 eller 100 gånger objektivt. I bildhanteringsprogrammet ställer du exponeringstiden till en sekund och bildruteintervallet på 20 sekunder för att få en video av ITS-bilderna. Använd sedan ett lämpligt program för bildanalysprogram för att subtrahera en tidigare bildruta av ITS-videon från en aktuell ram för att beräkna ITS-signalen som nyligen producerats i det senaste ramintervallet.Den nyproducerade ITS-signalen representerar den integrinspänning som genereras i det senaste ramintervallet och rapporterar därigenom den cellulära kraften på kvasi-realtidssätt. Här visar integrin spänning kartläggning induktion av integrin spänning vid två kraft spår under keratocyte migration. Kraftkartans upplösning kunde sedan kalibreras till 0,4 mikrometer.Hög integrin spänningskoncentrat vid den bakre marginalen i motil fisk keratocyter. I nonmotile celler bildas ett specifikt integrinspänningsmönster som är ganska annorlunda än det som observerats i den snabba migrerande keratocyten. Fokal sammanväxningar och integrin spänningen av fisk keratocyter kan co-imaged för att utvärdera förhållandet mellan integrin spänning och cellstruktur i celler av intresse.Med ITS blir celladhesionskraft synlig med en upplösning och en känslighet som är jämförbar med cellstrukturbildtagning. Denna teknik banar väg för studier av en kraft-struktur samspel i celler.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Högupplöst Fiberoptiska Microendoscopy för På plats Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomolekylära Detection anställa interferometriska Sensor Reflektans Imaging (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Bakteriell Immobilisering for Imaging genom atomkraftsmikroskopi

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Mätning av spänning Release Under Laser Induced Axon skada som Utvärdera Axonal vidhäftning vid Piconewton och millisekundsupplösning

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Inkapsling av Cellfritt Transkription och översättning Maskiner i vesiklar för uppförande av Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Högupplöst Spatiotemporal Analys av Receptor Dynamics av ​​Single-molekyl fluorescensmikroskopi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic Force Microscopy Imaging och Force-spektra enligt stöds lipiddubbelskikt

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Första utvärdering av antikropp-konjugat modifierad med Viral-derived peptider för att öka cellulära ackumulering och förbättra tumör inriktning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...