Name: imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (R35GM128747) ve Iowa State Üniversitesi tarafından sağlanan başlangıç Fonu tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC, 8-16-8333-ben) Iowa State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. bütünleştirici gerilim sensör sentezi
<ol><li>SsDNAs ( Tablo reçetesigörmek) sipariş ve özelleştirin. Not: Aşağıdaki gibi ssDNA dizileri vardır. Üst strand /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/olduğunu. Alt lifler aşağıdaki gibidir. 12 pN Its: / 5Cy3/GGC MOLDOVA'da CTG CGT SKK CCC /3Bio/<br...

<ol>
	<li>Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Rac+and+Cdc42+by+Integrins+Mediates+Cell+Spreading.">Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+in+cell+migration.">Integrins in cell migration.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).</li><li>Hood, J. D., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+integrins+in+cell+invasion+and+migration.">Role of integrins in cell invasion and migration.</a> Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).</li><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+signaling:+specificity+and+control+of+cell+survival+and+cell+cycle+progression.">Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression.</a> Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).</li><li>Illario, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-Dependent+Cell+Growth+and+Survival+Are+Mediated+by+Different+Signals+in+Thyroid+Cells.">Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).</li><li>Aoudjit, F., Vuori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Signaling+in+Cancer+Cell+Survival+and+Chemoresistance.">Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance.</a> Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).</li><li>Hou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+&#946;1+integrin+on+cell+proliferation+and+cellular+signaling+in+MDA-MB-231+breast+cancer+cells.">Distinct effects of &#946;1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells.</a> Scientific Reports. 6, 18430 (2016).</li><li>Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+receptor-mediated+mobilisation+of+intranuclear+calcium+in+rat+osteoclasts.">Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).</li><li>Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+pathways+linking+integrins+with+cell+cycle+progression.">Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression.</a> Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).</li><li>G&#243;mez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ib&#225;&#241;ez-Jim&#233;nez, B., Palacios, I. M., Mart&#237;n-Bermudo, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+epithelial+cell+differentiation+by+modulating+Notch+activity.">Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity.</a> Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).</li><li>Wang, H., Luo, X., Leighton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Integrins+in+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation.">Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).</li><li>Schwarz, U. S., Soin&#233;, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates:+A+guide+to+recent+computational+advances.">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).</li><li>Xie, T., Hawkins, J., Sun, Y., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+Force+Measurement+Using+Deformable+Microposts.">Traction Force Measurement Using Deformable Microposts.</a> Fibrosis. Methods and Protocols. , 235-244 (2017).</li><li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+Mechanics+of+Cellular+Processes+by+Atomic+Force+Microscopy.">Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).</li><li>Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+can+be+used+to+mechanically+stimulate+osteoblasts+and+evaluate+cellular+strain+distributions.">Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions.</a> Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).</li><li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+hydrogels+made+from+step-growth+derived+PEG-peptide+macromers.">Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers.</a> Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).</li><li>Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mechanical+tractions+exerted+by+cells+within+three-dimensional+matrices.">Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices.</a> Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).</li><li>Brenner, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact,+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing.">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li><li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion.">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167 (2014).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+nanoparticle+tension+sensors+reveal+that+T-cell+receptors+transmit+defined+pN+forces+to+their+antigens+for+enhanced+fidelity.">DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).</li><li>Wang, X., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+Single+Molecular+Forces+Required+to+Activate+Integrin+and+Notch+Signaling.">Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling.</a> Science. 340 (6135), (2013).</li><li>Blakely, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA-based+molecular+probe+for+optically+reporting+cellular+traction+forces.">A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces.</a> Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).</li><li>Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+outside+focal+adhesions+transmit+tensions+during+stable+cell+adhesion.">Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion.</a> Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+biosensor+enables+single+platelet+force+mapping+directly+by+fluorescence+imaging.">Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).</li><li>Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratocytes+Generate+High+Integrin+Tension+at+the+Trailing+Edge+to+Mediate+Rear+De-adhesion+during+Rapid+Cell+Migration.">Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration.</a> iScience. 9, 502-512 (2018).</li><li>Crisalli, P., Kool, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Path+Quenchers:+Efficient+Quenching+of+Common+Fluorophores.">Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).</li><li>Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+cyclic-RGDfK+ligand+and+&#945;v&#946;3+integrin+receptor.">The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and &#945;v&#946;3 integrin receptor.</a> Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+Molecular+Tension+within+Motile+Focal+Adhesions.">Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).</li><li>Euteneuer, U., Schliwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent,+directional+motility+of+cells+and+cytoplasmic+fragments+in+the+absence+of+microtubules.">Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules.</a> Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).</li><li>Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+does+not+produce+membrane+flow.">Cell migration does not produce membrane flow.</a> The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).</li><li>Mueller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Load+Adaptation+of+Lamellipodial+Actin+Networks.">Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks.</a> Cell. , (2017).</li><li>Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-activatable+coating+enables+high-resolution+cellular+force+imaging+directly+on+regular+cell+culture+surfaces.">Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces.</a> Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).</li><li>Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-Induced+Rupture+of+a+DNA+Duplex:+From+Fundamentals+to+Force+Sensors.">Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors.</a> ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).</li><li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces.">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li><li>Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unzipping+DNA+oligomers.">Unzipping DNA oligomers.</a> Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).</li><li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids.">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l&#8217;Acad&#233;mie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li><li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs.">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).</li></ol>

Cep için güçlü teknik zorlamak henüz sentezi ve uygulama açısından eşleme Its son derece erişilebilir değil. Tüm malzemeler hazır Its 1 gün içinde sentez. Deneyler sırasında yüzey kaplama sadece üç adımdan önce hücre kaplama ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, biz daha fazla bir adım kaplama yordamına doğrudan sığır serum albümin, cam veya polistiren yüzeyler33Its doğrudan fiziksel adsorpsiyon sağlayan Its bağlayarak Basitleştirilmiş. Its hücresel güç sinyal h?...

Hücreleri integrinler uygun ve hücre dışı matriks hücresel kuvvetlerinin uygulamak için güveniyor. Integrin aracılı hücre adezyon ve güç iletim1,2, geçiş3,4ve hayatta kalma5,6,7yayılan hücre için çok önemlidir. Uzun vadede integrin biyomekanik sinyal Hücre proliferasyonu8,9,10 ve farklılaşma11,12de etkiler. Araştırmacılar ölçmek için çeşitli yöntemler geliştirdik ve harita integrin ile bulaşan cep cep-matris arayüzü zorlar. Bu yöntemler elastik terkedilemeyen13tarihinde dayanmaktadır, dizi micropost14, ya da Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)15,16. Elastik terkedilemeyen ve micropost yöntemleri hücresel stres raporu ve Uzaysal çözünürlük açısından kısıtlamaları ve duyarlılık zorlamak için yüzeylerde deformasyon üzerinde güveniyor. AFM yüksek kuvvet duyarlılığa sahiptir ama aynı anda birden çok noktalarda kuvvet algılayamaz, hücresel kuvvet eşlemek üzere integrinler tarafından iletilen.
Son yıllarda, moleküler seviyede hücresel kuvvet çalışma için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Polietilen glikol17,18, spider ipek peptid19ve DNA20,21,22,23 dayalı moleküler gerilim sensörler topluluğu için geliştirilmiştir görselleştirmek ve gerginlik moleküler proteinler tarafından iletilen izlemek. Bu teknikler arasında gerginlik sentez malzeme ölçmek gibi urgan (TGT), canlı hücreleri22,24integrin gerginlik üst sınırı gelen bir rupturable bağlayıcı DNA ilk kabul edilmiştir. Daha sonra DNA ve floresan rezonans transfer tekniği kombine saç tokası floresan gerginlik DNA tabanlı sensörler oluşturmak için ilk Chen'in grup23 ve Salaita'nın grup20tarafından. Saç tokası DNA tabanlı gerilim sensör integrin gerginlik gerçek zamanlı raporlar ve hücresel işlevler21bir dizi çalışma için başarıyla uygulandı. Daha sonra Wang'ın laboratuvar rapor integrin gerginlik fluorophore-içki çiftine TGT birlikte. Bu sensör bir Its25,26olarak adlandırılır. Its çift iplikçikli DNA (dsDNA) dayanır ve integrin gerginlik kalibrasyon için daha geniş dinamik alan (10-60 pN) vardır. Saç tokası sensörleri, DNA tabanlı aksine Its hücresel kuvvet içinde gerçek-zaman rapor ama hücresel kuvvet ayak izi tüm tarihi integrin olayları kaydeder; Bu sinyal birikimi işlem Imaging, uygun görüntü hücresel gücüne bile düşük-uç floresan mikroskop ile yapım o hücresel kuvvet için duyarlılık geliştirir. Its sentezi iki tek iplikçikli DNA'lar (ssDNA) hybridizing tarafından oluşturulduğu gibi nispeten daha kolaydır.
Its integrin peptid ligand (şekil 1) biotin, bir fluorophore, bir içki (kara delik içki 2 [BHQ2])27ve bir döngüsel arginylglycylaspartic asit (RGD) peptid28 ile Birleşik bir 18 Bankası eşleştirilen dsDNA var. Alt strand fluorophore ile Birleşik (Cy3 Cy5 veya Alexa serisi gibi diğer boyalar ise bu el yazması kullanılır, aynı zamanda bizim laboratuarımızda uygun kanıtlanmıştır) ve hangi ile Its immobilize bir substrat biotin avidin bağ ile biotin etiketi. Üst strand RGD peptid ve Cy3 yaklaşık % 98'i su verme verimliliği26,27ile quenches kara delik içki ile Birleşik. Bu raporda sunulan ile bir yüzey üzerinde Its kaplama yoğunluğu 1100/µm2iletişim kuralıdır. Bu daha önce aynı protokolü29kaplama takip ederek neutrAvidin functionalized substrat kaplı 18 bp biotinylated dsDNA için kalibre yoğunluğudur. Its ile kaplı yüzey hücreleri uymak, integrin RGD aracılığıyla Its bağlar ve gerginlik için Its iletir. Its Its 2 s22içinde dsDNA mekanik olarak ayıran gerilim eşik olarak tanımlanan belirli gerilim toleransı (Ttol) vardır. ONUN rüptürü integrin gerilim tarafından içki ayrılması daha sonra Floresans yayar boya yol açar. Sonuç olarak, görünmez integrin gerginlik bir floresan sinyale dönüştürülür ve hücresel kuvvet Floresans görüntüleme tarafından eşleştirilebilir.
Its uygulama göstermek için balık keratocyte burada, hücre geçiş çalışma30,31,32için yaygın olarak kullanılan hücre modeli, CHO-K1 cep, yaygın olarak kullanılan nonmotile hücre kültürünü ve NIH 3T3 fibroblast kullanın. Coimaging integrin gerginlik ve hücre yapıları da yapılır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BSA-biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>upper strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lower strand DNA</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A39268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic peptide RGD with an amine group</td>
			<td>Peptides International</td>
			<td>PCI-3696-PI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&#8206;62996227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL petri dish</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D29-14-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SE410-15-1.5</td>
			<td>Device for electroporesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO-K1 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vinculin Antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>90227</td>
			<td>Primary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A28175</td>
			<td>Secondary antibody for vinculin immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor

Moleküler gerilim integrin-ligand bağları ile bulaşan birçok hücre fonksiyonları ve davranışları önemli rol oynayan integrin yolu temel mekanik sinyal olduğunu. Kalibre ve integrin gerilim yüksek kuvvet duyarlılık ve Uzaysal çözünürlük ile görüntü için geliştirdiğimiz bir bütünleştirici gerilim sensör (ITS), bir DNA tabanlı floresan gerilim sensör. Its moleküler gerilim sürdürülmesi Eğer bulabilsem böylece kuvvet moleküler seviyede floresan sinyal dönüştürme etkinleştirilir. Its harekete geçirmek için gerilim eşik tunable iyi kameranın dinamik alanı hücreleri integrin gerginlik kapakları pN 10-60 aralığında. Bir Its ile aşılı bir yüzey üzerinde integrin gerginlik yapışık hücreleri floresan tarafından görüntülenir ve Mikronaltı çözünürlükte görüntülü. Its da canlı hücreleri ve sabit hücreleri hücre yapısal görüntüleme ile uyumludur. Its çalışma trombosit daralma ve hücre geçiş başarıyla uygulandı. Bu kağıt için prosedür sentezi ve hücresel kuvvet integrin ile bulaşan insan Its uygulama ayrıntıları.

Its ile balık keratocytes integrin gerginlik Haritası ele geçirildi. Bu bir keratocyte geçirir ve integrin gerilim iki kuvvet parçaları (şekil 2A) üretir gösterir. Kuvvet harita çözünürlüğü 0.4 µm (şekil 2B) için kalibre. Yüksek integrin gerginlik arka kenar boşluklarını (şekil 3A) yoğunlaşmaktadır. Its Ayrıca farklı hücre farklı belirli desen gösterir. Nonmotile hücr...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor at JoVE.com

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Integrin gerginlik çeşitli hücre işlevlerinde önemli rol oynar. Bir bütünleştirici gerilim sensör ile integrin gerginlik picoNewton (pN) hassasiyeti ile kalibre edilmiş ve Mikronaltı çözünürlükte görüntüsü.

Integrin gerginlik ve hücresel kuvvet bütünleştirici gerilim sensör ile Mikronaltı çözünürlükte görüntüleme

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Bu DNA tabanlı integratif gerilim sensörü, ya da ITS, yerel floresan kuvvet sinyali dönüştürme floresan mikroskop ile hücresel kuvvetdoğrudan görüntüleme sağlar. ITS yüksek uzamsal çözünürlüğe ve yüksek duyarlılığa sahiptir. Etkinleştirme eşiği, farklı düzeylerde integrin gerilim seçici görüntü sağlayan, mümkün değildir.Tiyal ssDNA quencher RGD peptid eşleştirmek için özelleştirilmiş tek iplikçikli DNA, ya da ssDNA aldıktan sonra, ilk taze hazırlanmış TCEP çözeltisi yaklaşık 450 mikrolitre su 400 mikrolitre 0.5-molar EDTA 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakikalık kuluçka için PBS'de 20 mikrolitre bir milimolar tiyol DNA söndürücüye TCEP-EDTA çözeltisinin 10 mikrolitresini ekleyin. RGD aminini sulfo-SMCC ile eşleştirmek için, oda sıcaklığında 20 dakikalık kuluçka için taze hazırlanmış 11 milimolar RGD amin çözeltisine 100 mikrolitre taze hazırlanmış 23 milimolar sulfo-SMCC'ye 40 mikrolitre ekleyin.RGD amin SMCC'yi tiyote ssDNA quencher ile birleştirmek için, tiolated ssDNA quencher çözeltisinin tüm hacmini oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için RGD amin SMCC çözeltisinin tüm hacmiyle karıştırın. Kuluçka sonunda, çözeltiyi bir gecede dört derecelik santigrat depolamaya aktarın. Ertesi sabah, tiyol konjuge DNA çözeltisi ve eksi 20 derece santigrat, soğutulmuş, 1-10-25 oranında% 100 etanol ile üç molar sodyum klorür karıştırın ve yaklaşık 30 dakika boyunca eksi 20 derece santigrat reaksiyon yerleştirin.DNA çöktüğünde, SANtrifüj ile DNA'yı toplayın ve bir spektrometredeki DNA konsantrasyonunu ölçümleri için PBS'deki peleti yeniden askıya alın. İntegratif gerilim sensörü veya ITS sentezi için, üst ve alt iplikçik DNA çözümlerini 1,1 ila bir molar oranında karıştırın ve uzun süreli depolama için karışımın aliquots yerleştirmeden önce dört derece santigrat reaksiyon bir gecede kuluçka. ITS immobilizasyon için, kat 29 milimetre çapında, cam dip petri çanak ile 200 mikrolitre 0.1-mililitre başına mililitre biyotinylated sığır serum albumin, veya BSA-biotin, için 30 dakika dört derece santigrat.BSA-biotin cam yüzeye fiziksel olarak adsorbe olduğunda, yıkama başına 200 mikrolitre taze PBS ile üç kez bulaşık yıkayın, ardından 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca mililitre başına 50 mikrolitre avidin proteini 200 mikrolitre ile kuluçka. Kuluçka sonunda, gösterildiği gibi PBS ile çanak üç kez yıkayın ve dört santigrat derece başka bir 30 dakikalık kuluçka için 0.1-mikromolar ITS 200 mikrolitre ekleyin. Kuluçka sonunda, pbs ile çanak üç kez yıkayın, hücre kaplama kadar çanak son yıkama bırakarak.Bir balık keratosit kültürünü başlatmak için, bir balık tan ölçek bir parça koparmak için düz uçlu bir cızırtı kullanın, ve yavaşça bir değiştirilmemiş cam alt Petri çanak kuyu üzerine ölçek basın, ölçeğin iç tarafı cam temas ile. Tam Iscove's Modifiye Dulbecco's Orta bir milimetre ile ölçek kaplamadan önce balık skalası yemeğin cam yüzeyine uymak için yaklaşık 30 saniye bekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında altı ila 48 saat boyunca karanlık ve nemli bir kutu içinde ölçek kuluçka.Keratositleri ITS yüzeyine kaplamak için, keratosit kültür çanasından orta yı oda sıcaklığında üç dakikalık bir kuluçka için 1X hücre ayırma çözeltisi ile değiştirin. Kuluçka sonunda, ayırma çözeltisini taze tam ortamla değiştirin ve hücreleri nazik pipetleme ile ayırın. Daha sonra hücreleri kaplama için uygun konsantrasyona ayarlayın ve görüntülemeden önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ITS kaplı tabağa yerleştirin.Canlı hücrelerde yarı-gerçek zamanlı integrin gerilim görüntüleme için, bir floresan mikroskobun aşamasına hücreleri aktarın ve 40 veya 100 kez objektif seçin. Görüntüleme yazılımında, ITS görüntülerinin videosunu elde etmek için pozlama süresini bir saniyeye ve 20 saniyelik kare aralığına ayarlayın. Ardından, en son kare aralığında yeni üretilen ITS sinyalini hesaplamak için ITS videosunun önceki bir karesini geçerli bir çerçeveden çıkarmak için uygun bir görüntü analizi yazılımı programı kullanın.Yeni üretilen ITS sinyali, en son kare aralığında oluşan integrin gerilimini temsil eder ve bu da hücresel kuvveti yarı-gerçek zamanlı olarak raporeder. Burada integrin gerilim haritalaması keratosit göçü sırasında iki kuvvet parçasında integrin geriliminin indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir. Kuvvet haritasının çözünürlüğü 0.4 mikrometre olarak kalibre edilebilir.Yüksek integrin gerilimi hareketli balık keratositlerde arka kenarboşluğunda yoğunlaşmıştır. Motile olmayan hücrelerde, hızlı göç eden keratositte gözlenenden oldukça farklı olan spesifik bir integrin gerilim deseni oluşur. Fokal yapışıklıklar ve balık keratositlerinin integrin gerilimi ilgi hücrelerinde integrin gerilimi ve hücre yapısı arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için birlikte görüntülenebilir.ITS ile hücre yapışma kuvveti, hücre yapısal görüntülemesine benzer bir çözünürlük ve duyarlılıkla görünür hale gelir. Bu teknik, hücrelerde bir kuvvet yapısı etkileşimi çalışması için yol açıyor.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

Lazer Bağlı Akson Lezyon sırasında Gerilim Film ölçümü Piconewton ve Milisaniye Çözünürlük de Yüzey için aksonal yapışma değerlendir

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...