Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
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这项工作得到了 AOARD 赠款的支持 (没有。FA2386-18-1-4059), 荷兰科学研究组织 (NWO/OCW), 作为纳米科学前沿方案和先进材料 NWO-NSFC 方案 (729.001.016) 的一部分。作者承认 Ramon van der Valk 和 Roland Kieffer 的实验室援助。

1. 将商用3D 打印机转换为3D 生物打印机
<ol><li>从打印机机架上取下商用3d 打印机 (材料表) 的挤出机和加热器, 然后从主电路板上拔下控制这些元件的接线 (图 1 a)。由于控制打印机工作温度的传感器需要能够与打印机软件进行通信, 因此请从打印软件中删除延迟打印直到达到工作温度的算法。</li>
	<li>通过硅管 (内径为1毫米) 将移液器尖端 (200μl 尖端) 连接到装入...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

这里介绍的工程生物膜3D 打印协议有两个关键步骤。首先是琼脂印刷表面的制备, 这是产生特定印刷分辨率的最关键因素。重要的是要确保打印表面是平的, 并且打印头上的移液器尖端位于表面的正确高度。如果表面不平整, 则在打印过程中工作距离会发生变化。如果工作距离小于 0.1 mm, Ccl2溶液可能进入移液器尖端内, 导致水凝胶形成, 导致移液器尖端堵塞。如果工作距离超过 0.3 mm, 则无法...

由于空间图案材料的市场不断增加, 目前越来越需要开发环保、可持续的空间图案材料生产解决方案1。本文介绍了一种简单、经济的生产此类材料的方法, 因此提供了大量的未来应用。这里介绍的方法允许使用含有活细菌的生物油墨对空间图案结构进行三维 (3D) 打印。细菌在印刷结构中保持一周以上的活力, 使细菌能够进行自然或工程的代谢活动。因此, 印刷细菌可以在印刷结构中产生和沉积所需的成分, 例如创建一个功能交联生物膜2。
生产先进材料的传统方法涉及高能源支出 (如高温和高压), 并可能产生大量化学废物, 往往是需要成本广泛使用的有毒物质 3 ,4。相比之下, 多种细菌物种能够生产出容易适用于各种行业的材料。这些材料包括聚合物, 如聚羟基烷酸盐 (pha)5或聚 (乙二醇-异丙基)(pgla) 6, 细菌纤维素7, 细菌混凝土材料8, 仿生复合材料9,淀粉基胶粘剂10台, 或生物基电气开关 11, 等等。此外, 有价值材料的细菌生产通常在接近环境温度和压力的环境中, 在水环境中进行, 不需要或不产生有毒化合物。虽然用细菌生产材料已在文献中得到证明, 一些工业应用已经出现了12、13,但这种材料的空间模式的可靠方法仍然是一项挑战。
本文演示了一种将低成本商用3d 打印机转换为3D 细菌打印机的直接方法。该协议展示了如何制备含有和维持活细菌的生物油墨, 以及如何制备可以进行3D 打印的基板。这种方法适用于能够产生材料的各种天然和工程细菌株。这些细菌可以在三维打印结构中进行空间分布, 并继续其代谢活动, 这将导致细菌产生的所需材料的空间分布。
这种印刷方法使生物膜的添加剂制造, 细菌的聚集被一个自我产生的细胞外基质包围。生物膜是异质的3D 网络, 其中蛋白质、聚合物、细菌细胞、氧气和营养物质都是空间结构的 14。而以生物膜的形式, 细菌表现出更强的抗生素耐药性和结构鲁棒性, 使其难以从包括医疗导管和植入物在内的表面中根除。生物膜特性的关键, 也是生物膜研究面临的最大挑战, 似乎是生物膜15、16、17的异质性。空间控制模型生物膜的生产特别令人感兴趣, 因为它将允许复制或调整生物膜组件的空间模式, 有助于了解生物膜在几乎任何表面上的稳定沉积。自然。
本文介绍了一种使用3d 打印的含有工程大肠杆菌的水凝胶生产生物膜的方法, 这些水凝胶在感应器存在的情况下产生生物膜蛋白, 以及生物膜形成的验证方法2.这些生物膜的细胞外基质成分是含有自组装 CsgA 蛋白的 curli 淀粉样纤维 18.当工程中的大肠杆菌被诱导表达 csga 蛋白时, 它们形成一个稳定的生物膜模型, 保护细胞免受从印刷表面被冲走的影响。这种三维印刷生物膜可以在空间上进行控制, 可以作为研究多尺度生物膜结构-功能力学或材料组学的有用研究工具19。这些定制的生物膜将有助于了解生物膜形成的原理及其机械性能, 从而能够进一步研究抗生素耐药的机制等应用。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

生物膜是细菌的集合体, 嵌入在自产生的空间模式的细胞外基质中。生物膜内的细菌会产生增强的抗生素耐药性, 这对健康构成潜在的危害, 但也可能有利于环境应用, 如饮用水的净化。抗菌疗法和生物膜启发应用的进一步发展将需要开发可重复的、可工程化的生物膜制造方法。近年来, 一种利用改进型三维 (3D) 打印机制备细菌油墨的生物膜的新方法。本文介绍了构建这种高效、低成本的3D 生物打印机所需的步骤, 它在细菌诱导材料加工中提供多种应用。该协议从一个经过调整的商用3D 打印机开始, 在这种打印机中, 挤出机已被连接到注射器泵系统的生物墨水分配器所取代, 从而实现了可控的、连续的生物墨水流动。为了开发一种适用于生物膜印刷的生物油墨, 工程中的大肠杆菌被悬浮在海藻酸盐溶液中, 使其与含钙表面发生凝固。在印刷基板中加入诱导剂化学品会推动生物膜蛋白在印刷生物油墨中的表达。该方法可对由印刷生物膜的离散层组成的各种空间图案进行3D 打印。这种空间控制的生物膜可以作为模型系统, 并可以在对社会产生广泛影响的多个领域找到应用, 包括抗生素耐药性预防或饮用水净化等。

成功的3D 生物膜打印的第一步是将商用3D 打印机转换为生物打印机。这种转换是通过拆卸打印机的挤出机和加热器 (设计用于使用聚合物油墨进行打印), 并将其替换为适合于印刷含有活菌的生物油墨的组件来实现的 (图 1 a)。挤出机被连接到注射器泵的管道系统上的移液器尖端 (或吸头, 如果在印刷过程中将使用多个生物油墨) 所取代 (?...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

本文介绍了一种将低成本商用3D 打印机转换为细菌3D 打印机的方法, 该打印机可促进图案生物膜的打印。介绍了制备生物打印机和生物油墨的所有必要方面, 以及评估生物膜形成的验证方法。

工程生物膜的三维造型

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

细菌3D生物印印是一种新开发的技术。该协议提供了一种简单的方法来构建用细菌打印的3D工程生物膜。该技术的主要优点是能够使用廉价的家用 3D 打印机生产 3D 打印生物膜。我们的 3D 打印机的一个可能应用是创建可重复的模型生物膜，可用于开发新的抗菌疗法。我们的 3D 打印方法可应用于与我们的藻酸盐生物墨水兼容的任何类型的细菌。生物墨和印刷基板的制备是相当标准的过程，而 3D 打印过程，尤其是 Z 轴的校准是需要一些实践的关键步骤。设置访问高度的校准将影响我们的 3D 打印机的分辨率，并且在很大程度上取决于个人体验。此过程需要手动调整，并且很难用书面格式进行描述。将 200 微升移液器尖端连接到硅胶管的长度，然后将移液器尖端安装到 3D 打印机的挤出机头上，以替代原始挤出机。接下来，在卢里亚-贝尔塔尼肉汤中溶解的400毫升1%阿加糖中加入四毫升的五摩尔氯化钙溶液，并辅以适当的抗生素和诱导剂。然后，将 20 毫升 LB agar 溶液分配到每 150 毫米的 15 毫米培养皿中。在室温下将盘子晾干30分钟，盖子半开。准备3%的藻酸钠溶液，加热至沸点三次，对溶液进行消毒。然后，将无菌溶液存放在摄氏四度，直到使用。为了准备生物墨水的细菌成分，生长携带质粒的大肠杆菌，在含有抗生素的50毫升LB介质中进行GP表达。在 250 RPM 和 37 摄氏度的温度下摇动文化。培养物过夜后，在重力的3，220倍下分粒细菌5分钟，然后去除上经剂。将细菌颗粒重新在10毫升的LB介质中，并加入10毫升3%的藻酸钠。将 3D 打印机连接到计算机，然后打开 3D 打印软件。单击 X、Y 和 Z 轴的"主页"按钮，将打印头移动到其主位置。对于每次打印，请将准备好的打印基板放在打印床上的特定位置。在手动控制下，将打印头提升至超过 22 毫米的高度，这样在移动过程中不会与 Petri 盘的边缘碰撞。将打印头放在印版顶部，然后向下移动，直到移液器尖端接触打印表面。将此 Z 轴位置分配为 Z1，即打印表面的高度。接下来，抬起打印头，然后手动将其移出板区域。如果打印头和印版表面之间的工作距离定义为 Z2，请在打印过程中将打印表面的高度加上工作距离输入打印程序作为 Z 值。加载预编程的 G 代码文件，其中包含用于打印所需形状的命令。在每个命令行中，打印头的位置可能会以 X、Y 和或 Z 轴更改。确保所有打印步骤中输入 Z 值，如打印表面的高度和工作距离。将液体生物墨水装入注射器，并安装在 3D 生物打印机的注射器泵中。然后，将挤出速度设置为每小时 0.3 毫升。单击"打印"按钮将生物墨水打印到打印基板上。等待启动注射器泵，直到打印开始，直到打印头与打印表面接触。在打印过程中，完全通过软件控制打印头的移动。一旦打印头到达打印的最后一点，请停止注射器泵，否则多余的生物墨将掉落到打印基板上并降低打印分辨率。对于 3D 结构的构造，打印头的所有移动都在 G 代码编辑器中控制。要增加第二层的打印高度，请键入第一层的打印高度，并在代码中增加 0.2 毫米的 Z 值。此后，在移动到较高层时，将 Z 值增加 0.1 毫米。在室温下孵育印刷样品三至六天，以生产生物膜成分，如卷曲纤维。然后，将板放在荧光扫描仪上，对板进行成像。要溶解藻酸基质，在pH 7下加入20毫升0.5摩尔柠檬酸钠溶液，加入印刷基材。在室温下孵育板两小时，同时在转速为 30 rpm 时摇晃。然后，丢弃液体并再次成像板，以比较柠檬酸盐处理之前和之后板的图像。3D 生物打印机可以产生以各种二维和三维形状封装水凝胶的细菌。然后，这些印刷形状可用于评估生物膜的形成是否成功，或者藻酸基质是否使用柠檬酸钠溶液完全溶解。在无可教育的柯利生产质粒的生物墨水的情况下，印刷图案在柠檬酸钠处理后完全溶解，表示未形成生物膜柯利网络。含有可教育的柯利生产质粒的细菌在柠檬酸钠处理后未溶解，表明印刷细菌能够形成足够广泛的柯利网络，以稳定细菌的印刷模式。要构造多层结构，可以通过控制 G 代码编辑器来打印其他图层。增加样本中的打印图层数导致打印结构的宽度和高度逐渐增加。当大肠杆菌被设计成可不知不觉地生产柯利蛋白被打印成多层结构时，柠檬酸钠处理不会溶解样品，而含有非柯利产生的大肠杆菌的多层结构则溶解。3D 打印过程最关键的部分是 Z 轴的校准，以及启动打印和启动注射器泵的协调。为这个过程开发的生物墨水是相当软的，具有低韧性。为了提供和提高机械稳定性，可以对生物墨进行进一步的修改。这种 3D 打印技术能够生产具有优异机械性能的生物膜，从而制造仿生材料。处理这些细菌时，请戴上适当的防护服，如手套。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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