Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et AOARD-tilskud (nr. FA2386-18-1-4059), den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO/OCW) som en del af grænserne for Nanoscience-programmet, og Advanced Materials NWO-NSFC-programmet (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkender den laboratorie hjælp, som Ramon van der Valk og Roland Kieffer har.

1. omdannelse af en kommerciel 3D-printer til en 3D-bioprinter
<ol><li>Fjern ekstruder og varmelegeme fra en kommerciel 3D-printer (Table of Materials) fra printerens ramme, og tag ledningen ud af disse elementer fra hoved kredsløbskortet (figur 1a). Da sensoren, der styrer printerens driftstemperatur, skal være funktionel til at kommunikere med printersoftwaren, skal den algoritme, der forsinker udskrivningen, indtil driftstemperaturen er nået, fjernes fra Udskrivnings...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Den protokol, der her præsenteres for 3D-printning af konstruerede biofilm, har to kritiske trin. Først er forberedelsen af agar trykning overflade, som er den mest kritiske faktor til at producere en bestemt trykning opløsning. Det er vigtigt at sikre, at tryk overfladen er flad, og at pipettespidsen på skrivehovedet er placeret i den korrekte højde fra overfladen. Hvis overfladen ikke er flad, vil arbejds distancen ændre under udskrivningsprocessen. Hvis arbejdsafstanden er mindre end 0,1 mm, kan CaCl2...

Der er i øjeblikket et stigende behov for at udvikle miljøvenlige, bæredygtige løsninger til fremstilling af rumligt mønstrede materialer på grund af det voksende antal markeder for sådanne materialer1. Denne artikel præsenterer en enkel, økonomisk metode til produktion af sådanne materialer og tilbyder derfor et stort spektrum af fremtidige applikationer. Den metode, der præsenteres her tillader tredimensionel (3D) trykning af rumligt mønstrede strukturer ved hjælp af en bio-blæk, der indeholder levende bakterier. Bakterier forbliver levedygtige inden for de trykte strukturer i over en uge, så bakterierne til at udføre naturlige eller manipuleret metaboliske aktiviteter. Trykte bakterier kan derved producere og deponere ønskede komponenter inden for den trykte struktur, for eksempel at skabe en funktionel Cross-linked biofilm2.
Traditionelle metoder til fremstilling af avancerede materialer indebærer høje energiudgifter (f. eks. høje temperaturer og/eller belastninger) og kan producere store mængder kemisk affald, ofte giftige stoffer, der kræver omkostnings omfattende udnyttelse3 ,4. I modsætning hertil er flere bakteriearter i stand til at producere materialer, der let kan anvendes i forskellige brancher. Disse materialer omfatter polymerer såsom polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller poly (glycolid-Co-lactide) (pgla)6, bakteriel cellulose7, bakterielle beton materialer8, biomimetiske kompositter9, amyloid-baserede klæbemidler10, eller bio-baserede elektriske afbrydere11, blandt andre. Desuden, bakteriel produktion af værdifulde materialer typisk finder sted ved nær omgivende temperaturer og tryk og i vandige miljøer, uden at kræve eller producerer giftige forbindelser. Mens producere materialer med bakterier er blevet påvist i litteraturen og nogle industrielle anvendelser er allerede dukket12,13, en pålidelig metode til rumlig mønster af sådanne materialer er fortsat en udfordring.
Denne artikel demonstrerer en lineær metode til konvertering af en billig kommerciel 3D-printer til en 3D-bakteriel printer. Protokollen viser, hvordan man forbereder en bio-blæk, der indeholder og opretholder de levende bakterier, samt hvordan man forbereder substrater, som 3D-printning kan udføres. Denne metode er velegnet til brug med en række naturlige og konstruerede bakteriestammer i stand til at producere materialer. Disse bakterier kan fordeles rumligt inden for en 3D trykt struktur og stadig fortsætte deres metaboliske aktivitet, hvilket vil resultere i en rumlig fordeling af de ønskede materialer, der produceres af bakterierne.
Denne udskrivningsmetode muliggør additiv fremstilling af biofilm, aggregater af bakterier omgivet af en selv produceret ekstracellulær matrix. Biofilms er heterogene 3D netværk, hvor proteiner, polymerer, bakterieceller, ilt, og næringsstoffer er alle rumligt struktureret14. Mens bakterier i form af en biofilm, udviser en øget antibiotikaresistens og strukturel robusthed, hvilket gør dem svære at udrydde fra overflader, herunder medicinske katetre og implantater. Nøglen til biofilm egenskaber, og også den største udfordring til biofilm forskning, synes at være heterogenitet biofilm15,16,17. Produktion af rumligt styrede biofilm er af særlig interesse, da den vil gøre det muligt enten at gengive eller justere de rumlige mønstre af biofilm komponenter, at bidrage til forståelsen af den stabile afsætning af biofilm på stort set alle overflader i Natur.
Denne artikel præsenterer en metode til produktion af biofilm ved hjælp af 3D-trykte hydrogel indeholdende konstruerede E. coli bakterier, der producerer biofilm proteiner i tilstedeværelse af en inducer, samt metoder til verifikation af biofilm dannelse2 . De store ekstracellulære matrixkomponenter i disse biofilm er curli amyloid fibre18 , der indeholder selv monterede csga-proteiner. Når manipuleret E. coli bakterier er induceret til at udtrykke csga proteiner, de danner en stabil model biofilm, der beskytter cellerne mod at blive vasket ud af trykning overflade. En sådan 3D trykt biofilm kan rummæssigt styres og kan tjene som et nyttigt forskningsværktøj til undersøgelse af multi skala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomics19. Disse skræddersyede biofilm vil støtte forståelsen af principperne for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaber, der muliggør yderligere forskning i mekanismerne for antibiotikaresistens blandt andre applikationer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biofilms er aggregater af bakterier indlejret i en selv produceret rumligt-mønstrede ekstracellulære matrix. Bakterier i en biofilm udvikle øget antibiotikaresistens, som udgør potentielle sundhedsmæssige farer, men kan også være gavnlig for miljømæssige anvendelser såsom rensning af drikkevand. Den videre udvikling af antibakteriel terapi og biofilm-inspirerede applikationer vil kræve udvikling af reproducerbare, engineerable metoder til biofilm skabelse. For nylig, en ny metode til biofilm forberedelse ved hjælp af en modificeret tredimensionel (3D) printer med en bakteriel blæk er blevet udviklet. I denne artikel beskrives de trin, der er nødvendige for at opbygge denne effektive, billige 3D-bioprinter, der tilbyder flere applikationer i bakterielt induceret materialebehandling. Protokollen begynder med en tilpasset kommerciel 3D-printer, hvor ekstruder er blevet erstattet med en bio-blæk dispenser tilsluttet en sprøjtepumpe system muliggør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm af bio-blæk. For at udvikle en bio-blæk egnet til biofilm trykning, manipuleret Escherichia coli bakterier blev suspenderet i en opløsning af alginat, så de størkner i kontakt med en overflade, der indeholder calcium. Medtagelsen af et induktor kemikalie i tryk substratet driver ekspression af biofilm proteiner inden for det trykte bio-Ink. Denne metode muliggør 3D-printning af forskellige rummønstre bestående af diskrete lag af trykte biofilm. Sådanne rumlige-kontrollerede biofilm kan tjene som modelsystemer og kan finde applikationer i flere områder, der har en vidtrækkende indvirkning på samfundet, herunder antibiotikaresistens forebyggelse eller drikkevand rensning, blandt andre.

Det første skridt for vellykket 3D-udskrivning af biofilm er at konvertere en kommerciel 3D-printer til en bioprinter. Denne konvertering opnås ved at fjerne den ekstruder og varmelegeme af printeren, der er designet til udskrivning med en polymere blæk, og erstatte disse med komponenter egnet til trykning bio-blæk, der indeholder levende bakterier (figur 1a). Ekstruderen erstattes af en pipettespids (eller spidser, hvis der vil blive anvendt flere bio-bl...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Denne artikel beskriver en metode til at omdanne en lavpris-kommerciel 3D-printer til en bakteriel 3D-printer, der kan lette udskrivningen af mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter af forberedelsen af bioprinter og bio-Ink er beskrevet, samt verifikation metoder til at vurdere dannelsen af biofilms.

Tredimensionelt mønster af konstruerede Biofilms med en gør-det-selv Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

3D bioprint med bakterier er en nyudviklet teknik. Denne protokol giver en nem måde at konstruere manipuleret biofilm 3D trykt med bakterier. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at producere 3D-trykte biofilm ved hjælp af en billig hjemmebygget 3D-printer.En mulig anvendelse af vores 3D-printer er at skabe reproducerbare modelbiofilm, der kan bruges til at udvikle nye antibakterielle behandlinger. Vores 3D-print tilgang kan anvendes på enhver type bakterier, der er kompatibel med vores alginat baseret bioink. Fremstilling af bioink og af trykningsunderlag er ret standardprocedurer, mens 3D-printprocessen, især kalibreringen af Z-aksen, er et afgørende skridt, der kræver en vis praksis.Kalibrering af den indstillede adgangshøjde vil påvirke opløsningen på vores 3D-printer og er stærkt afhængig af personlig erfaring. Denne procedure kræver manuelle justeringer, og det er svært at beskrive i et skriftligt format. Tilslut en 200 mikroliter pipettespids til en længde af silikonerør, og monter pipettespidsen på 3D-printerens ekstruderhoved som erstatning for den oprindelige ekstruder.Dernæst tilsættes fire milliliter af en fem molar calciumchlorid opløsning til 400 milliliter af 1% agar opløst i Luria-Bertani bouillon, og supplere det med de relevante antibiotika og inducerende. Derefter dispenseres 20 milliliter LB agar opløsning i hver 150 millimeter med 15 millimeter petriskål. Tør fadet i 30 minutter ved stuetemperatur, med låget halvt åbent.Forbered en 3% natriumalginat opløsning, og varme det til kogepunktet tre gange for at sterilisere opløsningen. Derefter opbevares den sterile opløsning ved fire grader Celsius, indtil den anvendes. For at forberede den bakterielle komponent af bioink, dyrke E.coli bakterier transporterer plasmider for konstituerende GFP udtryk i 50 milliliter LB medium indeholder antibiotika.Ryst kulturen ved 250 RPM og 37 grader Celsius natten over. Efter natten vækst af kulturen, pellet bakterierne i fem minutter på 3, 220 gange tyngdekraften og derefter fjerne supernatant. Opsalt bakterierne pellet i 10 milliliter LB medium, og tilsæt 10 milliliter 3% natriumalginat.3D-printeren til en computer, og åbn 3D-udskrivningssoftwaren. Klik på knappen Hjem for X-, Y- og Z-akserne for at flytte skrivehovedet til startpositionen. For hvert tryk skal du placere et forberedt trykunderlag på et bestemt sted på tryksengen.Løft skrivehovedet til en højde på over 22 millimeter under manuel kontrol, så det ikke kolliderer med kanten af petriskålen under bevægelse. Placer skrivehovedet over pladens top, og flyt det ned, indtil pipettens spids kommer i kontakt med udskriftsoverfladen. Tildel denne Z-akse position som Z1, højden af udskrivningen overflade.Løft derefter skrivehovedet og flyt det manuelt uden for pladeområdet. Hvis arbejdsafstanden mellem skrivehovedet og pladeoverfladen defineres som Z2, skal du indtaste højden på udskriftsoverfladen plus arbejdsafstanden til udskrivningsprogrammet som Z-værdien under udskrivningen. Indlæs en forprogrammeret G-kodefil, der indeholder kommandoer til udskrivning af den ønskede figur.På hver kommandolinje kan skrivehovedets position ændres i Akserne X, Y og Z. Sørg for at indtaste Z-værdien under alle udskrivningstrin som højden på udskrivningsoverfladen plus arbejdsafstanden. Læg den flydende bioink i sprøjter, og monter dem i sprøjtepumpen på 3D-bioprinteren.Derefter indstilles ekstruderingshastigheden til 0,3 milliliter i timen. Udskriv bioink'en på udskriftsunderlaget ved at klikke på knappen Udskriv. Vent med at starte sprøjtepumpen, til trykningen er startet, og før skrivehovedet kommer i kontakt med trykfladen.Under udskrivning skal du styre printhovedets bevægelse helt af softwaren. Stop sprøjtepumpen, så snart skrivehovedet ankommer til det sidste udskrivningssted, ellers vil overskydende bioink falde ned på trykningsubstratet og reducere udskrivningsopløsningen. Til konstruktion af 3D-strukturer styres alle printhovedets bevægelser i G-kodeeditoren.Hvis du vil øge udskrivningshøjden for det andet lag, skal du skrive udskriftshøjden for det første lag og øge Z-værdien i koden med 0,2 millimeter. Derefter øge Z-værdien med 0,1 millimeter, når du flytter til et højere lag. Inkuber de trykte prøver ved stuetemperatur i tre til seks dage for at tillade produktion af biofilmkomponenter såsom Curli fibre.Derefter placere pladen på en fluorescerende scanner og billede pladerne. For at opløse alginatmatrixen tilsættes 20 milliliter en 0,5 molarnatriumcitratopløsning ved pH 7 til det trykte underlag. Indkube pladen ved stuetemperatur i to timer, mens du ryster ved 30 omdrejninger i minuttet.Derefter kasseres væsken og billedet pladerne igen, for at sammenligne med billederne af pladerne før og efter citrat behandling. 3D bioprinter kan skabe bakterier indkapsle hydrogels i en række to-dimensionelle og tre-dimensionelle former. Disse trykte former kan derefter bruges til at vurdere, om dannelsen af biofilm var en succes, eller om alginatmatrixen er helt opløst ved hjælp af en natriumcitratopløsning.I tilfælde af bioink uden den inducerende Curli produktion plasmid, det trykte mønster blev helt opløst efter natriumcitrat behandling, hvilket betyder, at ingen biofilm Curli netværk havde dannet. Bakterierne, der indeholder den inducerende Curli produktion plasmid blev ikke opløst efter natriumcitrat behandling, hvilket indikerer, at de trykte bakterier var i stand til at danne en Curli netværk omfattende nok til at stabilisere det trykte mønster af bakterier. Hvis du vil konstruere strukturer med flere lag, kan der udskrives yderligere lag ved at styre G-kodeeditoren.Hvis du øger antallet af udskrevne lag i en stikprøve, blev bredden og højden på de udskrevne strukturer øget gradvist. Når E.coli udviklet til at inducerende producere Curli proteiner blev trykt i flerlagede strukturer, natriumcitrat behandling ikke opløse prøverne, mens flerlagsstrukturer, der indeholder ikke Curli producerer E.coli blev opløst. De mest kritiske dele af 3D-udskrivningsproceduren er kalibreringen af Z-aksen og koordineringen af start af printet og start af sprøjtepumpen.Bioink udviklet til denne proces er temmelig blød, med lav sejhed. Der kan foretages yderligere ændringer af bioink' en for at give og forbedre den mekaniske stabilitet. Denne 3D-printteknik muliggør produktion af biofilm med fremragende mekaniske egenskaber, hvilket kan muliggøre fremstilling af biomimetiske materialer.Ved håndtering af disse bakterier, bære ordentlig beskyttelse, såsom handsker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersøgelse af tre-dimensionelle Flow Separation induceret af en model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Hurtig Subtraktiv mønster af levende cellelag med et Mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelte Electrospinning skrivning af tre-dimensionelle Poly(ε-caprolactone) stilladser med kontrollerbare morfologier for Tissue Engineering applikationer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Tre-dimensionelle udskrivning af termoplastiske materialer til at oprette automatiseret sprøjte pumper med Feedback kontrol for mikrofluid programmer

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD-platform til generering af flercellede tredimensionelle Sfæroider

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...