Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door een AOARD toelage (nr. FA2386-18-1-4059), de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO/OCW) als onderdeel van de grenzen van het programma van de nanowetenschap, en het Advanced Materials NWO-NSFC programma (No. 729.001.016). De auteurs erkennen laboratorium hulp van Ramon van der Valk en Roland Kieffer.

1. conversie van een commerciële 3D-printer in een 3D-bioprinter
<ol><li>Verwijder de extruder en de kachel van een commerciële 3D-printer (delijst van materialen) van de printer frame, en haal de bedrading regelen van deze elementen van de belangrijkste printplaat (Figuur 1a). Aangezien de sensor die de operationele temperatuur van de printer controleert moet functioneel zijn om met de printersoftware te communiceren, uit de druk software het algoritme verwijderen dat v...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Het protocol hier gepresenteerd voor 3D-afdrukken van gemanipuleerde biofilms heeft twee kritieke stappen. Eerst is de voorbereiding van de agar drukoppervlakte, die de meest kritieke factor aan het produceren van een specifieke druk resolutie is. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het drukoppervlak plat is en dat het pipet uiteinde op de printkop op de juiste hoogte van het oppervlak is geplaatst. Als de oppervlakte niet vlak is, zal de het werkafstand tijdens het drukproces veranderen. Als de werkafstand kleiner...

Er is momenteel een toenemende behoefte aan milieuvriendelijke, duurzame oplossingen te ontwikkelen voor de productie van ruimtelijk gedessineerde materialen, als gevolg van het groeiende aantal markten voor dergelijke materialen1. Dit artikel stelt een eenvoudige, economische methode voor de productie van dergelijke materialen voor en biedt daarom een groot spectrum van toekomstige toepassingen aan. De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk driedimensionale (3D) afdrukken van ruimtelijke structuren met behulp van een bio-inkt met levende bacteriën. Bacteriën blijven levensvatbaar binnen de gedrukte structuren voor meer dan een week, waardoor de bacteriën om natuurlijke of engineered metabole activiteiten uit te voeren. Gedrukte bacteriën kunnen daardoor de gewenste componenten binnen de gedrukte structuur produceren en deponeren, bijvoorbeeld het creëren van een functionele cross-linked biofilm2.
Traditionele methoden voor de productie van geavanceerde materialen te betrekken hoge energie-uitgaven (bijv. hoge temperaturen en/of druk) en kan produceren grote hoeveelheden chemisch afval, vaak toxische stoffen die kosten-uitgebreid gebruik vereisen3 ,4. In tegenstelling, meerdere bacteriële soorten zijn in staat om materialen die gemakkelijk toepasbaar kunnen zijn in verschillende industrieën te produceren. Deze materialen omvatten polymeren zoals polyhydroxyalkanoaten (PHA)5 of poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, bacteriële cellulose7, bacteriële concrete materialen8, Biomimetic composieten9, amyloid lijmen10, of Bio-based elektrische schakelingen11, onder anderen. Bovendien, bacteriële productie van waardevolle materialen meestal plaatsvindt op bijna-omgeving temperaturen en druk en in waterige omgevingen, zonder dat of het produceren van toxische verbindingen. Terwijl de productie van materialen met bacteriën is aangetoond in de literatuur en sommige industriële toepassingen zijn al naar voren gekomen12,13, een betrouwbare methode voor ruimtelijke patroon van dergelijke materialen blijft een uitdaging.
Dit artikel toont een rechttoe rechtaan methode van het omzetten van een goedkope commerciële 3D-printer in een 3D-bacteriële printer. Het protocol laat zien hoe u een bio-inkt voor te bereiden met en het behoud van de levende bacteriën, alsmede hoe substraten op waarop de 3D-druk kan worden uitgevoerd voor te bereiden. Deze methode is geschikt om te gebruiken met een verscheidenheid van natuurlijke en gemanipuleerde bacteriestammen in staat om materialen te produceren. Deze bacteriën kunnen ruimtelijk worden verdeeld binnen een 3D-gedrukte structuur en nog steeds hun metabole activiteit, die zal resulteren in een ruimtelijke verdeling van de gewenste materialen geproduceerd door de bacterie.
Deze drukmethode maakt additieve productie van biofilmen, aggregaten van bacteriën omgeven door een zelf geproduceerde extracellulaire matrix. Biofilms zijn heterogene 3D-netwerken waarin eiwitten, polymeren, bacteriële cellen, zuurstof en voedingsstoffen zijn allemaal ruimtelijk gestructureerd14. Terwijl in de vorm van een biofilm, bacteriën vertonen een verhoogde antibioticaresistentie en structurele robuustheid, waardoor ze moeilijk uit te roeien van oppervlakken, waaronder medische katheters en implantaten. De sleutel tot biofilm eigenschappen, en ook de grootste uitdaging voor biofilm onderzoek, lijkt de heterogeniteit van de biofilmen15,16,17. De productie van ruimtelijk gecontroleerde model biofilmen is van bijzonder belang omdat het de ruimtelijke patronen van biofilm componenten zou kunnen reproduceren of afstemmen, waardoor het begrip van de stabiele afzetting van biofilmen op vrijwel elk oppervlak in Aard.
Dit artikel presenteert een methode voor de productie van biofilmen met behulp van 3D-gedrukte hydrogels met gemanipuleerde E. coli bacteriën die biofilm eiwitten te produceren in de aanwezigheid van een inductor, alsmede de methoden van verificatie van de biofilm formatie2 . De belangrijkste extracellulaire matrix componenten van deze biofilmen zijn curli kuller amyloid vezels18 die zelf-geassembleerd CsgA eiwitten bevatten. Wanneer de ontworpen E. coli bacteriën worden bewogen om CsgA proteïnen uit te drukken, vormen zij een stabiel model biofilm dat de cellen tegen wordt weggespoeld van de drukoppervlakte beschermt. Een dergelijke 3D gedrukte biofilm kan ruimtelijk worden gecontroleerd en kan dienen als een nuttig onderzoek instrument voor het onderzoek van multischaalde biofilm structuur-functie mechanica of materiomics19. Deze op maat gemaakte biofilmen zullen het begrip van de principes van biofilm vorming en hun mechanische eigenschappen helpen, die verder onderzoek naar de mechanismen van antibiotische weerstand onder andere toepassingen toelaten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biofilms zijn aggregaten van bacteriën ingebed in een zelf geproduceerde ruimtelijk-patroon extracellulaire matrix. Bacteriën in een biofilm te ontwikkelen verbeterde antibioticaresistentie, die potentiële gevaren voor de gezondheid vormt, maar kan ook gunstig zijn voor milieu-toepassingen, zoals zuivering van drinkwater. De verdere ontwikkeling van anti-bacteriële therapeutische en biofilm-geïnspireerde toepassingen zal de ontwikkeling van reproduceerbare, ingenieurable methodes voor biofilm verwezenlijking vereisen. Onlangs is een nieuwe methode van biofilm voorbereiding met behulp van een aangepaste driedimensionale (3D) printer met een bacteriële inkt is ontwikkeld. Dit artikel beschrijft de stappen die nodig zijn om deze efficiënte, goedkope 3D bioprinter die meerdere toepassingen in bacteriële-geïnduceerde materiaal verwerking biedt te bouwen. Het protocol begint met een aangepaste commerciële 3D-printer waarin de extruder is vervangen door een bio-inkt dispenser aangesloten op een spuitpomp systeem waardoor een controleerbare, continue stroom van bio-inkt. Om een bio-inkt te ontwikkelen die geschikt is voor het drukken van biofilm, werden de gemanipuleerde bacteriën van Escherichia coli opgeschort in een oplossing van alginaat, zodat zij in contact met een oppervlakte stollen die calcium bevat. De opneming van een inductor chemisch product binnen het druk substraat drijft uitdrukking van biofilm proteïnen binnen de gedrukte bio-inkt. Deze methode maakt het mogelijk 3D-afdrukken van verschillende ruimtelijke patronen, bestaande uit discrete lagen van gedrukte biofilmen. Dergelijke ruimtelijk gecontroleerde biofilmen kunnen als modelsystemen dienen en kunnen toepassingen in veelvoudige gebieden vinden die een brede invloed op de maatschappij, met inbegrip van antibiotische weerstands preventie of drinkwaterreiniging, onder anderen hebben.

De eerste stap voor een succesvolle 3D-druk van biofilmen is het omzetten van een commerciële 3D-printer in een bioprinter. Deze conversie wordt bereikt door het verwijderen van de extruder en de kachel van de printer, ontworpen voor het afdrukken met een polymere inkt, en het vervangen van deze met componenten die geschikt zijn voor het afdrukken van bio-inkt met levende bacteriën (Figuur 1a). De extruder wordt vervangen door een pipet tip (of tips, als me...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Dit artikel beschrijft een methode voor het transformeren van een goedkope commerciële 3D-printer in een bacteriële 3D-printer die het afdrukken van gedessineerde biofilmen kan vergemakkelijken. Alle noodzakelijke aspecten van de voorbereiding van de bioprinter en bio-Ink worden beschreven, evenals verificatiemethoden om de vorming van biofilmen te beoordelen.

Driedimensionale patroon van gemanipuleerde biofilmen met een doe-het-zelf bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

3D bioprinting met bacteriën is een nieuw ontwikkelde techniek. Dit protocol biedt een eenvoudige manier om gemanipuleerde biofilms 3D geprint met bacteriën te bouwen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om 3D-geprinte biofilms te produceren met behulp van een goedkope zelfgebouwde 3D-printer.Een mogelijke toepassing van onze 3D-printer is het creëren van reproduceerbare model biofilms die kunnen worden gebruikt om nieuwe antibacteriële therapieën te ontwikkelen. Onze 3D-printbenadering kan worden toegepast op elk type bacterie dat compatibel is met onze op alginaat gebaseerde bioink. De bereiding van het bioink en van de printsubstraten zijn vrij standaardprocedures, terwijl het 3D-printproces, met name de kalibratie van de Z-as, een cruciale stap is die enige oefening vereist.Kalibratie van de ingestelde toegangshoogte zal de resolutie van onze 3D-printer beïnvloeden en is sterk afhankelijk van persoonlijke ervaring. Deze procedure vereist handmatige aanpassingen, en het is moeilijk om te worden beschreven in een schriftelijke vorm. Sluit een 200 microliter pipetpunt aan op een lengte van siliconen buizen en monteer de pipetpunt op de extruderkop van de 3D-printer als vervanging voor de originele extruder.Voeg vervolgens vier milliliter van een vijf molaire calciumchlorideoplossing toe aan 400 milliliter van 1%agar opgelost in Luria-Bertani bouillon en vul deze aan met de juiste antibiotica en aansporingsmiddelen. Dan, afzien van 20 milliliter van de LB agar oplossing in elke 150 millimeter bij 15 millimeter petrischaal. Droog de schotel 30 minuten op kamertemperatuur, met het deksel half open.Bereid een natriumalginaatoplossing van 3% en verwarm deze drie keer tot het kookpunt om de oplossing te steriliseren. Bewaar vervolgens de steriele oplossing op vier graden Celsius totdat deze wordt gebruikt. Om de bacteriële component van het bioink voor te bereiden, groeien E.coli bacteriën die plasmiden voor constitutieve GFP expressie in 50 milliliter LB medium bevattende antibiotica.Schud de cultuur op 250 RPM en 37 graden Celsius 's nachts. Na de nachtelijke groei van de cultuur, pellet de bacteriën gedurende vijf minuten op 3, 220 keer de zwaartekracht en verwijder vervolgens de supernatant. Resuspend de bacteriën pellet in 10 milliliter van LB medium, en voeg 10 milliliter van 3% natriumalginaat.Sluit de 3D-printer aan op een computer en open de 3D-afdruksoftware. Klik op de startknop voor de X-, Y- en Z-assen om de afdrukkop naar de thuispositie te verplaatsen. Plaats voor elke afdruk een voorbereid druksubstraat op een bepaalde locatie op het drukbed.Til de printkop onder handmatige bediening naar een hoogte van meer dan 22 millimeter, zodat deze tijdens het bewegen niet met de rand van de petrischaal botst. Plaats de printkop over de bovenkant van de plaat en beweeg deze naar beneden totdat de pipettepunt contact maakt met het drukoppervlak. Wijs deze Z-aspositie toe als Z1, de hoogte van het afdrukoppervlak.Til vervolgens de printkop op en verplaats deze handmatig buiten het plaatgebied. Als de werkafstand tussen de printkop en het plaatoppervlak wordt gedefinieerd als Z2, voert u de hoogte van het afdrukoppervlak plus de werkafstand in het afdrukprogramma in als de Z-waarde tijdens het afdrukken. Laad een voorgeprogrammeerd G-codebestand met opdrachten voor het afdrukken van de gewenste vorm.Bij elke opdrachtregel kan de positie van de printkop worden gewijzigd in de assen X, Y en of Z. Zorg ervoor dat u de Z-waarde invoert tijdens alle afdrukstappen als de hoogte van het afdrukoppervlak plus de werkafstand. Laad de vloeibare bioink in spuiten en monteer ze in de spuitpomp van de 3D bioprinter.Stel vervolgens de extrusiesnelheid in op 0,3 milliliter per uur. Druk het bioink af op het druksubstraat door op de knop Afdrukken te klikken. Wacht met het starten van de spuitpomp tot nadat het afdrukken is gestart en voordat de printkop in contact komt met het drukoppervlak.Tijdens het printen u de beweging van de printkop volledig door de software bedienen. Stop de spuitpomp zodra de printkop op het laatste drukpunt aankomt, anders valt overtollig bioink op het druksubstraat en vermindert de afdrukresolutie. Voor de bouw van 3D-structuren worden alle bewegingen van de printkop aangestuurd in de G-code editor.Als u de afdrukhoogte voor de tweede laag wilt verhogen, typt u de afdrukhoogte van de eerste laag en verhoogt u de Z-waarde in de code met 0,2 millimeter. Verhoog daarna de Z-waarde met 0,1 millimeter bij het verplaatsen naar een hogere laag. Incubeer de gedrukte monsters drie tot zes dagen bij kamertemperatuur om de productie van de biofilmcomponenten zoals Curli-vezels mogelijk te maken.Plaats vervolgens de plaat op een tl-scanner en beeld de platen. Om de alginaatmatrix op te lossen, voegt u 20 milliliter van een natriumcitraatoplossing van 0,5 molar bij pH 7 toe aan het bedrukte substraat. Broed de plaat twee uur lang op kamertemperatuur terwijl u schudt bij 30 tpm.Gooi vervolgens de vloeistof weg en beeld de platen opnieuw, om te vergelijken met de afbeeldingen van de platen voor en na de citraatbehandeling. De 3D bioprinter kan bacteriën creëren die hydrogels in een verscheidenheid van tweedimensionale en driedimensionale vormen inkapselen. Deze geprinte vormen kunnen vervolgens worden gebruikt om te beoordelen of de vorming van biofilm succesvol was of dat de alginaatmatrix volledig is opgelost met behulp van een natriumcitraatoplossing.In het geval van bioink zonder het inducible Curli productieplasmi, werd het gedrukte patroon volledig opgelost na de natriumcitraatbehandeling, wat betekent dat er geen biofilm Curli-netwerk was gevormd. De bacteriën die de inducible Curli productie plasmi werd niet opgelost na natrium citraat behandeling, wat aangeeft dat de gedrukte bacteriën in staat waren om een Curli netwerk uitgebreid genoeg om het gedrukte patroon van bacteriën te stabiliseren vormen. Als u structuren met meerdere lagen wilt construeren, kunnen extra lagen worden afgedrukt door de G-code-editor te bedienen.Het verhogen van het aantal afgedrukte lagen in een monster zorgde ervoor dat de breedte en de hoogte van de afgedrukte structuren stapsgewijs toeneemt. Toen E.coli, ontworpen om Curli-eiwitten te inducibly te produceren, in meerlaagse structuren werd gedrukt, loste de natriumcitraatbehandeling de monsters niet op, terwijl meerlaagse structuren die niet Curli-producerende E.coli bevatten, werden opgelost. De meest kritieke onderdelen van de 3D-printprocedure zijn de kalibratie van de Z-as en de coördinatie van het starten van de afdruk en het starten van de spuitpomp.De bioink ontwikkeld voor dit proces is vrij zacht, met een lage taaiheid. Verdere wijziging zou kunnen worden aangebracht aan de bioink, om te zorgen voor en verbetering van de mechanische stabiliteit. Deze 3D-printtechniek maakt de productie van biofilms met uitstekende mechanische eigenschappen mogelijk, waardoor biomimettische materialen kunnen worden vervaardigd.Draag bij het omgaan met deze bacteriën de juiste bescherming, zoals handschoenen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Onderzoek naar de driedimensionale stroomscheiding geïnduceerd door een model vocal fold poliep

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Drie-dimensionale afdrukken van thermoplastische materialen maken geautomatiseerd injectiespuit pompen met controle van de Feedback voor Microfluidic toepassingen

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-op-een-CD-platform voor het genereren van multicellulaire driedimensionale Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...