Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Ce travail a été appuyé par une subvention AOARD (no. FA2386-18-1-4059), l’Organisation néerlandaise de recherche scientifique (NWO/OCW) dans le cadre du programme frontières des nanosciences, et le programme des matériaux avancés NWO-NSFC (no 729.001.016). Les auteurs reconnaissent l’assistance en laboratoire de Ramon van der Valk et Roland Kieffer.

1. conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimante 3D
<ol><li>Retirez l’extrudeuse et le radiateur d’une imprimante 3D commerciale (table des matières) du cadre de l’imprimante et débranchez le câblage contrôlant ces éléments de la carte de circuit principal (figure 1a). Étant donné que le capteur qui contrôle la température de fonctionnement de l’imprimante doit être fonctionnel pour communiquer avec le logiciel de l’imprimante, retirez ...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Le protocole présenté ici pour l’impression 3D de biofilms d’ingénierie a deux étapes critiques. La première est la préparation de la surface d’impression de gélose, qui est le facteur le plus critique pour produire une résolution d’impression spécifique. Il est important de s’assurer que la surface d’impression est plane et que la pointe de la pipette sur la tête de tête est positionnée à la bonne hauteur de la surface. Si la surface n’est pas plane, la distance de travail changera pendant le ...

Il est actuellement de plus en plus nécessaire de développer des solutions respectueuses de l’environnement et durables pour la production de matériaux à motifs spatiaux, en raison du nombre croissant de marchés pour ces matériaux1. Cet article présente une méthode simple et économique pour la production de ces matériaux et offre donc un large éventail d’applications futures. La méthode présentée ici permet l’impression tridimensionnelle (3D) de structures spatialement modelés à l’aide d’une bio-encre contenant des bactéries vivantes. Les bactéries demeurent viables dans les structures imprimées pendant plus d’une semaine, ce qui permet aux bactéries d’effectuer des activités métaboliques naturelles ou machinées. Les bactéries imprimées peuvent ainsi produire et déposer les composants souhaités dans la structure imprimée, par exemple en créant un biofilm réticulé fonctionnel2.
Les méthodes traditionnelles de production de matériaux de pointe impliquent des dépenses énergétiques élevées (par exemple, des températures et/ou des pressions élevées) et peuvent produire de grandes quantités de déchets chimiques, souvent des substances toxiques nécessitant une utilisation extensive des coûts3 ,4. En revanche, plusieurs espèces bactériennes sont en mesure de produire des matériaux qui peuvent être facilement applicables dans diverses industries. Ces matériaux comprennent des polymères tels que les polyhydroxyalcanoates (PHA)5 ou poly (glycolide-co-lactide) (PGLA)6, la cellulose bactérienne7, les matériaux de béton bactérien8, les composites biomimétiques9, adhésifs à base d’amyloïdes10, ou des commutateurs électriques à base de bio11, entre autres. En outre, la production bactérienne de matériaux de valeur se déroule généralement à des températures et des pressions proches de l’environnement et dans des environnements aqueux, sans nécessiter ni produire de composés toxiques. Alors que la production de matériaux avec des bactéries a été démontrée dans la littérature et certaines applications industrielles ont déjà émergé12,13, une méthode fiable pour la structuration spatiale de ces matériaux reste un défi.
Cet article illustre une méthode simple de conversion d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante bactérienne 3D. Le protocole montre comment préparer une bio-encre contenant et soutenant les bactéries vivantes, ainsi que la façon de préparer des substrats sur lesquels l’impression 3D peut être effectuée. Cette méthode est appropriée à utiliser avec une variété de souches bactériennes naturelles et modifiées capables de produire des matériaux. Ces bactéries peuvent être réparties spatialement dans une structure imprimée en 3D et continuer leur activité métabolique, ce qui entraînera une distribution spatiale des matériaux désirés produits par les bactéries.
Cette méthode d’impression permet la fabrication additive de biofilms, d’agrégats de bactéries entourés d’une matrice extracellulaire autoproduite. Les biofilms sont des réseaux 3D hétérogènes dans lesquels les protéines, les polymères, les cellules bactériennes, l’oxygène et les nutriments sont tous spatialement structurés14. Sous la forme d’un biofilm, les bactéries présentent une résistance accrue aux antibiotiques et une robustesse structurelle, ce qui les rend difficiles à éradiquer des surfaces, y compris les cathéters médicaux et les implants. La clé des propriétés du biofilm, et aussi le plus grand défi pour la recherche sur le biofilm, semble être l’hétérogénéité des biofilms15,16,17. La production de biofilms modèles contrôlés spatialement est d’un intérêt particulier car elle permettrait de reproduire ou de régler les schémas spatiaux des composantes du biofilm, facilitant ainsi la compréhension du dépôt stable de biofilms sur pratiquement n’importe quelle surface dans nature.
Cet article présente une méthode pour la production de biofilms à l’aide d’hydrogels imprimés en 3D contenant des bactéries E. coli d’ingénierie qui produisent des protéines de biofilm en présence d’un inducteur, ainsi que des méthodes de vérification de la formation de biofilm2 . Les principaux composants de la matrice extracellulaire de ces biofilms sont les fibres amyloïdes18 qui contiennent des protéines CSGA auto-assemblées. Lorsque les bactéries E. coli sont induites pour exprimer des protéines CSGA, elles forment un biofilm modèle stable qui protège les cellules contre leur lavage hors de la surface d’impression. Un tel biofilm imprimé en 3D peut être contrôlé spatialement et peut servir d’outil de recherche utile pour l’investigation de la mécanique à plusieurs échelles de la structure de biofilm ou de la matériomique19. Ces biofilms sur mesure aideront à comprendre les principes de la formation des biofilms et leurs propriétés mécaniques, permettant ainsi de poursuivre la recherche sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques entre autres applications.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Les biofilms sont des agrégats de bactéries incorporées dans une matrice extracellulaire à motifs spatialement auto-produits. Les bactéries au sein d’un biofilm développent une résistance accrue aux antibiotiques, qui présente des dangers potentiels pour la santé, mais peuvent également être bénéfiques pour les applications environnementales telles que la purification de l’eau potable. Le développement ultérieur de thérapies antibactériennes et d’applications inspirées par le biofilm exigera le développement de méthodes reproductibles et ingéniables pour la création de biofilms. Récemment, une nouvelle méthode de préparation de biofilm utilisant une imprimante tridimensionnelle (3D) modifiée avec une encre bactérienne a été développée. Cet article décrit les étapes nécessaires à la construction de cette bio-imprimante 3D efficace et économique qui offre plusieurs applications dans le traitement des matériaux induits par les bactériotiques. Le protocole commence par une imprimante 3D commerciale adaptée dans laquelle l’extrudeuse a été remplacée par un distributeur d’encre bio relié à un système de pompe à seringue permettant un flux continu et contrôlable de bio-encre. Pour développer une bio-encre appropriée pour l’impression de biofilm, les bactéries d' Escherichia coli modifiées ont été suspendues dans une solution d’alginate, de sorte qu’elles solidifient en contact avec une surface contenant du calcium. L’inclusion d’un produit chimique inducteur dans le substrat d’impression entraîne l’expression de protéines de biofilm dans la bio-encre imprimée. Cette méthode permet l’impression 3D de divers modèles spatiaux composés de couches discrètes de biofilms imprimés. Ces biofilms contrôlés spatialement peuvent servir de systèmes modèles et peuvent trouver des applications dans de multiples domaines qui ont un impact large sur la société, y compris la prévention de la résistance aux antibiotiques ou la purification de l’eau potable, entre autres.

La première étape pour l’impression 3D réussie des biofilms est la conversion d’une imprimante 3D commerciale en bioimprimeur. Cette conversion est obtenue en enlevant l’extrudeuse et le radiateur de l’imprimante, conçus pour l’impression avec une encre polymérique, et en les remplaçant par des composants appropriés pour l’impression de bio-encres contenant des bactéries vivantes (figure 1a). L’extrudeuse est remplacée par une pointe de...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Cet article décrit une méthode de transformation d’une imprimante 3D commerciale à faible coût en une imprimante 3D bactérienne qui peut faciliter l’impression de biofilms à motifs. Tous les aspects nécessaires de la préparation du bioimprimeur et de la bio-encre sont décrits, ainsi que des méthodes de vérification pour évaluer la formation de biofilms.

Modelage tridimensionnel de biofilms d’ingénierie avec une Bioimprimeur de bricolage

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

La bioimpression 3D avec des bactéries est une technique nouvellement développée. Ce protocole offre un moyen facile de construire des biofilms conçus 3D imprimés avec des bactéries. Le principal avantage de cette technique est la capacité de produire des biofilms imprimés en 3D à l’aide d’une imprimante 3D maison peu coûteuse.Une application possible de notre imprimante 3D est de créer des biofilms modèles reproductibles qui peuvent être utilisés pour développer de nouvelles thérapies antibactériennes. Notre approche d’impression 3D peut être appliquée à tout type de bactéries compatible avec notre bioink à base d’alginate. La préparation du bioink et des substrats d’impression sont des procédures assez standard, tandis que le processus d’impression 3D, en particulier l’étalonnage de l’axe Z est une étape cruciale qui nécessite une certaine pratique.L’étalonnage de la hauteur d’accès définie influencera la résolution de notre imprimante 3D et dépend fortement de l’expérience personnelle. Cette procédure nécessite des ajustements manuels, et il est difficile d’être décrit dans un format écrit. Connectez une pointe de pipette de 200 microlitres à une longueur de tube en silicone, et montez la pointe pipette sur la tête d’extrème de l’imprimante 3D en remplacement de l’extrème d’origine.Ensuite, ajoutez quatre millilitres d’une solution de chlorure de calcium cinq molaires à 400 millilitres d’agar de 1% dissous dans le bouillon Luria-Bertani, et complétons-le avec les antibiotiques et les inducteurs appropriés. Ensuite, distribuez 20 millilitres de la solution d’agar LB dans chaque boîte de Pétri de 150 millimètres par 15 millimètres. Sécher le plat pendant 30 minutes à température ambiante, le couvercle à moitié ouvert.Préparer une solution d’alginate de sodium à 3 %, et la chauffer au point d’ébullition trois fois pour stériliser la solution. Ensuite, conservez la solution stérile à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée. Pour préparer la composante bactérienne du bioink, cultivez des bactéries E.coli transportant des plasmides pour l’expression constitutive du GFP dans 50 millilitres de milieu LB contenant des antibiotiques.Secouez la culture à 250 rPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la croissance nocturne de la culture, pelleter les bactéries pendant cinq minutes à 3220 fois la gravité, puis enlever le surnatant. Resuspendez la pastille bactérienne dans 10 millilitres de LB moyen, et ajouter 10 millilitres d’alginate de sodium 3%.Connectez l’imprimante 3D à un ordinateur et ouvrez le logiciel d’impression 3D. Cliquez sur le bouton Accueil pour les axes X, Y et Z, pour déplacer la tête d’impression vers sa position d’origine. Pour chaque impression, placez un substrat d’impression préparé sur un emplacement particulier sur le lit d’impression.Soulevez la tête d’impression à une hauteur de plus de 22 millimètres sous contrôle manuel, de sorte qu’elle ne heurte pas le bord de la boîte de Pétri pendant le mouvement. Placez la tête d’impression sur le dessus de la plaque et déplacez-la vers le bas jusqu’à ce que la pointe pipette entre en contact avec la surface d’impression. Assignez cette position z-axe comme Z1, la hauteur de la surface d’impression.Ensuite, levez la tête d’impression et déplacez-la manuellement à l’extérieur de la zone de la plaque. Si la distance de travail entre la tête d’impression et la surface de la plaque est définie comme Z2, entrez la hauteur de la surface d’impression ainsi que la distance de travail dans le programme d’impression comme valeur Z pendant l’impression. Chargez un fichier de code G préprogrammé contenant des commandes pour l’impression de la forme désirée.À chaque ligne de commande, la position de la tête d’impression peut être modifiée dans les axes X, Y ou Z. Assurez-vous d’entrer la valeur Z pendant toutes les étapes d’impression comme la hauteur de la surface d’impression ainsi que la distance de travail. Chargez le bioink liquide dans des seringues et montez-les dans la pompe à seringues du bioimprimeur 3D.Ensuite, réglez la vitesse d’extrusion à 0,3 millilitres par heure. Imprimez le bioink sur le substrat d’impression en cliquant sur le bouton Imprimer. Attendez de démarrer la pompe à seringues jusqu’à ce que l’impression ait commencé, et avant que la tête d’impression entre en contact avec la surface d’impression.Lors de l’impression, contrôlez le mouvement de la tête d’impression entièrement par le logiciel. Arrêtez la pompe à seringues dès que la tête d’impression arrive au dernier point d’impression, sinon l’excès de bioink tombera sur le substrat d’impression et réduira la résolution d’impression. Pour la construction de structures 3D, tous les mouvements de la tête d’impression sont contrôlés dans l’éditeur de code G.Pour augmenter la hauteur d’impression de la deuxième couche, tapez la hauteur d’impression de la première couche et augmentez la valeur Z du code de 0,2 millimètre. Par la suite, augmentez la valeur Z de 0,1 millimètre, lorsque vous vous déplacez vers une couche supérieure. Incuber les échantillons imprimés à température ambiante pendant trois à six jours pour permettre la production des composants du biofilm tels que les fibres de Curli.Ensuite, placez la plaque sur un scanner fluorescent et imagez les plaques. Pour dissoudre la matrice d’alginate, ajouter 20 millilitres d’une solution de citrate de sodium molaire de 0,5 molaire au pH 7, au substrat imprimé. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures tout en secouant à 30 rpm.Ensuite, jetez à nouveau le liquide et l’image des plaques, pour les comparer avec les images des plaques avant et après le traitement au citrate. Le bioimprimeur 3D peut créer des bactéries encapsulant les hydrogels dans une variété de formes bidimensionnelles et tridimensionnelles. Ces formes imprimées peuvent ensuite être utilisées pour évaluer si la formation du biofilm a été un succès ou si la matrice d’alginate est complètement dissoute à l’aide d’une solution de citrate de sodium.Dans le cas du bioink sans le plasmide inductible de production de Curli, le modèle imprimé a été complètement dissous après le traitement de citrate de sodium, signifiant qu’aucun réseau de Curli de biofilm ne s’était formé. Les bactéries contenant le plasmide inductible de production de Curli n’ont pas été dissoutes après traitement au citrate de sodium, ce qui indique que les bactéries imprimées ont été en mesure de former un réseau Curli suffisamment étendu pour stabiliser le modèle imprimé des bactéries. Pour construire des structures multicouques, des couches supplémentaires peuvent être imprimées en contrôlant l’éditeur de code G.L’augmentation du nombre de couches imprimées dans un échantillon a fait augmenter progressivement la largeur et la hauteur des structures imprimées. Lorsque E.coli a conçu pour produire de façon inductible des protéines Curli ont été imprimées dans des structures à plusieurs niveaux, le traitement du citrate de sodium n’a pas dissous les échantillons, tandis que les structures multicoucouches contenant des E.coli non productrices de Curli ont été dissoutes. Les parties les plus critiques de la procédure d’impression 3D sont l’étalonnage de l’axe Z, et la coordination du démarrage de l’impression et du démarrage de la pompe à seringues.Le bioink développé pour ce processus est assez doux, avec une faible dureté. D’autres modifications pourraient être apportées au bioink, afin de fournir et d’améliorer la stabilité mécanique. Cette technique d’impression 3D permet la production de biofilms aux excellentes propriétés mécaniques, ce qui peut permettre la fabrication de matériaux biomimétiques.Lorsque vous manipulez ces bactéries, portez une protection adéquate, comme des gants.

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