Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch einen AOARD-Zuschuss (Nr. FA2386-1-1-4059), die niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/OCW) im Rahmen des Programms "Frontiers of Nanoscience" und das Advanced Materials NWO-NSFC Programm (Nr. 729.001.016). Die Autoren bestätigen die Laborhilfe von Ramon van der Valk und Roland Kieffer.

1. Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen 3D-Bioprinter
<ol><li>Entfernen Sie den Extruder und die Heizung eines kommerziellen 3D-Druckers (Materialtabelle) aus dem Druckerrahmen und ziehen Sie die Verkabelung, die diese Elemente aus der Hauptleiterplatte (Abbildung 1A) steuert. Da der Sensor, der die Betriebstemperatur des Druckers steuert, funktionell sein muss, um mit der Druckersoftware zu kommunizieren, entfernen Sie aus der Drucksoftware den Algorithmus,...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. 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G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Das hier vorgestellte Protokoll für den 3D-Druck von technischen Biofilmen hat zwei kritische Schritte. Der erste ist die Vorbereitung der Agar-Druckfläche, die der kritischste Faktor für die Erzeugung einer bestimmten Druckauflösung ist. Wichtig ist, dass die Druckfläche flach ist und die Pipette-Spitze auf dem Druckkopf in der richtigen Höhe von der Oberfläche aus positioniert wird. Ist die Oberfläche nicht flach, ändert sich der Arbeitsabstand während des Druckprozesses. Wenn der Arbeitsabstand weniger als 0...

Aufgrund der wachsenden Zahl von Märkten für solche Materialien wird derzeit zunehmend umweltfreundliche und nachhaltige Lösungen für die Herstellung von räumlich gemusterten Materialienentwickelt. Dieser Artikel stellt eine einfache, kostengünstige Methode zur Herstellung solcher Materialien vor und bietet somit ein breites Spektrum an zukünftigen Anwendungen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht das dreidimensionale (3D) Drucken von räumlich gemusterten Strukturen mit einer Bio-Tinte, die lebende Bakterien enthält. Bakterien bleiben innerhalb der gedruckten Strukturen über eine Woche lebensfähig, so dass die Bakterien natürliche oder technische Stoffwechselaktivitäten ausführen können. Druckbakterien können so gewünschte Bauteile innerhalb der gedruckten Struktur herstellen und ablagern, zum Beispiel einen funktionellen, vernetzten Biofilm2.
Traditionelle Methoden zur Herstellung von fortschrittlichen Materialien sind mit hohen Energiekosten (z.B. hohe Temperaturen und/oder Drücke) verbunden und können große Mengen an chemischen Abfällen produzieren, oft giftige Stoffe, die eine kostenintensive Nutzung erfordern 3 ,4. Im Gegensatz dazu sind mehrere Bakterienarten in der Lage, Materialien herzustellen, die in verschiedenen Branchen leicht einsetzbar sind. Zu diesen Materialien gehören Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) 5 oder Poly (Glycolide-Co-lactide) (PGLA)6, bakterielle Zellulose7, bakterielle Betonmaterialien8, biomimetische Verbundstoffe9, Amyloid-basierte Klebstoffe10, oder biobasierte elektrische Schalter11, unter anderem. Darüber hinaus erfolgt die bakterielle Produktion wertvoller Materialien in der Regel bei nahezu Umgebungstemperaturen und Drücken und in wässrigen Umgebungen, ohne dass toxische Verbindungen benötigt oder produziert werden. Während die Herstellung von Materialien mit Bakterien in der Literatur nachgewiesen wurde und einige industrielle Anwendungen bereits12,13entstanden sind, bleibt eine zuverlässige Methode zur räumlichen Musternährung solcher Materialien eine Herausforderung.
Dieser Artikel zeigt eine geradlinige Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen 3D-Bakteriater-Drucker umzuwandeln. Das Protokoll zeigt, wie eine Bio-Tinte, die die lebenden Bakterien enthält und erhält, hergestellt werden kann, sowie wie Substrate hergestellt werden können, auf die der 3D-Druck durchgeführt werden kann. Diese Methode ist geeignet, um mit einer Vielzahl von natürlichen und technischen Bakterienstämmen in der Lage, Materialien zu produzieren. Diese Bakterien können räumlich in einer 3D-gedruckten Struktur verteilt werden und setzen ihre Stoffwechselaktivität fort, was zu einer räumlichen Verteilung der gewünschten Materialien der Bakterien führt.
Diese Druckmethode ermöglicht die additive Herstellung von Biofilmen, Aggregaten von Bakterien, die von einer selbst produzierten extrazellulären Matrix umgeben sind. Biofilme sind heterogene 3D-Netzwerke, in denen Proteine, Polymere, Bakterienzellen, Sauerstoff und Nährstoffe alle räumlich strukturiertsind. Während Bakterien in Form eines Biofilms eine erhöhte Antibiotikaresistenz und strukturelle Robustheit aufweisen, was es schwierig macht, sie von Oberflächen wie medizinischen Kathetern und Implantaten auszulöschen. Der Schlüssel zu Biofilm-Eigenschaften und auch die größte Herausforderung für die Biofilm-Forschung scheint die Heterogenität von Biofilmen15,16,17zu sein. Die Herstellung von räumlich gesteuerten Modellbiofilmen ist von besonderem Interesse, da sie es ermöglichen würde, die räumlichen Muster von Biofilm-Komponenten zu reproduzieren oder zu stimmen, was das Verständnis für die stabile Ablagerung von Biofilmen auf nahezu jeder Oberfläche in der natur.
Dieser Artikel stellt ein Verfahren zur Herstellung von Biofilmen vor, bei denen 3D-gedruckte Hydrogele mit technischen E . coli-Bakterien , die Biofilm-Proteine in Anwesenheit eines Indukters produzieren, sowie Methoden zur Überprüfung der Biofilmbildung verwendet werden. . Die wichtigsten extrazellulären Matrixkomponenten dieser Biofilme sind curli Amyloid-Fasern 18, die selbst zusammengesetzte CsgA-Proteine enthalten. Wenn die E . coli-Bakterien zum Ausdruck von CsgA-Proteinen verleitet werden, bilden sie einen stabilen Modellbiofilm, der die Zellen vor dem Abwaschen der Druckfläche schützt. Ein solcher 3D-gedruckter Biofilm kann räumlich gesteuert werden und als nützliches Forschungsinstrument zur Untersuchung von mehrstufigen Biofilm-Strukturfunktionsmechanik oder Materiomik19dienen. Diese maßgeschneiderten Biofilme werden das Verständnis der Prinzipien der Biofilmbildung und ihrer mechanischen Eigenschaften fördern und unter anderem die Mechanismen der Antibiotikaresistenz weiter erforschen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biofilme sind Aggregate von Bakterien, die in eine selbst produzierte, räumlich gemusterte extrazelluläre Matrix eingebettet sind. Bakterien innerhalb eines Biofilms entwickeln eine verbesserte Antibiotikaresistenz, die potenzielle gesundheitliche Gefahren birgt, aber auch für Umweltanwendungen wie die Reinigung von Trinkwasser von Vorteil sein kann. Die Weiterentwicklung von antibakteriellen Therapeutika und biofilm-inspirierten Anwendungen erfordert die Entwicklung reproduzierbarer, technischer Methoden zur Biofilmbildung. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Methode zur Biofilm-Aufbereitung mit einem modifizierten dreidimensionalen (3D) Drucker mit einer bakteriellen Tinte entwickelt. Dieser Artikel beschreibt die Schritte, die notwendig sind, um diesen effizienten, kostengünstigen 3D-Bioprinter zu bauen, der mehrere Anwendungen in der bakterieninduzierten Materialverarbeitung bietet. Das Protokoll beginnt mit einem angepassten kommerziellen 3D-Drucker, bei dem der Extruder durch einen Bio-Tinte-Spender ersetzt wurde, der an ein Spritzenpumpensystem angeschlossen ist und einen kontrollierbaren, kontinuierlichen Fluss von Bio-Tinte ermöglicht. Um eine für den Biofilmdruck geeignete Bio-Tinte zu entwickeln, wurden in einer Lösung aus Alginat konstruierte Escherichia coli-Bakterien aufgehängt, so dass sie sich in Kontakt mit einer kalziumhaltigen Oberfläche verfestigen. Die Aufnahme einer Induktionschemie in das Drucksubstrat treibt die Ausprägung von Biofilm-Proteinen in die gedruckte Bio-Tinte. Diese Methode ermöglicht den 3D-Druck verschiedener räumlicher Muster, die aus diskreten Schichten von gedruckten Biofilmen bestehen. Solche räumlich gesteuerten Biofilme können als Modellsysteme dienen und Anwendungen in mehreren Bereichen finden, die weitreichende Auswirkungen auf die Gesellschaft haben, unter anderem auf die Antibiotikaresistenz oder die Trinkwasserreinigung.

Der erste Schritt für den erfolgreichen 3D-Druck von Biofilmen ist die Umwandlung eines kommerziellen 3D-Druckers in einen Bioprinter. Diese Umstellung erfolgt durch das Entfernen des Extruders und der Heizung des Druckers, der für den Druck mit einer polymeren Tinte ausgelegt ist, und durch Komponenten, die für den Druck von Biofarb-Tinte mit lebenden Bakterien geeignet sind (Abbildung 1A). Der Extruder wird durch eine Pipette-Spitze (oder Spitzen, wenn m...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, einen kostengünstigen kommerziellen 3D-Drucker in einen bakteriellen 3D-Drucker zu verwandeln, der das Drucken von gemusterten Biofilmen erleichtern kann. Es werden alle notwendigen Aspekte der Zubereitung von Bioprinter und Bio-Tinte beschrieben, sowie Verifizierungsmethoden zur Beurteilung der Biofilme.

Dreidimensionales Pattern von Ingenieurbiofilmen mit einem Do-it-yourself-Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

3D-Bioprinting mit Bakterien ist eine neu entwickelte Technik. Dieses Protokoll bietet eine einfache Möglichkeit, technische Biofilme 3D mit Bakterien gedruckt zu konstruieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, 3D-gedruckte Biofilme mit einem kostengünstigen selbstgebauten 3D-Drucker herzustellen.Eine mögliche Anwendung unseres 3D-Druckers ist die Erstellung reproduzierbarer Modellbiofilme, mit denen neue antibakterielle Therapien entwickelt werden können. Unser 3D-Druckansatz kann auf jede Art von Bakterien angewendet werden, die mit unserem Alginat-basierten Bioink kompatibel sind. Die Vorbereitung des Bioinks und der Drucksubstrate sind ziemlich Standardverfahren, während der 3D-Druckprozess, insbesondere die Kalibrierung der Z-Achse, ein entscheidender Schritt ist, der einige Spractice erfordert.Die Kalibrierung der eingestellten Zugriffshöhe beeinflusst die Auflösung unseres 3D-Druckers und ist stark von persönlichen Erfahrungen abhängig. Dieses Verfahren erfordert manuelle Anpassungen, und es ist schwierig, in einem schriftlichen Format beschrieben zu werden. Schließen Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze an eine Länge von Silikonschläuchen an und montieren Sie die Pipettenspitze als Ersatz für den Originalextruder auf den Extruderkopf des 3D-Druckers.Als nächstes vier Milliliter einer fünf mollaren Calciumchloridlösung zu 400 Millilitern von 1%Agar in Luria-Bertani-Brühe gelöst hinzufügen, und ergänzen Sie es mit den entsprechenden Antibiotika und Induktoren. Dann 20 Milliliter der LB-Agarlösung in jede 150-Millimeter-mal 15-Millimeter-Petrischale geben. Trocknen Sie die Schale für 30 Minuten bei Raumtemperatur, mit dem Deckel halb geöffnet.Bereiten Sie eine 3%Natriumalginat-Lösung vor und erhitzen Sie sie dreimal bis zum Siedepunkt, um die Lösung zu sterilisieren. Dann lagern Sie die sterile Lösung bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet wird. Um die bakterielle Komponente des Bioinks vorzubereiten, wachsen E.coli-Bakterien, die Plasmide für die konstitutive GFP-Expression in 50 Milliliterlb-Medium tragen, das Antibiotika enthält.Schütteln Sie die Kultur bei 250 RPM und 37 Grad Celsius über Nacht. Nach dem über Nacht Wachstum der Kultur, pellet die Bakterien für fünf Minuten bei 3, 220 mal Schwerkraft und dann entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie das Bakterienpellet in 10 Milliliter LB Medium, und fügen Sie 10 Milliliter 3%Natriumalginat.Schließen Sie den 3D-Drucker an einen Computer an, und öffnen Sie die 3D-Drucksoftware. Klicken Sie auf die Schaltfläche Home für die X-, Y- und Z-Achse, um den Druckkopf an seine Heimatposition zu verschieben. Legen Sie für jeden Druck ein vorbereitetes Drucksubstrat auf eine bestimmte Stelle auf dem Druckbett.Heben Sie den Druckkopf unter manueller Kontrolle auf eine Höhe von über 22 Millimetern an, damit er während der Bewegung nicht mit der Kante der Petrischale kollidiert. Positionieren Sie den Druckkopf über der Oberseite der Platte, und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Pipettenspitze die Druckfläche kontaktiert. Weisen Sie diese Z-Achsenposition als Z1, die Höhe der Druckfläche, zu.Heben Sie anschließend den Druckkopf an und bewegen Sie ihn manuell außerhalb des Plattenbereichs. Wenn der Arbeitsabstand zwischen Druckkopf und Plattenoberfläche als Z2 definiert ist, geben Sie die Höhe der Druckfläche plus den Arbeitsabstand als Z-Wert während des Druckvorgangs in das Druckprogramm ein. Laden Sie eine vorprogrammierte G-Code-Datei mit Befehlen zum Drucken der gewünschten Form.In jeder Befehlszeile kann die Position des Druckkopfes in den X-, Y- und Z-Achsen geändert werden. Achten Sie darauf, den Z-Wert während aller Druckschritte als Höhe der Druckfläche plus Arbeitsabstand einzugeben. Laden Sie die flüssige Bioink in Spritzen und montieren Sie sie in die Spritzenpumpe des 3D-Biodruckers.Legen Sie dann die Extrusionsgeschwindigkeit auf 0,3 Milliliter pro Stunde fest. Drucken Sie den Bioink auf das Drucksubstrat, indem Sie auf die Schaltfläche Drucken klicken. Warten Sie, bis die Spritzenpumpe gestartet wird, bis der Druckvorgang begonnen hat und bevor der Druckkopf mit der Druckoberfläche in Berührung kommt.Steuern Sie während des Druckvorgangs die Druckkopfbewegung vollständig durch die Software. Stoppen Sie die Spritzenpumpe, sobald der Druckkopf am letzten Druckpunkt ankommt, da sonst überschüssige swertige Bioink auf das Drucksubstrat fällt und die Druckauflösung reduziert wird. Für den Aufbau von 3D-Strukturen werden alle Bewegungen des Druckkopfes im G-Code-Editor gesteuert.Um die Druckhöhe für die zweite Ebene zu erhöhen, geben Sie die Druckhöhe der ersten Ebene ein, und erhöhen Sie den Z-Wert im Code um 0,2 Millimeter. Erhöhen Sie anschließend den Z-Wert um 0,1 Millimeter, wenn Sie auf eine höhere Ebene wechseln. Inkubieren Sie die gedruckten Proben drei bis sechs Tage bei Raumtemperatur, um die Herstellung der Biofilmkomponenten wie Curlifasern zu ermöglichen.Legen Sie dann die Platte auf einen Fluoreszenzscanner und bebildern Sie die Platten. Um die Alginatmatrix aufzulösen, 20 Milliliter einer 0,5-molaren Natriumcitratlösung bei pH 7 auf das gedruckte Substrat geben. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für zwei Stunden, während sie bei 30 Umdrehungen pro Minute schüttelt.Dann entsorgen Sie die Flüssigkeit und stellen Sie die Platten wieder ab, um sie mit den Bildern der Platten vor und nach der Citratbehandlung zu vergleichen. Der 3D-Bioprinter kann Bakterien erzeugen, die Hydrogele in einer Vielzahl von zweidimensionalen und dreidimensionalen Formen verkapseln. Anhand dieser gedruckten Formen kann dann beurteilt werden, ob die Bildung von Biofilm erfolgreich war oder ob die Alginatmatrix mit einer Natriumcitratlösung vollständig gelöst wird.Bei Bioink ohne das induzierbare Curli-Produktionsplasmid wurde das gedruckte Muster nach der Natriumcitratbehandlung vollständig aufgelöst, was bedeutet, dass sich kein Biofilm-Curli-Netzwerk gebildet hatte. Die Bakterien, die das induzierbare Curli-Produktionsplasmid enthielten, wurden nach der Natriumcitratbehandlung nicht aufgelöst, was darauf hindeutet, dass die gedruckten Bakterien in der Lage waren, ein Curli-Netzwerk zu bilden, das so groß genug war, um das gedruckte Muster von Bakterien zu stabilisieren. Um mehrschichtige Strukturen zu konstruieren, können zusätzliche Ebenen gedruckt werden, indem der G-Code-Editor gesteuert wird.Durch die Erhöhung der Anzahl der gedruckten Schichten in einer Stichprobe stieg die Breite und Höhe der gedruckten Strukturen inkrementell an. Als E.coli zur induzierten Herstellung von Curli-Proteinen in mehrschichtige Strukturen gedruckt wurde, löste die Natriumcitratbehandlung die Proben nicht auf, während mehrschichtige Strukturen, die keine Curli produzierenden E.coli enthielten, aufgelöst wurden. Die wichtigsten Teile des 3D-Druckverfahrens sind die Kalibrierung der Z-Achse und die Koordination des Druckens und Startens der Spritzenpumpe.Der für diesen Prozess entwickelte Bioink ist ziemlich weich, mit geringer Zähigkeit. Weitere Änderungen an der Bioink könnten vorgenommen werden, um die mechanische Stabilität zu gewährleisten und zu verbessern. Diese 3D-Drucktechnik ermöglicht die Herstellung von Biofilmen mit hervorragenden mechanischen Eigenschaften, die die Herstellung biomimetischer Materialien ermöglichen können.Tragen Sie beim Umgang mit diesen Bakterien einen angemessenen Schutz, z. B. Handschuhe.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-und Drei-Dimensional Printing von Leitfähige Druckfarben

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Untersuchung der dreidimensionalen Strömungstrennung, die durch ein Modell Vocal Fold Polyp induziert wird

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Dreidimensionaler Druck von thermoplastischen Materialien erstellen automatisiert Spritzenpumpen mit Feedback-Kontrolle für mikrofluidische Anwendungen

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...