Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק AOARD (לא. FA2386-18-1-4059), הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/OCW) במסגרת הגבולות של תוכנית ננו מדעים, ואת החומרים המתקדמים NWO-NSFC תוכנית (No. 729.001.016). המחברים מכירים בסיוע מעבדה של רמון ואן דר ואלק ורולנד קיפר.

1. המרה של מדפסת תלת-ממדית מסחרית לביורימטר תלת-ממדי
<ol><li>הסר את הבלטת ממד ואת החימום של מדפסת תלת-ממדית מסחרית (טבלת חומרים) ממסגרת המדפסת, ונתק את החיווט השולט ברכיבים אלה מלוח המעגלים הראשי (איור 1a). מאחר שהחיישן השולט בטמפרטורה התפעולית של המדפסת צריך להיות פונק...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן עבור הדפסה תלת-ממדית של ביואיאמים מהונדסים מכיל שני שלבים קריטיים. ראשית הוא הכנת משטח ההדפסה אגר, שהוא הגורם הקריטי ביותר להפקת רזולוציית הדפסה ספציפית. חשוב לוודא שמשטח ההדפסה שטוח ושתיאור הפיפטה בראש ההדפסה ממוקם בגובה הנכון מהמשטח. אם המשטח אינו שטוח, מרחק העבודה י...

כיום קיים צורך הולך וגובר לפיתוח פתרונות ידידותיים לסביבה, לייצור חומרים בדוגמת spatially, בשל הרחבת מספר השווקים לחומרים מסוג1. מאמר זה מציג באופן פשוט, שיטה חסכונית לייצור חומרים כאלה ולכן מציע ספקטרום גדול של יישומים עתידיים. השיטה המוצגת כאן מאפשרת תלת מימדי (3D) הדפסה של מבנים בדוגמת spatially באמצעות הביו-דיו המכיל חיידקים חיים. החיידק נשאר בר קיימא בתוך המבנים המודפסים במשך שבוע, ומאפשר לחיידק לבצע פעילויות מטבוליות טבעיות או מהונדסים. חיידקים מודפסים יכולים ובכך לייצר ולהפקיד את הרכיבים הרצויים בתוך המבנה המודפס, לדוגמה יצירת ביוilm מקושרות פונקציונלי2.
שיטות מסורתיות לייצור חומרים מתקדמים כוללות הוצאות אנרגיה גבוהה (למשל, טמפרטורות גבוהות ו/או לחצים) והוא יכול לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית, לעתים קרובות חומרים רעילים הדורשים הוצאות מקיפות3 ,4. לעומת זאת, מינים חיידקיים רבים מסוגלים לייצר חומרים שניתן ליישום בקלות בתעשיות שונות. חומרים אלה כוללים פולימרים כגון פוליהידרוקסילאנוטים (PHA)5 או פולי (גליקולדה-co-lactide)6, בקטריות תאית7, חומרי בטון חיידקיים8, מרוכבים ביוציתים9, דבקים מבוססי עמילואיד10, או מתגי חשמל ביו מבוססי11, בין היתר. יתר על כן, ייצור חיידקי של חומרים יקרי ערך מתרחש בדרך כלל בטמפרטורות הסביבה הקרובה ולחצים ובסביבות מימית, ללא צורך או לייצר תרכובות רעילות. בזמן הפקת חומרים עם חיידקים כבר הפגינו בספרות וכמה יישומים תעשייתיים כבר התפתחה12,13, שיטה אמינה עבור הקפדה מרחבית של חומרים כאלה נשאר אתגר.
מאמר זה מדגים שיטה הישר קדימה להמרת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת בקטריאלי תלת-ממדית. הפרוטוקול מראה כיצד להכין את הביו-דיו המכיל ולקיים את החיידק החי, כמו גם כיצד להכין מצעים שעליהם ניתן לבצע את ההדפסה התלת-ממדית. שיטה זו מתאימה לשימוש עם מגוון זנים חיידקיים טבעיים ומהונדסים מסוגל לייצר חומרים. חיידקים אלה יכולים להיות מופץ מרחב בתוך מבנה מודפס 3d ועדיין להמשיך את פעילות חילוף החומרים שלהם, אשר תגרום התפלגות מרחבית של החומרים הרצוי המיוצר על ידי החיידק.
שיטת הדפסה זו מאפשרת ליצור מוספים של ביואמים, אגרגטים של חיידקים המוקפים במטריצה בעלת הפקה עצמית. ביואמים הם רשתות תלת-ממד הטרוגנית שבהן חלבונים, פולימרים, תאי בקטריאלי, חמצן וחומרים מזינים כולם מובנים ביותר14. בעוד בצורת ביוilm, החיידק מפגין עמידות לאנטיביוטיקה מוגברת וחוסן מבניים, מה שמקשה למגר ממשטחים כולל קטטרים ושתלים רפואיים. המפתח למאפייני ביוilm, וגם האתגר הגדול ביותר לחקר ביוilm, נראה כטרוגניות של ביוילאמים15,16,17. ייצור ביואילאמים של מודל מבוקר בשליטה מיוחדת הוא עניין מיוחד כפי שאפשר להתרבות או לכוונן את הדפוסים המרחביים של רכיבי הבייוilm, ולסייע להבנת התצהיר היציב של הביואמים כמעט בכל משטח ב טבע.
מאמר זה מציג שיטה לייצור ביויואמים באמצעות הידרו-מודפסים תלת-ממדיים המכילים חיידקים מהונדסים של E. coli המייצרים חלבונים של ביוilm בנוכחות סליל, כמו גם שיטות אימות של היווצרות ביוilm2 . מרכיבי מטריקס העיקריים של מטריצות של ביואמים אלה הם סיבי עמילואיד בסיבים18 המכילים חלבונים csga עצמית התאספו. כאשר מתוכננים חיידקים E. coli המושרה כדי לבטא חלבונים csga, הם יוצרים מודל יציב ביוilm המגן על התאים מפני שטף של משטח ההדפסה. כגון מודפס 3D המבנה יכול להיות נשלט על ידי שליטה והוא יכול לשמש כלי מחקר שימושי לחקירת מכניקה מבנה בקנה מידה רב של מבנים התפקוד או החומריות19. ביואמים אלה יסייעו להבנת עקרונות היווצרות הביוונים ותכונותיו המכאניות, המאפשרות מחקר נוסף למנגנונים של עמידות לאנטיביוטיקה בין יישומים אחרים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

ביוילאמים הם אגרגטים של חיידקים מוטבע בתוך מטריצה המיוצר בתבנית spatially-בדוגמת. חיידקים בתוך ביוilm לפתח עמידות לאנטיביוטיקה משופרת, אשר מהווה סכנות בריאותיות פוטנציאליות, אבל יכול גם להועיל ליישומים סביבתיים כגון טיהור של מי שתייה. ההתפתחות הנוספת של הtherapeutics אנטי בקטריאלי ויישומים השראה ביוilm ידרוש התפתחות של שיטות הנדסה, מהנדסים ליצירת ביוגרפיות. לאחרונה, התפתחה שיטה מקורית של הכנת ביוilm באמצעות מדפסת תלת-ממדית ששונתה (3D) עם דיו חיידקי. מאמר זה מתאר את השלבים הנחוצים לבניית הביוקטר היעיל והחסכוני הזה המציע מספר יישומים בעיבוד חומרים המושרה על ידי bacterially. הפרוטוקול מתחיל עם מדפסת תלת-ממד מותאם מותאמת מסחרית שבה החליף את הבלטת ממד עם מתקן ביו דיו המחובר למערכת משאבת מזרק המאפשרת זרימה מתמשכת ורציפה של ביו-דיו. לפיתוח ביו-דיו המתאים להדפסת ביוilm, בקטריה מהונדסים של חיידק האנציכיה הושעו בתמיסה של alginate, כך שהם לגבש במגע עם משטח המכיל סידן. הכללת כימיה מודפסת בתוך מצע ההדפסה כוננים ביטוי של חלבונים ביוilm בתוך הביו-דיו המודפס. שיטה זו מאפשרת הדפסה תלת ממדית של תבניות מרחבית שונות המורכבות משכבות בדידים של ביואמים מודפסים. כגון מערכות מבוקרת מסוג זה יכול לשמש כמערכות מודל והוא יכול למצוא יישומים בתחומים מרובים שיש להם השפעה רחבה על החברה, כולל מניעת עמידות לאנטיביוטיקה או שתיית מים לטיהור, בין היתר.

הצעד הראשון להדפסה תלת-ממדית מוצלחת של ביויואמים הוא המרת מדפסת תלת-ממדית מסחרית לתוך ביוריקטר. המרה זו מושגת על ידי הסרת מכבש הדפוס והחימום של המדפסת, המיועדים להדפסה עם דיו פולימרי, והחלפת אלה עם רכיבים המתאימים להדפסת ביו-דיו המכיל חיידקים חיים (איור 1A)...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

מאמר זה מתאר שיטה להפיכת מדפסת תלת-ממד מסחרית בעלות נמוכה למדפסת תלת-ממדית חיידקית, היכולה להקל על הדפסה של מאפייני בדוגמת מילוי. כל ההיבטים הנחוצים של הכנת הביופלקטר והביו-דיו מתוארים, כמו גם שיטות אימות להערכת היווצרות ביואילאמים.

המשך תלת-מימדי של ביוריאמים מהונדסים עם מעשה-זה-בעצמך ביורינטר

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

הדפסה ביולוגית תלת מימדית עם חיידקים היא טכניקה שפותחה לאחרונה. פרוטוקול זה מספק דרך קלה לבניית ביופילמים מהונדסים בתלת-ממד המודפסים באמצעות חיידקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר ביופילמים מודפסים בתלת-ממד באמצעות מדפסת תלת-ממד ביתית זולה.יישום אפשרי אחד של מדפסת 3D שלנו הוא ליצור biofilms מודל לשחזור שניתן להשתמש בהם כדי לפתח טיפולים אנטיבקטריאליים חדשים. ניתן ליישם את גישת ההדפסה בתלת-ממד שלנו על כל סוג של חיידקים התואמים לביו-ינק מבוסס האלגינט שלנו. הכנת הביו-ינק ומצעי ההדפסה הם הליכים סטנדרטיים למדי, בעוד שתהליך ההדפסה בתלת-ממד, במיוחד הכיול של ציר Z, הוא צעד חיוני הדורש תרגול מסוים.כיול גובה הגישה שנקבע ישפיע על הרזולוציה של מדפסת תלת-ממד שלנו, ותלוי מאוד בחוויה האישית. הליך זה דורש התאמות ידניות, וקשה לתארו בתבנית כתובה. חבר קצה פיפיאט של 200 מיקרוליטר לאורך של צינורות סיליקון, והתקע את קצה הפיפסט על ראש האלט של המדפסת תלת-ממד כתחליף לאלט המקורי.לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של תמיסת סידן כלוריד טוחנת ל-400 מיליליטר של 1%agar מומסים במרק לוריא-ברטאני, והשלמו אותו עם האנטיביוטיקה והמשרצים המתאימים. לאחר מכן, לוותר על 20 מיליליטר של פתרון אגר LB לתוך כל 150 מילימטר על ידי 15 מילימטר צלחת פטרי. יבש את המנה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, עם המכסה חצי פתוח.הכינו תסכול אלגינט של 3%, וחמו אותו עד לנקודת הרתיחה שלוש פעמים כדי לעקר את הפתרון. לאחר מכן, לאחסן את הפתרון סטרילי בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא משמש. כדי להכין את המרכיב החיידקי של הביוינק, לגדל חיידקי E.coli הנושאים פלסמידים לביטוי GFP מכובע ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל אנטיביוטיקה.לנער את התרבות ב 250 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר צמיחה לילה של התרבות, גלולה את החיידקים במשך חמש דקות ב 3, 220 פעמים כוח הכבידה ולאחר מכן להסיר את העל טבעי. תוסיפו את גלולת החיידקים ב-10 מיליליטר של מדיום LB, ותוסיפו 10 מיליליטר של 3%נתרן אלגינט.חבר את המדפסת בתלת-ממד למחשב ופתח את תוכנת ההדפסה בתלת-ממד. לחץ על לחצן בית עבור הצירים X, Y ו- Z, כדי להזיז את ראש ההדפסה למיקום הבית שלו. עבור כל הדפסה, מקם מצע הדפסה מוכן על מיקום מסוים על מיטת ההדפסה.הרם את ראש ההדפסה לגובה של מעל 22 מילימטרים תחת שליטה ידנית, כך שהוא לא יתנגש בקצה צלחת פטרי במהלך התנועה. מקם את ראש ההדפסה מעל החלק העליון של הלוח והזז אותו כלפי מטה עד שטיפ הפיפסה יוצר קשר עם משטח ההדפסה. הקצה מיקום ציר Z זה כ- Z1, גובה משטח ההדפסה.לאחר מכן, הרימו את ראש ההדפסה והזיזו אותו ידנית מחוץ לאזור הלוח. אם מרחק העבודה בין ראש ההדפסה למשטח הלוח מוגדר כ- Z2, הזן את גובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה לתוכנית ההדפסה כערך Z במהלך ההדפסה. טען קובץ G-code מתוכנת מראש המכיל פקודות להדפסת הצורה הרצויה.בכל שורת פקודה, ניתן לשנות את מיקום ראש ההדפסה בצירים X, Y ו- Z. הקפד להזין את ערך Z במהלך כל שלבי ההדפסה כגובה משטח ההדפסה בתוספת מרחק העבודה. לטעון את הביונק הנוזלי למזרקים ולהוות אותם במשאבת המזרק של bioprinter 3D.לאחר מכן, הגדר את מהירות ההבלטה ל-0.3 מיליליטר לשעה. הדפס את הביו-ינק על מצע ההדפסה על-ידי לחיצה על לחצן הדפס. המתן להתחלת משאבת המזרק עד לאחר תחילת ההדפסה ולפני שראש ההדפסה בא במגע עם משטח ההדפסה.במהלך ההדפסה, שלוט בתנועת ראש ההדפסה לחלוטין על-ידי התוכנה. עצרו את משאבת המזרק ברגע שראש ההדפסה יגיע לנקודת ההדפסה האחרונה, אחרת עודף הביונק ייפול על מצע ההדפסה ויפחית את רזולוציית ההדפסה. לבניית מבנים תלת-מימדיים, כל התנועות של ראש ההדפסה נשלטות בעורך G-code.להגדלת גובה ההדפסה של השכבה השניה, הקלדת גובה ההדפסה של השכבה הראשונה והגדלת ערך Z בקוד ב- 0.2 מילימטרים. לאחר מכן, הגדל את ערך Z ב- 0.1 מילימטר, בעת מעבר לשכבה גבוהה יותר. הדגירה את הדגימות המודפסות בטמפרטורת החדר במשך שלושה עד שישה ימים כדי לאפשר את הייצור של רכיבי biofilm כגון סיבי Curli.לאחר מכן, מניחים את הצלחת על סורק פלואורסצנטי ומדמים את הלוחות. כדי להמיס את מטריצת האלגינט, הוסיפו 20 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט 0.5 טוחנת ב-pH 7, למצע המודפס. הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים תוך כדי רעידות ב 30 סל"ד.לאחר מכן, להשליך את הנוזל ואת התמונה את הצלחות שוב, כדי להשוות עם התמונות של הצלחות לפני ואחרי הטיפול ציטראט. הביו-הדפס התלת מימדי יכול ליצור הידרוג'לים עוטפים חיידקים במגוון צורות דו-ממדיות ותלת מימדיות. צורות מודפסות אלה ניתן להשתמש כדי להעריך אם היווצרות של ביופילם היה מוצלח או אם מטריצת אלגינט מומס לחלוטין באמצעות פתרון נתרן ציטראט.במקרה של bioink ללא פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה, הדפוס המודפס הומס לחלוטין לאחר הטיפול נתרן ציטראט, הממחין כי לא נוצרה רשת תלתל biofilm. החיידקים המכילים את פלסמיד ייצור Curli בלתי ניתן לאכילה לא הומס לאחר טיפול נתרן ציטראט, המציין כי החיידקים המודפסים הצליחו ליצור רשת Curli נרחב מספיק כדי לייצב את הדפוס המודפס של חיידקים. לבניית מבנים מרובי שכבות, ניתן להדפיס שכבות נוספות על-ידי שליטה בעורך G-code.הגדלת מספר השכבות המודפסות בדגימה גרמה לרוחב וגובה המבנים המודפסים לגדול בהדרגה. כאשר E.coli תוכנן לייצר באופן בלתי הפיך חלבונים Curli הודפסו לתוך מבנים רב שכבתיים, טיפול ציטראט נתרן לא להמיס את הדגימות, ואילו מבנים רב שכבתיים המכילים שאינם Curli לייצר E.coli היו מומסים. החלקים הקריטיים ביותר של הליך ההדפסה בתלת-ממד הם הכיול של ציר Z, והתיאום של הפעלת ההדפסה והפעלת משאבת המזרק.הביוינק שפותח עבור תהליך זה הוא רך למדי, עם קשיחות נמוכה. שינוי נוסף יכול להתבצע bioink, על מנת לספק ולשפר את היציבות המכנית. טכניקת הדפסה תלת מימדית זו מאפשרת ייצור ביופילמים בעלי תכונות מכניות מצוינות, אשר עשויים לאפשר ייצור חומרים ביומימטיים.בעת טיפול בחיידקים אלה, ללבוש הגנה נאותה, כגון כפפות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

תלת מימדי הדפסה של חומרים תרמופלסטיים כדי ליצור אוטומטית משאבות מזרק עם בקרת משוב עבור יישומים Microfluidic

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...