Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

इस कार्य को एक एकार्ड ग्रांट (सं.) द्वारा समर्थित किया गया था । FA2386-18-1-4059), नेनो विज्ञान कार्यक्रम के फ्रंटियर्स के भाग के रूप में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए नीदरलैंड संगठन (NWO/OCW), और उंनत सामग्री NWO-NSFC कार्यक्रम (No. 729.001.016) । लेखकों रेमन वान der Valk और रोलाण्ड Kieffer की प्रयोगशाला सहायता स्वीकार करते हैं ।

1. एक 3 डी बायोप्रिंटर में एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर के रूपांतरण
<ol><li>प्रिंटर फ्रेम से एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर (सामग्री की मेज) के extruder और हीटर निकालें, और मुख्य सर्किट बोर्ड से इन तत्वों को नियंत्रित ?...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. 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G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

इंजीनियर बायोफिल्म्स के 3डी प्रिंटिंग के लिए यहां पेश किए गए प्रोटोकॉल में दो अहम कदम हैं । सबसे पहले आगार छपाई सतह की तैयारी है, जो एक विशिष्ट मुद्रण संकल्प के उत्पादन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है । य?...

वर्तमान में एक बढ़ती जरूरत है spatially-नमूनों सामग्री के उत्पादन के लिए पर्यावरण के अनुकूल, टिकाऊ समाधान विकसित करने के लिए, इस तरह की सामग्री के लिए बाजार के विस्तार की संख्या के कारण1। यह लेख इस तरह की सामग्री के उत्पादन के लिए एक सरल, किफायती तरीका प्रस्तुत करता है और इसलिए भविष्य के अनुप्रयोगों के एक बड़े स्पेक्ट्रम की पेशकश । विधि यहां प्रस्तुत की अनुमति देता है तीन आयामी (3 डी) spatially-patterned संरचनाओं के मुद्रण एक जैव-स्याही युक्त रहने वाले बैक्टीरिया का उपयोग कर । बैक्टीरिया एक सप्ताह से अधिक के लिए मुद्रित संरचनाओं के भीतर व्यवहार्य रहते हैं, बैक्टीरिया को प्राकृतिक या इंजीनियर चयापचय गतिविधियों प्रदर्शन करने के लिए सक्षम । मुद्रित बैक्टीरिया इस प्रकार उत्पादन और मुद्रित संरचना के भीतर वांछित घटक जमा कर सकते हैं, उदाहरण के लिए एक कार्यात्मक पार से जुड़े biofilm2बनाने ।
उंनत सामग्री के उत्पादन के लिए पारंपरिक तरीकों उच्च ऊर्जा व्यय शामिल (जैसे, उच्च तापमान और/या दबाव) और रासायनिक अपशिष्ट की बड़ी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं, अक्सर विषाक्त पदार्थ है कि लागत-व्यापक उपयोग की आवश्यकता3 ,4. इसके विपरीत, एकाधिक बैक्टीरियल प्रजातियों सामग्री है कि विभिंन उद्योगों में आसानी से लागू किया जा सकता है का उत्पादन करने में सक्षम हैं । इन सामग्रियों में पॉलीहाइड्रॉक्सीऐल्कानोट्स (फ़्लिपकार्ट)5 या पॉली (ग्लाइकोलाइड-सह-लैक्टाइड) (पीजीएलए)6, बैक्टीरियल सेलुलोस7, बैक्टीरियल कंक्रीट मैटेरियल्स8, बायोमिकल कंपोजिट9, जैसे पॉलिमर शामिल हैं । एमिलॉयड आधारित चिपकने वाले10, या जैव आधारित विद्युत स्विच11, दूसरों के बीच में । इसके अलावा, मूल्यवान सामग्री के जीवाणु उत्पादन आमतौर पर लगभग परिवेश तापमान और दबाव और जलीय वातावरण में जगह लेता है, की आवश्यकता होती है या जहरीले यौगिकों के उत्पादन के बिना. जबकि साहित्य में बैक्टीरिया के साथ सामग्री का उत्पादन किया गया है और कुछ औद्योगिक अनुप्रयोगों पहले से ही12,13उभरा है, स्थानिक ऐसी सामग्रियों के नमूनों के लिए एक विश्वसनीय तरीका एक चुनौती बनी हुई है ।
यह लेख एक 3 डी बैक्टीरियल प्रिंटर में एक कम लागत वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर परिवर्तित करने के लिए एक सीधे आगे की विधि प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे तैयार करने के लिए एक जैव स्याही युक्त और जीवित बैक्टीरिया को बनाए रखने, साथ ही कैसे substrates तैयार करने के लिए जिस पर 3 डी मुद्रण प्रदर्शन किया जा सकता है । इस विधि प्राकृतिक और इंजीनियर बैक्टीरियल उपभेदों सामग्री का उत्पादन करने में सक्षम की एक किस्म के साथ प्रयोग करने के लिए उपयुक्त है । इन बैक्टीरिया स्थानिक रूप एक 3 डी मुद्रित संरचना के भीतर वितरित किया जा सकता है और अभी भी उनकी चयापचय गतिविधि जारी है, जो वांछित बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित सामग्री का एक स्थानिक वितरण में परिणाम होगा ।
इस मुद्रण विधि biofilms के additive के निर्माण में सक्षम बनाता है, एक आत्म उत्पादित extracellular मैट्रिक्स से घिरे बैक्टीरिया के समुच्चय । Biofilms विषमांगी 3 डी नेटवर्क है जिसमें प्रोटीन, पॉलिमर, जीवाणु कोशिकाओं, ऑक्सीजन, और पोषक तत्वों सभी स्थानिक रूप14संरचित कर रहे हैं । जबकि एक biofilm के रूप में, जीवाणु एक वृद्धि हुई एंटीबायोटिक प्रतिरोध और संरचनात्मक मजबूती, उंहें चिकित्सा कैथेटर और प्रत्यारोपण सहित सतहों से उंमूलन मुश्किल बना प्रदर्शन । Biofilm संपत्तियों के लिए महत्वपूर्ण है, और भी biofilm अनुसंधान के लिए सबसे बड़ी चुनौती है, biofilm की विविधता15,16,17लगता है । स्थानिक-नियंत्रित मॉडल बायोफिल्ंस का उत्पादन विशेष रूचि का होता है, क्योंकि यह जैव-फिल्म घटकों के आकाशीय पैटर्न को या तो पुन: उत्पादित करने या समस्वरण के लिए अनुमति देगा, लगभग किसी भी सतह पर बायोफिल्ंस के स्थिर जमाव को समझने में सहायता करेगा । प्रकृति.
इस अनुच्छेद 3 डी-मुद्रित hydrogels युक्त इंजीनियर ई. कोलाई बैक्टीरिया है कि एक प्रेरक की उपस्थिति में biofilms प्रोटीन का उत्पादन, साथ ही biofilms निर्माण के सत्यापन के तरीकों का उपयोग कर biofilms के उत्पादन के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है2 . इन जैव-फिल्मों के प्रमुख कोशिकामय मैट्रिक्स घटक हैं कर्ली एमीलॉयड फाइबर18 जिनमें स्व-संयोजित सीएसजीए प्रोटीन होते हैं । जब इंजीनियर ई. कोलाई बैक्टीरिया csga प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं, वे एक स्थिर मॉडल biofilm कि कोशिकाओं की रक्षा के खिलाफ मुद्रण सतह से धोया जा रहा है फार्म । इस तरह के एक 3 डी मुद्रित biofilm और स्थानिक रूप नियंत्रित किया जा सकता है multiscale biofilm संरचना की जांच के लिए एक उपयोगी अनुसंधान उपकरण के रूप में सेवा कर सकते है-फंक्शन यांत्रिकी या भौतिकविज्ञान19। ये bespoke biofilms biofilms गठन और उनके यांत्रिक गुणों के सिद्धांतों की समझ सहायता, अंय अनुप्रयोगों के बीच एंटीबायोटिक प्रतिरोध के तंत्र में आगे अनुसंधान को सक्षम करेगा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biofilms एक स्व में एंबेडेड बैक्टीरिया का समुच्चय है spatially नमूनों extracellular मैट्रिक्स का उत्पादन किया । एक biofilm के भीतर बैक्टीरिया बढ़ाया एंटीबायोटिक प्रतिरोध है, जो संभावित स्वास्थ्य खतरों बन गया है विकसित, लेकिन यह भी पीने के पानी की शुद्धि के रूप में पर्यावरण अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकता है । विरोधी बैक्टीरियल चिकित्सा और biofilm प्रेरित अनुप्रयोगों के आगे विकास, biofilm निर्माण के लिए प्रतिलिपि बनाने योग्य, इंजीनियनीय तरीकों के विकास की आवश्यकता होगी । हाल ही में, biofilm तैयारी का एक उपंयास विधि एक संशोधित तीन आयामी एक जीवाणु स्याही के साथ (3D) प्रिंटर का उपयोग कर विकसित किया गया है । यह लेख इस कुशल, कम लागत 3 डी बायोप्रिंटर कि जीवाणुजनित-प्रेरित सामग्री प्रसंस्करण में कई अनुप्रयोगों प्रदान करता है बनाने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है । प्रोटोकॉल एक अनुकूलित वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर जिसमें extruder एक जैव स्याही एक सिरिंज पंप एक नियंत्रणीय सक्षम, जैव स्याही के सतत प्रवाह को सक्रिय करने के लिए कनेक्ट मशीन के साथ प्रतिस्थापित किया गया है के साथ शुरू होता है । बायोफिल्म प्रिंटिंग के लिए उपयुक्त बायो-इंक को विकसित करने के लिए, इंजीनियर एचेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया को एल्जिनेट के सॉल्यूशन में निलंबित कर दिया गया, ताकि वे कैल्शियम युक्त सतह के संपर्क में जम जाएं । मुद्रण सब्सट्रेट के भीतर एक प्रेरक रसायन का समावेश biofilm प्रोटीन की अभिव्यक्ति मुद्रित जैव स्याही के भीतर ड्राइव । इस विधि मुद्रित biofilms के असतत परतों से बना विभिन्न स्थानिक पैटर्न के 3 डी मुद्रण के लिए सक्षम बनाता है । इस तरह के spatially नियंत्रित biofilms मॉडल सिस्टम के रूप में सेवा कर सकते है और कई क्षेत्रों में अनुप्रयोगों है कि समाज पर एक व्यापक प्रभाव एंटीबायोटिक प्रतिरोध की रोकथाम या पीने के पानी के शुद्धिकरण सहित, में मिल सकता है, दूसरों के बीच ।

Biofilms के सफल 3D मुद्रण के लिए पहला कदम एक bioprinter में एक वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर परिवर्तित है । इस रूपांतरण प्रिंटर के बाहर निकालना और हीटर, एक बहुलक स्याही के साथ मुद्रण के लिए डिजाइन को हटाने के द्व?...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

इस लेख में एक कम लागत वाणिज्यिक 3 डी प्रिंटर एक जीवाणु 3D प्रिंटर है कि नमूनों biofilms के मुद्रण की सुविधा कर सकते में बदलने की एक विधि का वर्णन है । बायोफिल्मस और बायो-इंक को तैयार करने के सभी आवश्यक पहलुओं का वर्णन किया गया है, साथ ही बायोफिल्म्स के गठन का आकलन करने के लिए सत्यापन के तरीके भी बताए गए हैं ।

एक के साथ इंजीनियर Biofilms के तीन आयामी Patterning यह अपने आप Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

बैक्टीरिया के साथ 3डी बायोप्रिंटिंग एक नई विकसित तकनीक है। यह प्रोटोकॉल बैक्टीरिया के साथ मुद्रित इंजीनियर बायोफिल्म्स 3 डी के निर्माण का एक आसान तरीका प्रदान करता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ एक सस्ती घर निर्मित 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके 3 डी मुद्रित बायोफिल्म्स का उत्पादन करने की क्षमता है।हमारे 3 डी प्रिंटर का एक संभावित अनुप्रयोग प्रजनन मॉडल बायोफिल्म बनाना है जिसका उपयोग नए जीवाणुरोधी उपचारों को विकसित करने के लिए किया जा सकता है। हमारा 3डी प्रिंटिंग दृष्टिकोण किसी भी प्रकार के बैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है जो हमारे एल्गिनेट आधारित बायोइंक के साथ संगत है। बायोइंक और प्रिंटिंग सब्सट्रेट्स की तैयारी काफी मानक प्रक्रियाएं हैं, जबकि 3डी प्रिंटिंग प्रक्रिया, विशेष रूप से जेड-एक्सिस का अंशांकन एक महत्वपूर्ण कदम है जिसके लिए कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है।सेट एक्सेस ऊंचाई का अंशांकन हमारे 3 डी प्रिंटर के संकल्प को प्रभावित करेगा, और दृढ़ता से व्यक्तिगत अनुभव पर निर्भर है। इस प्रक्रिया को मैनुअल समायोजन की आवश्यकता होती है, और लिखित प्रारूप में वर्णित होना मुश्किल है। सिलिकॉन ट्यूबिंग की लंबाई के लिए एक 200 माइक्रोलिटर पिपेट टिप कनेक्ट करें, और मूल एक्सट्रूडर के प्रतिस्थापन के रूप में 3 डी प्रिंटर के एक्सट्रूडर हेड पर पिपेट टिप को माउंट करें।इसके बाद, लुरिया-बर्टानी शोरबा में भंग किए गए 1% एगर के 400 मिलीलीटर में पांच मोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान के चार मिलीलीटर जोड़ें, और इसे उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं और प्रेरकों के साथ पूरक करें। फिर, 15 मिलीमीटर पेट्री डिश द्वारा प्रत्येक 150 मिलीमीटर में एलबी आगर समाधान के 20 मिलीलीटर वितरित करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पकवान सूखी, ढक्कन आधा खुला के साथ ।3% सोडियम एल्गिनेट समाधान तैयार करें, और समाधान को स्टरलाइज करने के लिए इसे उबलते बिंदु पर तीन बार गर्म करें। फिर, बाँझ समाधान को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि इसका उपयोग न हो जाए। बायोइंक के जीवाणु घटक को तैयार करने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं युक्त एलबी माध्यम के 50 मिलीलीटर में संविलियन जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड ले जाने वाले ई कोलाई बैक्टीरिया को विकसित करें।रात भर २५० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को हिलाएं । संस्कृति के रातोंरात विकास के बाद, बैक्टीरिया को 3, 220 बार गुरुत्वाकर्षण पर पांच मिनट के लिए गोली दें और फिर सुपरनेट को हटा दें। एलबी माध्यम के 10 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली को फिर से खर्च करें, और 3% सोडियम एल्गिनेट के 10 मिलीलीटर जोड़ें।3D प्रिंटर को कंप्यूटर से कनेक्ट करें, और 3डी प्रिंटिंग सॉफ्टवेयर खोलें। प्रिंट हेड को अपने घर की स्थिति में ले जाने के लिए एक्स, वाई और जेड अक्षों के लिए होम बटन पर क्लिक करें। प्रत्येक प्रिंट के लिए, प्रिंटिंग बेड पर एक विशेष स्थान पर एक तैयार प्रिंटिंग सब्सट्रेट रखें।प्रिंट हेड को मैनुअल नियंत्रण के तहत 22 मिलीमीटर से अधिक की ऊंचाई तक उठाएं, ताकि यह आंदोलन के दौरान पेट्री डिश के किनारे से न टकराए। प्लेट के शीर्ष पर प्रिंट सिर की स्थिति और इसे नीचे ले जाने जब तक पिपेट टिप मुद्रण सतह से संपर्क करता है। इस जेड-एक्सिस स्थिति को Z1 के रूप में असाइन करें, प्रिंटिंग सतह की ऊंचाई।इसके बाद, प्रिंट हेड उठाएं और मैन्युअल रूप से इसे प्लेट क्षेत्र के बाहर ले जाएं। यदि प्रिंट सिर और प्लेट की सतह के बीच काम करने की दूरी को Z2 के रूप में परिभाषित किया गया है, तो मुद्रण सतह की ऊंचाई के साथ-साथ प्रिंटिंग के दौरान जेड मूल्य के रूप में प्रिंटिंग कार्यक्रम में काम करने की दूरी दर्ज करें। वांछित आकार को प्रिंट करने के लिए आदेशों वाली एक पूर्व-प्रोग्राम की गई जी-कोड फाइल लोड करें।प्रत्येक कमांड लाइन पर, एक्स, वाई, और या जेड अक्षों में प्रिंट हेड की स्थिति को बदला जा सकता है। मुद्रण सतह की ऊंचाई के साथ-साथ कामकाजी दूरी के रूप में सभी मुद्रण चरणों के दौरान जेड मूल्य इनपुट करना सुनिश्चित करें। लिक्विड बायोइंक को सीरिंज में लोड करें और उन्हें 3डी बायोप्रिंटर के सिरिंज पंप में माउंट करें।फिर, एक्सट्रूज़न की गति को 0.3 मिलीलीटर प्रति घंटे तक सेट करें। प्रिंट बटन पर क्लिक करके प्रिंटिंग सब्सट्रेट पर बायोइंक प्रिंट करें। प्रिंटिंग शुरू होने के बाद तक सिरिंज पंप शुरू करने के लिए प्रतीक्षा करें, और प्रिंट सिर प्रिंटिंग सतह के संपर्क में आने से पहले।मुद्रण के दौरान, प्रिंट हेड मूवमेंट को पूरी तरह से सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित करें। जैसे ही प्रिंट हेड प्रिंटिंग के अंतिम बिंदु पर आता है, सिरिंज पंप बंद हो जाता है, अन्यथा अतिरिक्त बायोइंक प्रिंटिंग सब्सट्रेट पर छोड़ देगा और प्रिंटिंग संकल्प को कम कर देगा। 3 डी संरचनाओं के निर्माण के लिए, प्रिंट हेड के सभी आंदोलनों को जी-कोड संपादक में नियंत्रित किया जाता है।दूसरी परत के लिए मुद्रण ऊंचाई बढ़ाने के लिए, पहली परत की मुद्रण ऊंचाई में टाइप करें, और कोड में जेड मूल्य को 0.2 मिलीमीटर बढ़ाएं। इसके बाद, एक उच्च परत में जाने पर जेड मूल्य में 0.1 मिलीमीटर की वृद्धि करें। कर्ली फाइबर जैसे बायोफिल्म घटकों के उत्पादन की अनुमति देने के लिए तीन से छह दिनों के लिए कमरे के तापमान पर मुद्रित नमूनों को इनक्यूबेट करें।फिर, प्लेट को फ्लोरोसेंट स्कैनर पर रखें और प्लेटों को छवि दें। एल्गिनेट मैट्रिक्स को भंग करने के लिए, पीएच 7 पर 0.5 मोलर सोडियम साइट्रेट समाधान के 20 मिलीलीटर को मुद्रित सब्सट्रेट में जोड़ें। 30 आरपीएम पर मिलाते हुए दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट।फिर, तरल को त्यागें और प्लेटों को फिर से चित्रित करें, साइट्रेट उपचार से पहले और बाद में प्लेटों की छवियों के साथ तुलना करें। 3 डी बायोप्रिंटर विभिन्न प्रकार के दो-आयामी और त्रि-आयामी आकारों में हाइड्रोगेल को एनकैप्सुलेट करने वाले बैक्टीरिया बना सकता है। इन मुद्रित आकृतियों का उपयोग तब यह आकलन करने के लिए किया जा सकता है कि बायोफिल्म का गठन सफल रहा या यदि सोडियम साइट्रेट समाधान का उपयोग करके एल्गिनेट मैट्रिक्स पूरी तरह से भंग हो जाता है।अकीय कर्ली उत्पादन प्लाज्मिड के बिना बायोइंक के मामले में, सोडियम साइट्रेट उपचार के बाद मुद्रित पैटर्न पूरी तरह से भंग हो गया था, यह दर्शाता है कि कोई बायोफिल्म कर्ली नेटवर्क नहीं बना था। सोडियम साइट्रेट उपचार के बाद अकांक्षित कर्ली उत्पादन प्लाज्मिड युक्त बैक्टीरिया को भंग नहीं किया गया था, यह दर्शाता है कि मुद्रित बैक्टीरिया बैक्टीरिया के मुद्रित पैटर्न को स्थिर करने के लिए पर्याप्त रूप से एक कर्ली नेटवर्क बनाने में सक्षम थे। बहुस्तरीय संरचनाओं का निर्माण करने के लिए, जी-कोड संपादक को नियंत्रित करके अतिरिक्त परतों को मुद्रित किया जा सकता है।एक नमूने में मुद्रित परतों की संख्या बढ़ाने के कारण मुद्रित संरचनाओं की चौड़ाई और ऊंचाई संवर्द्धित रूप से बढ़ गई। जब ई. कोलाई को कर्ली प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया गया था, तो सोडियम साइट्रेट उपचार ने नमूनों को भंग नहीं किया, जबकि गैर कर्ली उत्पादक ई.कोलाई युक्त बहुस्तरीय संरचनाएं भंग कर दी गई थीं। 3 डी प्रिंटिंग प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण हिस्से जेड-एक्सिस के अंशांकन, और प्रिंट शुरू करने और सिरिंज पंप शुरू करने का समन्वय हैं।इस प्रक्रिया के लिए विकसित बायोइंक काफी नरम है, जिसमें कम क्रूरता है। यांत्रिक स्थिरता प्रदान करने और बेहतर बनाने के लिए बायोइंक में और संशोधन किया जा सकता है। यह 3 डी प्रिंटिंग तकनीक उत्कृष्ट यांत्रिक गुणों के साथ बायोफिल्म्स के उत्पादन में सक्षम बनाती है, जो बायोमिमेटिक सामग्रियों को गढ़ने में सक्षम बना सकती है।इन बैक्टीरिया को संभालते समय, उचित सुरक्षा पहनें, जैसे दस्ताने।

Research

JoVE Journal

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Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

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A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...