Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione AOARD (No. FA2386-18-1-4059), l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/OCW) come parte del programma Frontiers of nanoScience, e il programma Advanced Materials NWO-NSFC (n. 729.001.016). Gli autori riconoscono l'assistenza di laboratorio di Ramon van der Valk e Roland Kieffer.

1. conversione di una stampante 3D commerciale in una biostampa 3D
<ol><li>Rimuovere l'estrusore e il riscaldatore di una stampante 3D commerciale (tabella dei materiali) dal telaio della stampante e scollegare il cablaggio controllando questi elementi dal circuito principale (Figura 1a). Poiché il sensore che controlla la temperatura di funzionamento della stampante deve essere funzionale per comunicare con il software della stampante, rimuovere dal software di stampa l'...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Il protocollo qui presentato per la stampa 3D di biofilm ingegnerizzati ha due passaggi critici. In primo luogo è la preparazione della superficie di stampa agar, che è il fattore più critico per la produzione di una specifica risoluzione di stampa. È importante assicurarsi che la superficie di stampa sia piatta e che la punta della pipetta sulla testina di stampe sia posizionata all'altezza corretta dalla superficie. Se la superficie non è piatta, la distanza di lavoro cambierà durante il processo di stampa. Se la...

Vi è attualmente una crescente necessità di sviluppare soluzioni sostenibili e rispettose dell'ambiente per la produzione di materiali spazialmente modellati, a causa del crescente numero di mercati per tali materiali1. Questo articolo presenta un metodo semplice ed economico per la produzione di tali materiali e offre quindi un ampio spettro di applicazioni future. Il metodo qui presentato consente la stampa tridimensionale (3D) di strutture spazialmente modellate utilizzando un bio-Ink contenente batteri viventi. I batteri restano vitali all'interno delle strutture stampate per oltre una settimana, permettendo ai batteri di eseguire attività metaboliche naturali o ingegnerizzate. I batteri stampati possono quindi produrre e depositare i componenti desiderati all'interno della struttura stampata, ad esempio creando un biofilm Cross-Linked funzionale2.
I metodi tradizionali per la produzione di materiali avanzati comportano elevate spese energetiche (ad es. alte temperature e/o pressioni) e possono produrre grandi quantità di rifiuti chimici, sostanze spesso tossiche che richiedono un utilizzo esteso dei costi3 ,4. Al contrario, più specie batteriche sono in grado di produrre materiali che possono essere prontamente applicabili in vari settori. Questi materiali includono polimeri come i poliidrossialkanoati (PHA)5 o poli (glicolide-co-lattide) (PGLA)6, cellulosa batterica7, materiali batterici in calcestruzzo8, compositi biomimetici9, adesivi a base di amiloide10, o interruttori elettrici a base biologica11, tra gli altri. Inoltre, la produzione batterica di materiali preziosi avviene tipicamente a temperature e pressioni quasi ambientali e in ambienti acquosi, senza richiedere o produrre composti tossici. Durante la produzione di materiali con batteri è stato dimostrato in letteratura e alcune applicazioni industriali sono già emerse12,13, un metodo affidabile per il patterning spaziale di tali materiali rimane una sfida.
Questo articolo illustra un metodo semplice per convertire una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante batterica 3D. Il protocollo illustra come preparare un bio-inchiostro contenente e sostenere i batteri viventi, nonché come preparare i substrati su cui è possibile eseguire la stampa 3D. Questo metodo è appropriato da utilizzare con una varietà di ceppi batterici naturali e ingegnerizzati in grado di produrre materiali. Questi batteri possono essere distribuiti spazialmente all'interno di una struttura stampata in 3D e continuano ancora la loro attività metabolica, che si tradurrà in una distribuzione spaziale dei materiali desiderati prodotti dai batteri.
Questo metodo di stampa consente la produzione additiva di biofilm, aggregati di batteri circondati da una matrice extracellulare autoprodotta. I biofilm sono reti 3D eterogenee in cui proteine, polimeri, cellule batteriche, ossigeno e nutrienti sono tutti strutturati spazialmente14. Mentre nella forma di un biofilm, i batteri mostrano una maggiore resistenza agli antibiotici e robustezza strutturale, rendendoli difficili da sradicare dalle superfici, compresi cateteri medici e impianti. La chiave per le proprietà biofilm, e anche la più grande sfida alla ricerca biofilm, sembra essere l'eterogeneità di biofilm15,16,17. La produzione di biofilm di modelli controllati spazialmente è di particolare interesse in quanto consentirebbe di riprodurre o di ottimizzare i modelli spaziali dei componenti del biocarburante, aiutando la comprensione del deposito stabile di biofilmi su praticamente qualsiasi superficie in natura.
Questo articolo presenta un metodo per la produzione di biofilm che utilizzano idrogel stampati in 3D contenenti batteri E. coli ingegnerizzati che producono proteine del biofilm in presenza di un induttore, nonché metodi di verifica della formazione di biocarburante2 . I principali componenti della matrice extracellulare di questi biofilm sono le fibre amiloidi di curli18 che contengono proteine csga auto-assemblate. Quando i batteri E. coli ingegnerizzati sono indotti a esprimere le proteine csga, formano un biofilm modello stabile che protegge le cellule dall'essere lavato via dalla superficie di stampa. Tale biofilm stampato in 3D può essere controllato spazialmente e può fungere da utile strumento di ricerca per l'investigazione della meccanica di struttura-funzione biofilm multiscala o materiomics19. Questi biofilm su misura aiuteranno la comprensione dei principi della formazione del biocarburante e delle loro proprietà meccaniche, consentendo ulteriori ricerche sui meccanismi di resistenza agli antibiotici tra le altre applicazioni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

I biofilm sono aggregati di batteri incorporati in una matrice extracellulare a fantasia spazialmente autoprodotta. I batteri all'interno di un biofilm sviluppano una maggiore resistenza agli antibiotici, che pone potenziali pericoli per la salute, ma può anche essere vantaggioso per applicazioni ambientali come la purificazione dell'acqua potabile. L'ulteriore sviluppo di terapie antibatteriche e di applicazioni ispirate al biofilm richiederà lo sviluppo di metodi riproducibili e engineerabili per la creazione di biofilm. Recentemente, è stato sviluppato un nuovo metodo di preparazione del biofilm utilizzando una stampante tridimensionale (3D) modificata con un inchiostro batterico. In questo articolo vengono descritti i passaggi necessari per creare questo biostampa 3D efficiente e a basso costo che offre più applicazioni nell'elaborazione di materiali indotti da batterio. Il protocollo inizia con una stampante 3D commerciale adattata in cui l'estrusore è stato sostituito con un erogatore di Bio-inchiostro collegato ad un sistema di pompa a siringa che consente un flusso continuo e controllabile di bio-Ink. Per sviluppare un bio-inchiostro adatto per la stampa di biofilm, i batteri di Escherichia coli ingegnerizzati sono stati sospesi in una soluzione di alginato, in modo che si solidificino a contatto con una superficie contenente calcio. L'inclusione di una sostanza chimica induttore all'interno del substrato di stampa spinge l'espressione delle proteine del biofilm all'interno del bio-Ink stampato. Questo metodo consente la stampa 3D di vari modelli spaziali costituiti da strati discreti di biofilm stampati. Tali biofilm controllati spazialmente possono fungere da sistemi modello e possono trovare applicazioni in più campi che hanno un impatto di ampio respiro sulla società, tra cui la prevenzione della resistenza agli antibiotici o la purificazione dell'acqua potabile, tra gli altri.

Il primo passo per la stampa 3D di successo dei biofilm è la conversione di una stampante 3D commerciale in un bioprinter. Questa conversione si ottiene rimuovendo l'estrusore e il riscaldatore della stampante, progettati per la stampa con un inchiostro polimerico, e sostituendoli con componenti appropriati per la stampa di bioinchiostri contenenti batteri viventi (Figura 1a). L'estrusore è sostituito da una punta della pipetta (o punte, se nel processo di ...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

In questo articolo viene descritto un metodo per trasformare una stampante 3D commerciale a basso costo in una stampante 3D batterica che può facilitare la stampa di biofilm a motivi geometrici. Sono descritti tutti gli aspetti necessari della preparazione del biostampa e del bio-Ink, nonché i metodi di verifica per valutare la formazione dei biofilm.

Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

La biostampa 3D con batteri è una tecnica di nuova sviluppo. Questo protocollo fornisce un modo semplice per costruire biofilm ingegnerizzati stampati in 3D con batteri. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di produrre biofilm stampati in 3D utilizzando una stampante 3D costruita in casa economica.Una possibile applicazione della nostra stampante 3D è quella di creare biofilm modello riproducibili che possono essere utilizzati per sviluppare nuove terapie antibatteriche. Il nostro approccio di stampa 3D può essere applicato a qualsiasi tipo di batterio compatibile con il nostro bioink a base di alginato. La preparazione del bioink e dei substrati di stampa sono procedure abbastanza standard, mentre il processo di stampa 3D, in particolare la calibrazione dell'asse Z è un passaggio cruciale che richiede una certa pratica.La calibrazione dell'altezza di accesso impostata influenzerà la risoluzione della nostra stampante 3D e dipende fortemente dall'esperienza personale. Questa procedura richiede regolazioni manuali ed è difficile da descrivere in un formato scritto. Collegare una punta di pipetta da 200 microliter a una lunghezza di tubi in silicone e montare la punta della pipetta sulla testa dell'estrusore della stampante 3D in sostituzione dell'estrusore originale.Successivamente, aggiungere quattro millilitri di una soluzione di cloruro di calcio molare a 400 millilitri di 1%agar sciolti nel brodo di Luria-Bertani e integrarlo con gli antibiotici e gli induttori appropriati. Quindi, erogare 20 millilitri della soluzione di agar LB in ogni piastra di Petri da 150 millimetri per 15 millimetri. Asciugare il piatto per 30 minuti a temperatura ambiente, con il coperchio semiaproto.Preparare una soluzione di alginato di sodio al 3% e scaldarla al punto di ebollizione tre volte per sterilizzare la soluzione. Quindi, conservare la soluzione sterile a quattro gradi Celsius fino a quando non viene utilizzata. Per preparare la componente batterica del bioink, far crescere i batteri E.coli che trasportano plasmidi per l'espressione costitutiva della GFP in 50 millilitri di mezzo LB contenenti antibiotici.Scuoti la cultura a 250 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo la crescita notturna della coltura, pellet i batteri per cinque minuti a 3.220 volte la gravità e quindi rimuovere il supernatante. Resuspend il pellet batterico in 10 millilitri di mezzo LB e aggiungere 10 millilitri di alginato di sodio al 3%.Collegare la stampante 3D a un computer e aprire il software di stampa 3D. Fare clic sul pulsante Home per gli assi X, Y e Z per spostare la testina di stampa nella posizione iniziale. Per ogni stampa, posizionare un substrato di stampa preparato su una particolare posizione sul letto di stampa.Sollevare la testina di stampa a un'altezza di oltre 22 millimetri sotto controllo manuale, in modo che non si scontri con il bordo della piastra di Petri durante il movimento. Posizionare la testina di stampa sopra la parte superiore della piastra e spostarla verso il basso fino a quando la punta della pipetta non contatta la superficie di stampa. Assegnate questa posizione dell'asse Z come Z1, l'altezza della superficie di stampa.Quindi, sollevare la testina di stampa e spostarla manualmente all'esterno dell'area della piastra. Se la distanza di lavoro tra la testina di stampa e la superficie della lastra è definita come Z2, immettere l'altezza della superficie di stampa più la distanza di lavoro nel programma di stampa come valore Z durante la stampa. Caricare un file di codice G pre-programmato contenente i comandi per la stampa della forma desiderata.Ad ogni riga di comando, la posizione della testina di stampa può essere modificata negli assi X, Y e Z. Assicurarsi di inserire il valore Z durante tutti i passaggi di stampa come altezza della superficie di stampa più la distanza di lavoro. Caricare il bioink liquido nelle siringhe e montarlo nella pompa della siringa del biostampa 3D.Quindi, impostare la velocità di estrusione su 0,3 millilitri all'ora. Stampare il bioink sul substrato di stampa facendo clic sul pulsante Stampa. Attendere l'avvio della pompa della siringa fino a quando la stampa non è iniziata e prima che la testina di stampa venga a contatto con la superficie di stampa.Durante la stampa, controllare completamente il movimento della testina di stampa da parte del software. Arrestare la pompa della siringa non appena la testina di stampa arriva all'ultimo punto di stampa, altrimenti il bioink in eccesso scenderà sul substrato di stampa e ridurrà la risoluzione di stampa. Per la costruzione di strutture 3D, tutti i movimenti della testina di stampa sono controllati nell'editor del codice G.Per aumentare l'altezza di stampa per il secondo livello, digitare l'altezza di stampa del primo livello e aumentare il valore Z nel codice di 0,2 millimetri. Successivamente, aumentare il valore Z di 0,1 millimetri, quando ci si sposta su uno strato superiore. Incubare i campioni stampati a temperatura ambiente per tre o sei giorni per consentire la produzione dei componenti del biofilm come le fibre di Curli.Quindi, posizionare la piastra su uno scanner fluorescente e immagini le piastre. Per sciogliere la matrice di alginato, aggiungere 20 millilitri di una soluzione di citrato di sodio molare 0,5 a pH 7, al substrato stampato. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore tremando a 30 giri/min.Quindi, scartare il liquido e immaginere nuovamente le piastre, da confrontare con le immagini delle piastre prima e dopo il trattamento del citrato. Il biostampa 3D può creare batteri che incapsulano idrogel in una varietà di forme bidimensionali e tridimensionali. Queste forme stampate possono quindi essere utilizzate per valutare se la formazione di biofilm ha avuto successo o se la matrice di alginato è completamente sciolta usando una soluzione di citrato di sodio.Nel caso del bioink senza il plasmide di produzione curli inducibile, il motivo stampato è stato completamente sciolto dopo il trattamento con citrato di sodio, a significare che non si era formata alcuna rete di biofilm Curli. I batteri contenenti il plasmide di produzione curli induttibile non sono stati sciolti dopo il trattamento con citrato di sodio, indicando che i batteri stampati erano in grado di formare una rete Curli abbastanza estesa da stabilizzare il modello stampato di batteri. Per costruire strutture multistrato, è possibile stampare livelli aggiuntivi controllando l'editor del codice G.L'aumento del numero di livelli stampati in un campione ha causato un aumento incrementale della larghezza e dell'altezza delle strutture stampate. Quando E.coli ingegnerizzava per produrre induttibilmente proteine Curli furono stampate in strutture multistrato, il trattamento con citrato di sodio non dissolse i campioni, mentre le strutture multistrato contenenti E.coli non produttori di Curli furono sciolte. Le parti più critiche della procedura di stampa 3D sono la calibrazione dell'asse Z e la coordinazione dell'avvio della stampa e dell'avvio della pompa della siringa.Il bioink sviluppato per questo processo è abbastanza morbido, con bassa tenacità. Ulteriori modifiche potrebbero essere apportate al bioink, al fine di fornire e migliorare la stabilità meccanica. Questa tecnica di stampa 3D consente la produzione di biofilm con eccellenti proprietà meccaniche, che possono consentire la fabbricazione di materiali biomimetici.Quando si maneggiano questi batteri, indossare una protezione adeguata, come i guanti.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Investigare la separazione tridimensionale del flusso indotta da un modello di polipo piega vocale

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Tridimensionale di stampa di materiali termoplastici per creare automatizzati pompe a siringa con controllo in retroazione per applicazioni di microfluidica

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Piattaforma lab-on-a-CD per la generazione di spheroid tridimensionali multicellulari

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...