Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

이 작업은 AOARD 보조금에 의해 지원 되었다 (아니. FA2386-4059)은 나노 과학 프로그램의 선구자로 서 과학 연구 (NWO/OCW) 및 첨단 소재 NWO-NSFC 프로그램 (No. 729.001.016)의 일환으로 개발 되었습니다. 저자는 라몬 밴 데 어 발 크와 롤랜드 키에 프의 실험실 지원을 인정 합니다.

1. 상업용 3D 프린터를 3D 바이오 제약으로 변환
<ol><li>프린터 프레임에서 상업용 3D 프린터 (재질 테이블)의 압출 기와 히터를 분리 하 고 메인 회로 기판에서 이러한 요소를 제어 하는 배선을 분리 합니다 (그림 1a). 프린터의 작동 온도를 제어 하는 센서가 프린터 소프트웨어와 통신 하기 위해 작동 해야 하므로, 인쇄 소프트웨어에서 작동 온도에 도달할 때까지 ?...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. 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G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

엔지니어링 된 바이오 필름의 3D 프린팅을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 두 가지 중요 한 단계를가지고 있습니다. 첫 번째는 특정 인쇄 해상도를 생산 하는 가장 중요 한 요인이 되는 한 천 인쇄 면의 준비입니다. 인쇄 표면이 평평 하 고 프린트 헤드의 피 펫 팁이 표면에서 올바른 높이로 배치 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 표면이 평평 하지 않으면 인쇄 과정에서 작동 거리가 변경 됩?...

현재 이러한 물질의 시장 수가 증가 함에 따라 공간적으로 패턴화 된 재료의 생산을 위한 친환경적이 고 지속 가능한 솔루션을 개발 해야 하는 필요성이 커지고 있다1. 이 문서는 이러한 재료의 생산을 위한 간단 하 고 경제적인 방법을 제시 하 고, 따라서 미래의 응용 프로그램의 큰 스펙트럼을 제공 합니다. 여기에 제시 된 방법은 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 사용 하 여 공간적으로 패턴 된 구조의 3 차원 (3d) 인쇄를 허용 한다. 박테리아는 자연 또는 공학적 된 신진 대사 활동을 수행 하는 박테리아를 가능 하 게 1 주일 이상 인쇄 된 구조 내에서 가능한 남아. 인쇄 된 박테리아는 예를 들어 기능적 가교 된 생물 막2를 생성 하 여 인쇄 된 구조 내에서 원하는 성분을 생성 하 고 침전 시킬 수 있다.
첨단 소재 생산을 위한 전통적인 방법에는 높은 에너지 지출 (예: 고온 및/또는 압력)이 포함 되며 대량의 화학 폐기물을 생산할 수 있으며, 종종 비용-광범위 한 활용도가 요구 되는 독성 물질을 생산 합니다.3 ,4. 대조적으로, 여러 세균 종은 다양 한 산업에서 쉽게 적용 할 수 있는 물질을 생산할 수 있다. 이들 물질은 폴 리 하이드 록 시 알 카 네이트 (PHA)5 또는 폴 리아 (락 티 드)6의 세균 셀 룰로 오 스7, 세균 콘크리트 물질8, 생물 모방 복합 재9와 같은 중합체를 포함 하며, 아 밀 로이드 계 접착제10또는 바이오 기반 전기 스위치 (11)는 그 중 에서도. 더욱이, 귀중 한 물질의 세균 생산은 일반적으로 독성 화합물을 요구 하거나 생산 하지 않고 주변 온도와 압력 및 수성 환경에서 일어난다. 박테리아로 재료를 생산 하는 것은 문헌에서 입증 되었지만 일부 산업 응용 분야는 이미12,13, 이러한 물질의 공간적 패터 닝을 위한 신뢰할 수 있는 방법은 여전히 과제로 남아 있다.
이 문서에서는 저비용 상업용 3D 프린터를 3D 세균 프린터로 변환 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 살아있는 세균을 함유 하 고 유지 하는 바이오 잉크를 제조 하는 방법 뿐만 아니라, 3D 프린팅이 수행 될 수 있는 기판을 준비 하는 방법을 보여준다. 이 방법은 재료를 생산할 수 있는 다양 한 천연 및 공학적 세균 균 주와 함께 사용 하는 것이 적절 하다. 이러한 박테리아는 공간적으로 3D 프린팅 된 구조 내에서 분산 될 수 있고, 여전히 그들의 대사 활성을 계속 하며,이는 박테리아에 의해 생성 된 원하는 물질의 공간적 분포를 초래할 것 이다.
이 인쇄 방법은 자체 생산 된 세포 외 기질로 둘러싸인 생물 막, 세균 응집 체의 적 층 제조를 가능 하 게 한다. 바이오 필름은 단백질, 폴리머, 박테리아 세포, 산소 및 영양분이 모두 공간적으로 구조화 된 이종 3D 네트워크입니다. 생물 막의 형태로, 박테리아는 증가 된 항생제 저항과 구조적 견고성을 나타내며, 의료용 카 테 터 및 임 플 란 트를 포함 한 표면에서 근절 하기 어렵게 합니다. 생물 막 특성에 대 한 핵심은 생물 막 연구에도 가장 큰 과제 이며, 바이오 필름15,16,17의 이질성 일 것으로 보인다. 공간적으로 제어 되는 모델의 바이오 필름의 생산은 생물 막 성분의 공간적 패턴을 재생 하거나 조정 하는 것을 허용 하 고, 사실상 모든 표면에서 생물 막의 안정적인 침착에 대 한 이해를 돕는 것과 같은 특별 한 관심을가지고 있습니다. 자연.
이 기사는 바이오 필름 형성의 검증 방법 뿐만 아니라 유도 체의 존재 하에 바이오 필름 단백질을 생산 하는 엔지니어링 된 대장균 박테리아를 포함 하는 3d 프린팅 하이드로 젤을 사용 하는 바이오 필름의 제조 방법을 제시 합니다.2 . 이들 바이오 필름의 주요 세포 외 기질 성분은 자가 조립 된 CsgA 단백질을 함유 하는 curli 아 밀 로이드 섬유 (18 ) 이다. 개발 된 대장균 박테리아가 csga 단백질을 발현 하도록 유도 되 면, 이들은 인쇄 표면에서 씻 겨 지는 세포를 보호 하는 생물 막의 안정한 모델을 형성 한다. 이러한 3D 프린팅 생물 막은 공간적으로 제어 될 수 있고 다중 스케일 생물 막 구조 기능 역학 또는 물질 들 (19)의 조사를 위한 유용한 연구 도구로 서 작용할 수 있다. 이러한 맞춤형 바이오 필름은 바이오 필름 형성과 기계적 특성의 원리에 대 한 이해를 돕고, 다른 응용 프로그램 들 사이에서 항 생 저항의 메커니즘에 대 한 추가 연구를 가능 하 게 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

바이오 필름은 자체 생산 된 공간적으로 패턴화 된 세포 외 기질에 내장 된 박테리아의 집합체 이다. 생물 막 내의 박테리아는 잠재적인 건강 위험을 제기 하는 향상 된 항 생 저항을 개발 합니다, 그러나 또한 식 수의 정화와 같은 환경 신청을 위해 유익할 수 있습니다. 항균 치료제 및 생물 막에서 영감을 얻은 응용 분야의 추가 개발은 생물 막 생성을 위한 재현 가능 하 고 공학 가능한 방법의 개발을 요구할 것입니다. 최근에는 세균 잉크로 수정 된 3 차원 (3d) 프린터를 이용한 바이오 필름 제제의 신규 한 방법이 개발 되 고 있다. 이 문서에서는 세균 유도 재료 처리에 여러 응용 프로그램을 제공 하는이 효율적이 고 저렴 한 3D 바이오 제약 업체를 구축 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜은 적용 가능한 상업용 3D 프린터로 시작 하 여 압출 기를 주사기 펌프 시스템에 연결 된 바이오 잉크 디스펜서로 교체한 후 제어 되 고 연속적인 바이오 잉크 흐름을 가능 하 게 합니다. 생물 막 인쇄에 적합 한 바이오 잉크를 개발 하기 위해, 조작 된 대장균 박테리아를 알지 네이트 용액에 현 탁 시킨 후, 이들이 칼슘을 함유한 표면과 접촉 하 여 응고 되도록 하였다. 인쇄 기판 내에 유도 화학 물질의 포함은 인쇄 된 바이오 잉크 내에서 생물 막 단백질의 발현을 구동 한다. 이 방법을 사용 하면 인쇄 된 바이오 필름의 개별 레이어로 구성 된 다양 한 공간 패턴의 3D 인쇄가 가능 합니다. 이러한 공간적으로 제어 되는 생물 막은 모델 시스템의 역할을 할 수 있으며, 항생제 내성 예방 또는 음 용 수 정화 등 사회에 광범위 한 영향을 미치는 여러 분야의 응용 분야를 찾을 수 있습니다.

바이오 필름의 성공적인 3D 프린팅에 대 한 첫 번째 단계는 상업용 3D 프린터를 바이오 필름으로 변환 하는 것입니다. 이 변환은 폴리머 잉크로 인쇄 하도록 설계 된 프린터의 압출 기와 히터를 제거 하 고 살아있는 박테리아를 포함 하는 바이오 잉크를 인쇄 하는 데 적합 한 구성 요소로 대체 함으로써 달성 됩니다 (그림 1a). 압출 기는 주사기 펌프에 ?...

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Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

본 문서에서는 저가형 상업용 3D 프린터를 세균 3D 프린터로 변환 하 여 패턴화 된 바이오 필름의 인쇄를 촉진할 수 있는 방법을 설명 합니다. 바이오 필름 및 바이오 잉크를 제조 하는 데 필요한 모든 측면 뿐만 아니라 생물 막의 형성을 평가 하기 위한 검증 방법도 설명 합니다.

엔지니어 드 바이오 필름의 3 차원 패터 닝-it-스스로 바이오 필름

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

박테리아를 사용한 3D 바이오 프린팅은 새로 개발된 기술입니다. 이 프로토콜은 박테리아로 인쇄된 엔지니어링 된 생물막 3D를 쉽게 구성 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 가정용 3D 프린터를 사용하여 3D 인쇄 생물필름을 생산하는 기능입니다.3D 프린터의 가능한 한 가지 적용은 새로운 항균 요법을 개발하는 데 사용할 수 있는 재현 가능한 모델 생물막을 만드는 것입니다. 당사의 3D 프린팅 접근 방식은 alginate 기반 바이오잉크와 호환되는 모든 유형의 박테리아에 적용할 수 있습니다. 바이오잉크와 인쇄 기판의 제조는 상당히 표준적인 절차이며, 3D 프린팅 공정, 특히 Z축의 교정은 몇 가지 연습이 필요한 중요한 단계입니다.설정된 액세스 높이를 보정하면 3D 프린터의 해상도에 영향을 미치며 개인적인 경험에 크게 의존합니다. 이 절차에는 수동 조정이 필요하며 서면 형식으로 설명하기가 어렵습니다. 200 마이크로리터 파이펫 팁을 실리콘 튜브 길이에 연결하고 파이펫 팁을 원래 압출기를 대체할 수 있도록 3D 프린터의 압출기 헤드에 장착합니다.다음으로, 루리아-베르타니 국물에 용해된 1%의 1%의 1%의 400 밀리리터에 5마리의 어금니 칼슘 염화물 용액의 4밀리리터를 추가하고 적절한 항생제와 유도기로 보충합니다. 그런 다음 LB 한천 용액의 20 밀리리터를 각 150mm에서 15mm 페트리 접시에 분배합니다. 실온에서 30분간 건조하고 뚜껑이 반쯤 열려 있습니다.3% 알자네이트 나트륨 용액을 준비하고 끓는 점에 3번 가열하여 용액을 살균합니다. 그런 다음 멸균 용액을 사용할 때까지 섭씨 4도에 보관하십시오. 바이오잉크의 세균 성분을 제조하기 위해, 항생제를 함유한 LB 배지의 50밀리리터에서 구성 GFP 발현을 위해 플라스미드를 운반하는 대장균 균을 성장시다.하룻밤 사이에 250 RPM과 섭씨 37도에서 문화를 흔들어 주세요. 문화의 하룻밤 성장 후, 3에서 5 분 동안 박테리아를 펠릿, 220 시간 중력 다음 상체를 제거. LB 배지의 10 밀리리터에서 박테리아 펠릿을 다시 중단하고, 3%의 알기네이트 나트륨의 10 밀리리터를 추가합니다.3D 프린터를 컴퓨터에 연결하고 3D 프린팅 소프트웨어를 엽니다. X, Y 및 Z 축의 홈 버튼을 클릭하여 인쇄 헤드를 홈 위치로 이동합니다. 각 인쇄에 대해 준비된 인쇄 기판을 인쇄 베드의 특정 위치에 놓습니다.인쇄 헤드를 수동 제어하에 22밀리미터 이상의 높이로 올리므로 이동 중에 페트리 접시가장자리와 충돌하지 않습니다. 인쇄 헤드를 플레이트 위에 놓고 파이펫 팁이 인쇄 표면에 닿을 때까지 아래로 이동합니다. 이 Z축 위치를 인쇄 표면의 높이인 Z1로 할당합니다.그런 다음 인쇄 헤드를 들어 올리고 수동으로 플레이트 영역 외부로 이동합니다. 인쇄 헤드와 플레이트 표면 사이의 작업 거리가 Z2로 정의되면 인쇄 표면의 높이와 인쇄 시 인쇄 시 Z 값으로 인쇄 프로그램에 작업 거리를 입력합니다. 원하는 모양을 인쇄하기 위한 명령이 포함된 미리 프로그래밍된 G 코드 파일을 로드합니다.각 명령줄에서 인쇄 헤드의 위치는 X, Y 및 Z 축에서 변경될 수 있습니다. 인쇄 표면의 높이와 작업 거리로 모든 인쇄 단계에서 Z 값을 입력해야 합니다. 액체 바이오잉크를 주사기에 적재하고 3D 바이오 프린터의 주사기 펌프에 장착합니다.그런 다음 압출 속도를 시간당 0.3 밀리리터로 설정합니다. 인쇄 버튼을 클릭하여 생체 잉크를 인쇄 기판에 인쇄합니다. 인쇄가 시작될 때까지 주사기 펌프를 시작하고 인쇄 헤드가 인쇄 표면과 접촉하기 전에 기다립니다.인쇄 하는 동안, 완전히 소프트웨어에 의해 인쇄 머리 움직임을 제어 합니다. 인쇄 헤드가 인쇄의 마지막 지점에 도착하자마자 주사기 펌프를 멈추고, 그렇지 않으면 과도한 바이오잉크가 인쇄 기판에 떨어지고 인쇄 해상도를 줄입니다. 3D 구조의 시공의 경우 인쇄 헤드의 모든 움직임이 G 코드 편집기에서 제어됩니다.두 번째 레이어의 인쇄 높이를 높이 높이를 높이려면 첫 번째 레이어의 인쇄 높이를 입력하고 코드의 Z 값을 0.2 밀리미터 증가시다. 그 후 더 높은 층으로 이동할 때 Z 값을 0.1 밀리미터 증가시면 됩니다. 컬리 섬유와 같은 생물막 성분의 생산을 허용하기 위해 3~6일 동안 실온에서 인쇄된 샘플을 배양한다.그런 다음 형광 스캐너에 접시를 놓고 플레이트를 이미지화합니다. 알자산 매트릭스를 용해하려면 pH 7에서 0.5 개의 어금니질 나트륨 구연산용액의 20 밀리리터를 인쇄 된 기판에 추가하십시오. 30 rpm에서 흔들면서 실온에서 플레이트를 2 시간 동안 배양하십시오.그런 다음 액체를 버리고 플레이트를 다시 이미지화하여 구연산 치료 전후의 플레이트 이미지와 비교합니다. 3D 바이오 프린터는 다양한 2차원 및 3차원 모양으로 하이드로겔을 캡슐화하는 박테리아를 생성할 수 있습니다. 이러한 인쇄된 형상은 생물막의 형성이 성공적이었는지 또는 알기네이트 매트릭스가 구연산염 용액을 사용하여 완전히 용해되었는지 여부를 평가하는 데 사용될 수 있다.유도할 수 없는 컬리 생산 플라스미드가 없는 바이오잉크의 경우, 인쇄된 패턴은 구연산 나트륨 처리 후 완전히 용해되어 생물막 컬리 네트워크가 형성되지 않았음을 나타냅니다. 유도성 컬리 생산 플라스미드를 함유한 박테리아는 구연산 나트륨 치료 후 용해되지 않았으며, 인쇄된 박테리아가 박테리아의 인쇄 패턴을 안정화할 수 있을 만큼 광범위하게 컬리 네트워크를 형성할 수 있었다는 것을 나타낸다. 다층 구조를 구성하기 위해 G 코드 편집기를 제어하여 추가 레이어를 인쇄할 수 있습니다.샘플에서 인쇄된 레이어의 수를 늘리면 인쇄된 구조의 너비와 높이가 점진적으로 증가했습니다. 대장균을 유도하여 컬리 단백질을 유도하도록 설계되었을 때 다층 구조로 인쇄된 구연산 나트륨 치료는 샘플을 용해시키지 않았고, 비컬리 생성 E.coli를 함유한 다층 구조는 용해되었다. 3D 프린팅 절차의 가장 중요한 부분은 Z축의 보정과 인쇄를 시작하고 주사기 펌프를 시작하는 조정입니다.이 공정을 위해 개발된 바이오잉크는 인성이 낮기 때문에 상당히 부드럽습니다. 기계적 안정성을 제공하고 개선하기 위해 바이오 잉크에 추가 수정이 이루어질 수 있습니다. 이 3D 프린팅 기법은 우수한 기계적 특성을 가진 생물막의 생산을 가능하게 하며, 이는 생물모방 물질을 제조할 수 있습니다.이 박테리아를 취급할 때, 장갑과 같은 적당한 보호를 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

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3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

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3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

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Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

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조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

인쇄를 만드는 열가 소성 재료의 3 차원 미세 응용 프로그램에 대 한 피드백 제어와 주사기 펌프를 자동

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

다세포 3차원 스페로이드 생성을 위한 랩 온 어 CD 플랫폼

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...