Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av en AOARD stipend (nr. FA2386-18-1-4059), Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO/OCW) som en del av grenser nanovitenskap programmet, og de avanserte materialer NWO-NSFC program (nr. 729.001.016). Forfatterne anerkjenner laboratorie hjelp av Ramon Van der Valk og Roland Kieffer.

1. konvertering av en kommersiell 3D-skriver til en 3D-bioprinter
<ol><li>Fjern Ekstruder og ovnen til en kommersiell 3D-skriver (tabell over materialer) fra skriverens ramme, og trekk ut ledningene som kontrollerer disse elementene fra hoved kretskortet (figur 1a). Siden sensoren som styrer skriverens driftstemperatur, må være funksjonell for å kommunisere med skriverprogramvaren, fjerner du fra programvare for utskrift algoritmen som forsinker utskriften, til den oper...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Protokollen som presenteres her for 3D-utskrift av konstruerte biofilm har to kritiske trinn. Først er utarbeidelse av agar utskrift overflaten, som er den mest kritiske faktoren for å produsere en bestemt utskriftsoppløsning. Det er viktig å sørge for at utskriftsflaten er flat og at pipette spissen på skrivehodet er plassert i riktig høyde fra overflaten. Hvis overflaten ikke er flat, vil arbeids avstanden endres under utskriftsprosessen. Hvis arbeids avstanden er mindre enn 0,1 mm, kan CaCl2 -løsnin...

Det er i dag et økende behov for å utvikle miljøvennlige, bærekraftige løsninger for produksjon av romlig-mønstrede materialer, på grunn av det voksende antall markeder for slikt materiale1. Denne artikkelen presenterer en enkel, økonomisk metode for produksjon av slike materialer, og derfor tilbyr et stort spekter av fremtidige applikasjoner. Metoden som presenteres her tillater tredimensjonal (3D) utskrift av romlig-mønstret strukturer ved hjelp av en bio-blekk som inneholder levende bakterier. Bakterier fortsatt levedyktig innenfor trykte strukturer i over en uke, slik at bakteriene til å utføre naturlige eller konstruerte metabolske aktiviteter. Trykte bakterier kan dermed produsere og sette inn ønskede komponenter i den trykte strukturen, for eksempel å skape en funksjonell tverrbundet biofilm2.
Tradisjonelle metoder for produksjon av avanserte materialer involverer høy energi utgifter (f. eks, høye temperaturer og/eller trykk) og kan produsere store mengder kjemisk avfall, ofte giftige stoffer som krever kostnads omfattende utnyttelse3 ,4. I kontrast, flere bakterielle arter er i stand til å produsere materialer som kan lett brukes i ulike bransjer. Disse materialene omfatter polymerer som polyhydroxyalkanoates (PHA)5 eller Poly (glykolid-co-laktid) (PGLA)6, bakteriell cellulose7, bakterielle betong materialer8, BioMimetic kompositter9, amyloid-baserte lim10, eller bio-baserte elektriske brytere11, blant andre. Dessuten, bakteriell produksjon av verdifulle materialer vanligvis finner sted på nær omgivelsestemperaturer og trykk og i vandige miljøer, uten å kreve eller produsere giftige forbindelser. Mens produsere materialer med bakterier har blitt demonstrert i litteraturen og noen industrielle anvendelser har allerede dukket opp12,13, en pålitelig metode for romlig mønstre av slikt materiale er fortsatt en utfordring.
Denne artikkelen demonstrerer en rett fram metode for å konvertere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en 3D-bakteriell skriver. Protokollen viser hvordan man forbereder en bio-blekk som inneholder og opprettholde den levende bakterier, samt hvordan å forberede underlag som 3D-utskrift kan utføres. Denne metoden er hensiktsmessig å bruke med en rekke naturlige og konstruerte bakterielle stammer i stand til å produsere materialer. Disse bakteriene kan være romlig fordelt i en 3D trykt struktur og likevel fortsette sin metabolske aktivitet, noe som vil resultere i en romlig fordeling av de ønskede materialer produsert av bakterier.
Denne utskriftsmetoden muliggjør additiv produksjon av biofilm, aggregater av bakterier omgitt av en selv-produsert ekstracellulære matrise. Biofilm er heterogene 3D-nettverk der proteiner, polymerer, bakterielle celler, oksygen og næringsstoffer er alle romlig strukturert14. Selv i form av en biofilm, bakterier viser en økt antibiotikaresistens og strukturell robusthet, noe som gjør dem vanskelige å utrydde fra overflater, inkludert medisinske katetre og implantater. Nøkkelen til biofilm egenskaper, og også den største utfordringen til biofilm forskning, synes å være heterogenitet av biofilm15,16,17. Produksjon av romlig modell biofilm er av spesiell interesse som det ville tillate enten reprodusere eller tuning den romlige mønstre av biofilm komponenter, hjelpe forståelsen av stabile deponering av biofilm på nesten alle overflater i Natur.
Denne artikkelen presenterer en metode for produksjon av biofilm ved hjelp av 3D-trykte hydrogeler inneholder konstruert E. coli bakterier som produserer biofilm proteiner i nærvær av en induser, samt metoder for verifisering av biofilm formasjon2 . De store ekstracellulære Matrix komponenter av disse biofilm er curli amyloid fibre18 som inneholder selv-monterte CsgA proteiner. Når konstruert E. coli bakterier er indusert å uttrykke CsgA proteiner, danner de en stabil modell biofilm som beskytter cellene mot å bli vasket ut av utskriftsflaten. En slik 3D trykt biofilm kan være romlig kontrollert og kan tjene som et nyttig forskningsverktøy for etterforskningen av multiscale biofilm struktur-funksjon mekanikk eller materiomics19. Disse skreddersydde biofilm vil hjelpe forståelsen av prinsippene for biofilm dannelse og deres mekaniske egenskaper, slik at videre forskning på mekanismer for antibiotikaresistens blant andre applikasjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biofilm er aggregater av bakterier innebygd i en selv-produsert romlig-mønstret ekstracellulære matrise. Bakterier i en biofilm utvikle forbedret antibiotikaresistens, som utgjør potensielle helsemessige farer, men kan også være gunstig for miljø applikasjoner som rensing av drikkevann. Den videre utviklingen av anti-bakterielle legemiddel-og biofilm-inspirerte anvendelser vil kreve utvikling av reproduserbar, engineerable metoder for biofilm skapelse. Nylig er en ny metode for biofilm forberedelser ved hjelp av en modifisert tredimensjonal (3D) skriver med en bakteriell blekk er utviklet. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten som er nødvendig for å bygge denne effektive, rimelige 3D-bioprinter som tilbyr flere applikasjoner i bacterially materialbehandling. Protokollen begynner med en tilpasset kommersiell 3D-skriver der Ekstruder er erstattet med en bio-blekk dispenser koblet til et sprøyte pumpesystem som muliggjør en kontrollerbar, kontinuerlig strøm av bio-blekk. For å utvikle en bio-blekk egnet for biofilm utskrift, konstruert Escherichia coli bakterier ble suspendert i en løsning av alginat, slik at de stivner i kontakt med en overflate som inneholder kalsium. Inkluderingen av en induser kjemisk innen utskrift underlaget driver uttrykk for biofilm proteiner innenfor den trykte bio-blekk. Denne metoden muliggjør 3D-utskrift av ulike romlige mønstre som består av diskrete lag med trykte biofilm. Slike romlig-kontrollerte biofilm kan tjene som modellsystemer og kan finne programmer i flere felt som har en omfattende innvirkning på samfunnet, inkludert antibiotikaresistens forebygging eller drikkevann rensing, blant andre.

Det første trinnet for vellykket 3D-utskrift av biofilm er å konvertere en kommersiell 3D-skriver til en bioprinter. Denne konverteringen oppnås ved å fjerne Ekstruder og varmeren av skriveren, designet for utskrift med en polymer blekk, og erstatte disse med komponenter som passer for utskrift bio-blekk som inneholder levende bakterier (figur 1a). Ekstruder erstattes av en pipette (eller tips, hvis flere bio-blekk vil bli brukt i utskriftsprosessen) kobl...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Denne artikkelen beskriver en metode for å transformere en lavprisalternativ kommersiell 3D-skriver til en bakteriell 3D-skriver som kan forenkle utskrift av mønstrede biofilm. Alle nødvendige aspekter ved utarbeidelse av bioprinter og bio-blekk er beskrevet, samt verifikasjon metoder for å vurdere dannelsen av biofilm.

Tredimensjonale mønstre av konstruert biofilm med en gjør-det-selv-Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

3D bioprinting med bakterier er en nyutviklet teknikk. Denne protokollen gir en enkel måte å konstruere konstruerte biofilmer 3D trykt med bakterier. Den største fordelen med denne teknikken er muligheten til å produsere 3D-trykte biofilmer ved hjelp av en billig hjemmelaget 3D-skriver.En mulig anvendelse av vår 3D-skriver er å lage reproduserbare modellbiofilmer som kan brukes til å utvikle nye antibakterielle terapier. Vår 3D-utskriftstilnærming kan brukes på alle typer bakterier som er kompatible med vår alginatbaserte bioink. Utarbeidelse av bioink og utskrift substrater er ganske standard prosedyrer, mens 3D-utskriftsprosessen, spesielt kalibreringen av Z-aksen er et avgjørende skritt som krever litt praksis.Kalibrering av den innstilte tilgangshøyden vil påvirke oppløsningen til vår 3D-skriver, og er sterkt avhengig av personlig erfaring. Denne prosedyren krever manuelle justeringer, og det er vanskelig å beskrives i et skriftlig format. Koble en 200 mikroliters pipettespiss til en lengde på silikonslangen, og monter pipettespissen på 3D-skriverens ekstruderhode som erstatning for det opprinnelige ekstruderen.Deretter legger du til fire milliliter av en fem molar kalsiumkloridløsning til 400 milliliter på 1% agar oppløst i Luria-Bertani kjøttkraft, og supplerer den med passende antibiotika og induktorer. Deretter dispenserer du 20 milliliter lb agarløsning i hver 150 millimeter med 15 millimeter petriskål. Tørk parabolen i 30 minutter ved romtemperatur, med lokket halv åpent.Forbered en 3% natriumalginatløsning, og varm den til kokepunktet tre ganger for å sterilisere løsningen. Deretter oppbevarer du den sterile løsningen ved fire grader Celsius til den brukes. For å forberede den bakterielle komponenten av bioink, vokse E.coli bakterier bærer plasmider for konstitutiv GFP uttrykk i 50 milliliter lb medium som inneholder antibiotika.Rist kulturen ved 250 RPM og 37 grader Celsius over natten. Etter nattens vekst av kulturen, pellet bakteriene i fem minutter på 3, 220 ganger tyngdekraften og fjern deretter det overnaturlige. Resuspend bakteriepellet i 10 milliliter LB medium, og tilsett 10 milliliter av 3% natriumalginat.Koble 3D-skriveren til en datamaskin, og åpne programvaren for 3D-utskrift. Klikk på Hjem-knappen for X-, Y- og Z-aksene for å flytte skrivehodet til hjemmeposisjonen. For hvert trykk plasserer du et forberedt trykksubstrat på et bestemt sted på utskriftssengen.Hev skrivehodet til en høyde på over 22 millimeter under manuell kontroll, slik at det ikke kolliderer med kanten av petriskålen under bevegelse. Plasser skrivehodet over toppen av platen, og flytt det ned til pipettespissen kommer i kontakt med utskriftsoverflaten. Tilordne denne Z-akseposisjonen som Z1, høyden på utskriftsoverflaten.Deretter hever du skrivehodet og flytter det manuelt utenfor plateområdet. Hvis arbeidsavstanden mellom skrivehodet og plateoverflaten er definert som Z2, angir du høyden på utskriftsoverflaten pluss arbeidsavstanden i utskriftsprogrammet som Z-verdi under utskrift. Legg i en forhåndsprogrammert G-kodefil som inneholder kommandoer for utskrift av ønsket form.Ved hver kommandolinje kan plasseringen av skrivehodet endres i aksene X, Y og eller Z. Pass på at du skriver inn Z-verdien under alle utskriftstrinn som høyden på utskriftsflaten pluss arbeidsavstanden. Legg væskebioken i sprøyter og monter dem i sprøytepumpen til 3D bioprinteren.Deretter setter du ekstruderingshastigheten til 0,3 milliliter per time. Skriv ut bioinken på utskriftsunderlaget ved å klikke på Skriv ut-knappen. Vent med å starte sprøytepumpen til etter at utskriften er startet, og før skrivehodet kommer i kontakt med utskriftsoverflaten.Under utskrift styrer du utskriftshodebevegelsen helt av programvaren. Stopp sprøytepumpen så snart skrivehodet kommer til det siste utskriftspunktet, ellers vil overflødig bioink falle på trykksubstratet og redusere utskriftsoppløsningen. For bygging av 3D-strukturer styres alle bevegelsene til skrivehodet i G-koderedigeringsprogrammet.Hvis du vil øke utskriftshøyden for det andre laget, skriver du inn utskriftshøyden på det første laget og øker Z-verdien i koden med 0,2 millimeter. Deretter øker du Z-verdien med 0,1 millimeter, når du flytter til et høyere lag. Inkuber de trykte prøvene ved romtemperatur i tre til seks dager for å tillate produksjon av biofilmkomponenter som Curli-fibre.Deretter plasserer du platen på en fluorescerende skanner og bilde platene. For å oppløse alginatmatrisen, tilsett 20 milliliter av en 0,5 molar natriumsitratløsning ved pH 7, til det trykte substratet. Inkuber platen ved romtemperatur i to timer mens du rister ved 30 o/min.Deretter kaster du væsken og bilde platene igjen, for å sammenligne med bildene av platene før og etter citratebehandlingen. 3D bioprinter kan skape bakterier innkapsling hydrogels i en rekke todimensjonale og tredimensjonale former. Disse trykte formene kan deretter brukes til å vurdere om dannelsen av biofilm var vellykket eller om alginatmatrisen er fullstendig oppløst ved hjelp av en natriumsitratløsning.I tilfelle av bioink uten den indukøse Curli-produksjonen plasmid, ble det trykte mønsteret fullstendig oppløst etter natriumsitratbehandlingen, noe som betyr at ingen biofilm Curli-nettverk hadde dannet seg. Bakteriene som inneholder den indukøse Curli-produksjonen plasmid ble ikke oppløst etter natriumsitratbehandling, noe som indikerer at de trykte bakteriene var i stand til å danne et Curli-nettverk som var omfattende nok til å stabilisere det trykte mønsteret av bakterier. Hvis du vil konstruere flerlagsstrukturer, kan flere lag skrives ut ved å kontrollere redigeringsprogrammet for G-kode.Hvis du økte antall utskrevne lag i et utvalg, økte bredden og høyden på de utskrevne strukturene trinnvis. Da E.coli ble utviklet for å produsere Curli-proteiner på en indukelig måte ble trykt i flerlagsstrukturer, oppløses ikke natriumsitratbehandlingen prøvene, mens flerlagsstrukturer som inneholder ikke Curli som produserte E.coli ble oppløst. De mest kritiske delene av 3D-utskriftsprosedyren er kalibreringen av Z-aksen, og koordineringen av å starte utskriften og starte sprøytepumpen.Bioink utviklet for denne prosessen er ganske myk, med lav seighet. Ytterligere modifikasjoner kan gjøres på bioink, for å gi og forbedre mekanisk stabilitet. Denne 3D-utskriftsteknikken muliggjør produksjon av biofilmer med gode mekaniske egenskaper, noe som kan muliggjøre fabrikasjon av biomimetiske materialer.Når du håndterer disse bakteriene, bruk riktig beskyttelse, for eksempel hansker.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersøke den tredimensjonale flytseparasjonen indusert av en modellvokalfold polypp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Rapid Subtraktiv Mønstring av levende cellelag med en mikrofluid Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Tredimensjonale utskrift av termoplastisk materiale å lage automatiserte sprøyte pumper med tilbakemelding kontroll for Microfluidic applikasjoner

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...