Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett AOARD-bidrag (nr. FA2386-18-1-4059), den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO/OCW) som en del av Frontiers of Nanoscience program, och avancerade material NWO-NSFC program (nr 729.001.016). Författarna erkänner laboratorie hjälp av Ramon van der Valk och Roland Kieffer.

1. omvandling av en kommersiell 3D-skrivare till en 3D-bioprinter
<ol><li>Ta bort extrudern och värmare av en kommersiell 3D-skrivare (tabell över material) från skrivarens RAM, och dra ur ledningar styra dessa element från huvud kretskortet (figur 1a). Eftersom sensorn som styr skrivarens drift temperatur måste fungera för att kunna kommunicera med skrivar programmet, tar du bort från utskrifts programmet den algoritm som fördröjer utskriften tills drift temperat...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Det protokoll som presenteras här för 3D-utskrifter av konstruerade bio filmer har två kritiska steg. Först är förberedelserna av agartryckytan, som är den mest kritiska faktorn för att producera en specifik utskrifts upplösning. Det är viktigt att se till att tryck ytan är platt och att pipettspetsen på Skriv huvudet är placerad på rätt höjd från ytan. Om ytan inte är platt kommer arbets sträckan att ändras under utskrifts processen. Om arbets avståndet är mindre än 0,1 mm kan CaCl2 -l?...

Det finns för närvarande ett ökande behov av att utveckla miljö vänliga, hållbara lösningar för produktion av rumsligt mönstrade material, på grund av det växande antalet marknader för sådant material1. Denna artikel presenterar en enkel, ekonomisk metod för produktion av sådana material och erbjuder därför ett stort spektrum av framtida tillämpningar. Den metod som presenteras här tillåter tredimensionell (3D) tryckning av rumsligt mönstrade strukturer med hjälp av en bio-bläck som innehåller levande bakterier. Bakterier förblir livskraftiga inom de tryckta strukturerna i över en vecka, vilket gör det möjligt för bakterierna att utföra naturliga eller konstruerade metaboliska aktiviteter. Tryckta bakterier kan därmed producera och sätta in önskade komponenter inom den tryckta strukturen, till exempel skapa en funktionell tvär bunden biofilm2.
Traditionella metoder för produktion av avancerade material innebär höga energi kostnader (t. ex. höga temperaturer och/eller tryck) och kan producera stora mängder kemiskt avfall, ofta giftiga ämnen som kräver kostnads omfattande användning3 ,4. Däremot kan flera bakterie arter producera material som är lätt att kunna tillämpas i olika branscher. Dessa material inkluderar polymerer såsom polyhydroxialkanoater (PHA)5 eller poly (glykolid-co-lactide) (pgla)6, bakteriell cellulosa7, bakterie betong material8, biomimetiska kompositer9, amyloid-baserade lim10, eller biobaserade elektriska brytare11, bland annat. Dessutom, bakterie produktion av värdefulla material sker typiskt vid nära omgivnings temperaturer och tryck och i vatten miljöer, utan att kräva eller producera giftiga föreningar. Medan producera material med bakterier har visats i litteraturen och vissa industriella tillämpningar har redan dykt upp12,13, en pålitlig metod för rumsliga mönstningar av sådana material är fortfarande en utmaning.
Denna artikel visar en rättfram metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare i en 3D-bakteriell skrivare. Protokollet visar hur man förbereder en bio-bläck som innehåller och upprätthålla levande bakterier, samt hur man förbereder substrat på vilka 3D-utskrift kan utföras. Denna metod är lämplig att använda med en mängd olika naturliga och konstruerade bakterie stammar kunna producera material. Dessa bakterier kan vara rumsligt fördelade inom en 3D-tryckt struktur och fortfarande fortsätta sin metaboliska aktivitet, vilket kommer att resultera i en rumslig fördelning av de önskade materialen som produceras av bakterierna.
Denna tryck metod möjliggör additiv tillverkning av bio filmer, aggregat av bakterier omgivna av en egenproducerad extracellulär matris. Bio filmer är heterogena 3D-nätverk där proteiner, polymerer, bakterie celler, syre och näringsämnen är alla rumsligt strukturerade14. Även i form av en bio film, bakterier uppvisar en ökad antibiotika resistens och strukturell robusthet, vilket gör dem svåra att utrota från ytor inklusive medicinska katetrar och implantat. Nyckeln till biofilm egenskaper, och även den största utmaningen för biofilm forskning, verkar vara heterogenitet av bio filmer15,16,17. Produktion av rumsligt kontrollerad modell bio filmer är av särskilt intresse eftersom det skulle göra det möjligt att antingen reproducera eller trimma den rumsliga mönster av biofilm komponenter, medhjälp förståelsen av den stabila deposition av bio filmer på praktiskt taget alla ytor i Natur.
Denna artikel presenterar en metod för produktion av bio filmer med hjälp av 3D-tryckta vävnadsinväxt som innehåller konstruerade E. coli -bakterier som producerar biofilm proteiner i närvaro av en inducerare, samt metoder för verifiering av biofilm formation2 . De stora extracellulära matrix komponenterna i dessa bio filmer är curli amyloid fibrer18 som innehåller Självmonterade csga proteiner. När konstruerade E. coli bakterier induceras för att uttrycka csga proteiner, bildar de en stabil modell biofilm som skyddar cellerna mot att tvättas bort av tryck ytan. En sådan 3D tryckt biofilm kan rumsligt kontrol leras och kan fungera som ett användbart forsknings verktyg för utredning av multiskala biofilm struktur-funktion mekanik eller materiomik19. Dessa skräddarsydda bio filmer kommer att under lätta förståelsen av principerna för Biofilm bildning och deras mekaniska egenskaper, vilket möjliggör ytterligare forskning om mekanismerna för antibiotika resistens bland andra tillämpningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Bio filmer är aggregat av bakterier inbäddade i en egenproducerad rumsligt mönstrad extracellulär matris. Bakterier inom en biofilm utvecklar förstärkt antibiotika resistens, som utgör potentiella hälso faror, men kan också vara fördelaktigt för miljö tillämpningar såsom rening av dricks vatten. Den fortsatta utvecklingen av anti-bakteriell terapi och biofilm-inspirerade tillämpningar kommer att kräva utveckling av reproducerbara, engineerable metoder för biofilm skapande. Nyligen har en ny metod för biofilm beredning med hjälp av en modifierad tredimensionell (3D) skrivare med en bakteriell bläck har utvecklats. Denna artikel beskriver de steg som krävs för att bygga denna effektiva, billig 3D-bioprinter som erbjuder flera applikationer i bakteriellt inducerad material bearbetning. Protokollet inleds med en anpassad kommersiell 3D-skrivare där extrudern har ersatts med en bio-bläck dispenser ansluten till en spruta pump system som möjliggör en kontrollerbar, kontinuerligt flöde av bio-bläck. För att utveckla en bio-Ink lämplig för biofilm utskrift, konstruerade Escherichia coli bakterier avbröts i en lösning av alginat, så att de stelnar i kontakt med en yta som innehåller kalcium. Införandet av en inducerare kemikalie inom det tryck substrat driver uttryck för biofilm proteiner inom tryckt bio-Ink. Denna metod möjliggör 3D-utskrifter av olika rumsliga mönster som består av diskreta lager av tryckta bio filmer. Sådana rumsligt kontrollerad bio filmer kan fungera som modell system och kan hitta applikationer inom flera områden som har en omfattande inverkan på samhället, inklusive antibiotika resistens förebyggande eller dricks vatten rening, bland annat.

Det första steget för framgångs rika 3D-utskrifter av bio filmer är att omvandla en kommersiell 3D-skrivare till en bioprinter. Denna omvandling uppnås genom att ta bort extrudern och värmare av skrivaren, avsedd för utskrift med en polymer bläck, och ersätta dessa med komponenter som lämpar sig för utskrift av bio-bläck som innehåller levande bakterier (figur 1a). Extrudern ersätts med en pipettspets (eller tips, om flera bio-bläck kommer att ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Den här artikeln beskriver en metod för att omvandla en billig kommersiell 3D-skrivare till en bakteriell 3D-skrivare som kan under lätta utskrift av mönstrade bio filmer. Alla nödvändiga aspekter av beredningen av bioprinter och bio-Ink beskrivs, liksom verifieringsmetoder för att bedöma bildandet av bio filmer.

Tredimensionell Patterning av Engineered bio filmer med en gör-det-själv Bioprinter

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

3D-bioprinting med bakterier är en nyutvecklad teknik. Detta protokoll ger ett enkelt sätt att konstruera konstruerade biofilmer 3D tryckt med bakterier. Den största fördelen med denna teknik är möjligheten att producera 3D-tryckta biofilmer med hjälp av en billig hembyggd 3D-skrivare.En möjlig tillämpning av vår 3D-skrivare är att skapa reproducerbara modell biofilmer som kan användas för att utveckla nya antibakteriella terapier. Vår 3D-utskriftsmetod kan tillämpas på alla typer av bakterier som är kompatibla med vår alginatbaserade bioink. Beredning av bioink och av trycksubstraten är ganska standardprocedurer, medan 3D-utskriftsprocessen, särskilt kalibreringen av Z-axeln är ett avgörande steg som kräver viss praxis.Kalibrering av den inställda åtkomsthöjden kommer att påverka upplösningen på vår 3D-skrivare, och är starkt beroende av personlig erfarenhet. Den här proceduren kräver manuella justeringar och det är svårt att beskrivas i ett skriftligt format. Anslut en 200 mikroliterpipettsspets till en längd av silikonslangar, och montera pipettspetsen på 3D-skrivarens extruderhuvud som ersättning för den ursprungliga extrudern.Därefter lägger fyra milliliter av en fem molar kalciumkloridlösning till 400 milliliter av 1%agar upplöst i Luria-Bertani buljong, och komplettera den med lämpliga antibiotika och inducerare. Sedan dispensera 20 milliliter av LB agar lösning i varje 150 millimeter med 15 millimeter Petriskål. Torka skålen i 30 minuter vid rumstemperatur, med locket halvöppet.Förbered en 3%natriumalginatlösning, och värm den till kokpunkten tre gånger för att sterilisera lösningen. Sedan, lagra den sterila lösningen vid fyra grader Celsius tills den används. För att förbereda den bakteriella komponenten i bioink, växa E.coli bakterier som transporterar plasmider för utgörande GFP uttryck i 50 milliliter LB medium som innehåller antibiotika.Skaka kulturen vid 250 RPM och 37 grader Celsius över natten. Efter över natten tillväxt av kulturen, pellet bakterierna i fem minuter vid 3, 220 gånger gravitationen och sedan ta bort supernatant. Resuspend bakterierna pelleten i 10 milliliter lb medium, och tillsätt 10 milliliter av 3%natriumalginat.Anslut 3D-skrivaren till en dator, och öppna 3D-utskriftsprogrammet. Klicka på hemknappen för X-, Y- och Z-axlarna, för att flytta skrivhuvudet till sin hemposition. För varje tryck, placera ett förberett trycksubstrat på en viss plats på tryckbädden.Höj skrivhuvudet till en höjd av över 22 millimeter under manuell kontroll, så att det inte kommer att kollidera med petriskålens kant under förflyttning. Placera skrivhuvudet över plattans överkant och för den nedåt tills pipettspetsen kontaktar tryckytan. Tilldela denna Z-axelposition som Z1, höjden på tryckytan.Därefter höjer du skrivhuvudet och flyttar det manuellt utanför plattans område. Om arbetsavståndet mellan skrivhuvudet och plåtytan definieras som Z2 anger du höjden på tryckytan plus arbetsavståndet in i utskriftsprogrammet som Z-värde under utskriften. Ladda en förprogrammerad G-kodfil innehållande kommandon för utskrift av önskad form.På varje kommandorad kan utskriftshuvudets position ändras i X-, Y- och eller Z-axlarna. Se till att mata in Z-värdet under alla utskriftssteg som höjden på tryckytan plus arbetsavståndet. Ladda den flytande biosinken i sprutor och montera dem i sprutpumpen på 3D-bioskrivaren.Ställ sedan in strängpressningshastigheten på 0,3 milliliter per timme. Skriv ut bioinken på trycksubstratet genom att klicka på knappen Skriv ut. Vänta med att starta sprutpumpen tills efter att utskriften har startat, och innan skrivhuvudet kommer i kontakt med tryckytan.Under utskriften styr du skrivhuvudets rörelse helt efter programvaran. Stoppa sprutan pumpen så snart skrivhuvudet anländer vid den sista punkten av utskrift, annars överskott bioink kommer att släppa på trycksubstrat och minska utskriften upplösning. För konstruktion av 3D-strukturer styrs alla tryckhuvudets rörelser i G-kodsredigeraren.Om du vill öka utskriftshöjden för det andra lagret skriver du i tryckhöjden för det första lagret, och ökar Z-värdet i koden med 0,2 millimeter. Därefter öka Z-värdet med 0,1 millimeter, när du flyttar till ett högre lager. Inkubera de tryckta proverna i rumstemperatur i tre till sex dagar för att möjliggöra produktion av biofilmkomponenterna som Curli-fibrer.Placera sedan plattan på en lysrörsskanner och avbilda plattorna. För att lösa upp alginatmatrisen, tillsätt 20 milliliter av en 0,5 molar natriumcitratlösning vid pH 7, till det tryckta substratet. Inkubera plattan i rumstemperatur i två timmar medan du skakar vid 30 rpm.Därefter, kasta vätskan och bild plattorna igen, för att jämföra med bilderna av plattorna före och efter citrat behandlingen. 3D-bioskrivaren kan skapa bakterier som kapslar in hydrogeler i en mängd olika tvådimensionella och tredimensionella former. Dessa tryckta former kan sedan användas för att bedöma om bildandet av biofilm var framgångsrikt eller om alginatmatrisen är helt upplöst med hjälp av en natriumcitratlösning.När det gäller bioink utan den inducerbara Curli-produktionsplasmiden löstes det tryckta mönstret helt efter natriumcitratbehandlingen, vilket innebär att inget biofilm Curli-nätverk hade bildats. De bakterier som innehåller den inducible Curli produktionen plasmid var inte upplöst efter natriumcitrat behandling, vilket tyder på att de tryckta bakterierna kunde bilda ett Curli nätverk omfattande nog att stabilisera det tryckta mönstret av bakterier. För att konstruera flerskiktade strukturer kan ytterligare lager skrivas ut genom att styra G-kodsredigeraren.Om du ökade antalet utskrivna lager i ett prov orsakades bredden och att de utskrivna strukturernas höjd ökade stegvis. När E.coli konstruerad för att inducibly producera Curli proteiner trycktes i flerskiktade strukturer, natriumcitrat behandling inte lösa upp proverna, medan flerskiktsstrukturer som innehåller icke Curli producerar E.coli löstes. De mest kritiska delarna i 3D-utskriftsförfarandet är kalibreringen av Z-axeln, och samordningen av att starta utskriften och starta sprutpumpen.Den bioink som utvecklats för denna process är ganska mjuk, med låg seghet. Ytterligare modifiering skulle kunna göras av bioinken, för att ge och förbättra den mekaniska stabiliteten. Denna 3D-tryckteknik möjliggör produktion av biofilmer med utmärkta mekaniska egenskaper, vilket kan möjliggöra tillverkning av biomimetiska material.Vid hantering av dessa bakterier, använd korrekt skydd, såsom handskar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Tredimensionell optisk upplösning photoacoustic Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Undersöka den tredimensionella flödesseparationen inducerad av en modell vokal vikpolyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

Snabb Subtraktiv Mönstring av levande cellskikt med en mikroflödessystem Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Tredimensionella utskrift av termoplastiska material att skapa automatiserade sprutpumpar med Feedback kontroll för mikroflödessystem applikationer

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...