Name: three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter
Uploaded: 2019-05-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Bu çalışma bir AOARD Grant tarafından destekleniyordu (No. FA2386-18-1-4059), Hollanda bilimsel araştırma organizasyonu (NWO/OCW) nanoscience programının Frontiers ve gelişmiş malzemeler NWO-NSFC programı (No. 729.001.016) bir parçası olarak. Yazarlar, Ramon Van der Valk ve Roland Kieffer 'in laboratuar yardımını kabul ediyor.

1. ticari 3B yazıcının 3D bioprinter içine dönüştürülmesi
<ol><li>Ekstruder ve ticari 3B yazıcının (malzeme tablosu) ısıtıcısını yazıcı çerçevesinden çıkarın ve bu elemanları ana devre kartından kontrol eden kablolamayı çıkarın (Şekil 1a). Yazıcının operasyonel sıcaklığını denetleyen sensör, yazıcı yazılımıyla iletişim kurmak için işlevsel olması gerektiğinden, yazdırma yazılımından çalışma sıcaklığına ulaşıla...

<ol>
	<li>Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+material+design+for+biomedical+applications.">Progress in material design for biomedical applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).</li><li>Schmieden, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+of+Patterned,+Engineered+E.+coli+Biofilms+with+a+Low-Cost+3D+Printer.">Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).</li><li>Mao, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+nacre+by+predesigned+matrix-directed+mineralization.">Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization.</a> Science. 354 (6308), 107-110 (2016).</li><li>Gao, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+bulk+artificial+nacre+with+excellent+mechanical+properties.">Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties.</a> Nature Communications. 8 (1), 287 (2017).</li><li>Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Polyhydroxyalkanoates,+a+Family+of+Biodegradable+Plastics+and+Elastomers,+in+Bacteria+and+Plants.">Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants.</a> Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).</li><li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fermentative+production+of+poly(lactate-co-glycolate)+from+carbohydrates+in+Escherichia+coli.">One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli.</a> Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).</li><li>Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+cellulose+nanofibril+dispersions+for+tougher+fibers.">Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11860 (2017).</li><li>Jonkers, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria-based+self-healing+concrete.">Bacteria-based self-healing concrete.</a> Heron. 56 (1/2), (2011).</li><li>Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+bacteria+to+make+improved,+nacre-inspired+materials.">Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials.</a> MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strong+underwater+adhesives+made+by+self-assembling+multi-protein+nanofibres.">Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres.</a> Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).</li><li>Chen, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+patterning+of+tunable+multiscale+materials+with+engineered+cells.">Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells.</a> Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).</li><li>Gatenholm, P., Klemm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Nanocellulose+as+a+Renewable+Material+for+Biomedical+Applications.">Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications.</a> MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).</li><li>Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructured+bacterial+materials+for+innovative+medicines.">Nanostructured bacterial materials for innovative medicines.</a> Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).</li><li>Hung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+biofilms+have+an+organized+and+complex+extracellular+matrix+structure.">Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure.</a> MBio. 4 (5), (2013).</li><li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+Survival+Mechanisms+of+Clinically+Relevant+Microorganisms.">Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li><li>Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+combating+bacterial+biofilm+infections.">Strategies for combating bacterial biofilm infections.</a> International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curli+Fibers+Are+Required+for+Development+of+Biofilm+Architecture+in+Escherichia+coli+K-12+and+Enhance+Bacterial+Adherence+to+Human+Uroepithelial+Cells.">Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells.</a> Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).</li><li>Cranford, S., Buehler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Materiomics:+biological+protein+materials,+from+nano+to+macro.">Materiomics: biological protein materials, from nano to macro.</a> Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).</li><li>Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Straightforward+Approach+for+3D+Bacterial+Printing.">A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).</li><li>Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+polymerization+of+a+functional+Escherichia+coli+amyloid+protein.">In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).</li><li>Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleator-dependent+intercellular+assembly+of+adhesive+curli+organelles+in+Escherichia+coli.">Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).</li><li>Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+Living+Biofilms+through+Optogenetic+Manipulation.">Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).</li><li>Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+Lithography+enables+high-resolution+cell+patterning+via+optogenetic+adhesin+expression.">Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li><li>Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthcare-associated+infections,+medical+devices+and+biofilms:+risk,+tolerance+and+control.">Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control.</a> Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).</li></ol>

Mühendislik biyosilmlarının 3D baskı için burada sunulan protokol iki kritik adımlara sahiptir. Öncelikle, özel bir baskı çözünürlüğü üreten en kritik faktör olan agar baskı yüzeyinin hazırlanması. Baskı yüzeyinin düz olduğundan ve yazıcı kafasının üzerindeki pipet ucunun yüzeyden doğru yükseklikte konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Yüzey düz değilse, çalışma mesafesi yazdırma işlemi sırasında değişecek. Çalışma mesafesi 0,1 mm 'den az ise, CaCl2 ...

Şu anda, bu tür malzemeler için pazarlar genişleyen sayısı nedeniyle, dağınık desenli malzemelerin üretimi için çevre dostu, sürdürülebilir çözümler geliştirmek için artan bir ihtiyaç vardır1. Bu makalede, bu tür malzemelerin üretimi için basit, ekonomik bir yöntem sunuyor ve bu nedenle gelecekteki uygulamaların büyük bir spektrum sunuyor. Burada sunulan yöntem üç boyutlu (3D) bir biyo-mürekkep yaşayan bakteri içeren kullanarak dağınık desenli yapıların baskı sağlar. Bakteriler, bir haftadan fazla bir süre için baskılı yapıların içinde uygun kalır, bakteri doğal veya mühendislik metabolik faaliyetleri gerçekleştirmek için olanaklı kılmak. Baskılı bakteri böylece üretmek ve basılı yapısı içinde istenilen bileşenleri yatırmak, örneğin işlevsel bir çapraz bağlantılı biyofilm oluşturma2.
Gelişmiş malzemelerin üretimi için geleneksel yöntemler yüksek enerji harcamalarını (örn. yüksek sıcaklıklar ve/veya baskılar) içerir ve büyük miktarlarda kimyasal atık üretebilir, genellikle maliyet kapsamlı kullanım gerektiren toksik maddeler3 ,4. Buna karşılık, birden fazla bakteriyel türler kolayca çeşitli sektörlerde uygulanabilir malzemeler üretebilir. Bu malzemeler arasında polyhydroxyalkanoates (PHA)5 veya Poly (glycolide-Co-lactide) (PGLA)6, bakteriyel selüloz7, bakteriyel beton malzemeleri8, biyomimetik kompozitler9, amiloid bazlı yapıştırıcılar10veya Bio tabanlı elektrik şalterleri11, diğerleri arasında. Dahası, değerli malzemelerin bakteriyel üretimi genellikle yakın ortam sıcaklıklarında ve basınçlarda ve sulu ortamlarda, toksik bileşikler gerektirmeden veya üreterek gerçekleşir. Literatürde bakterilere sahip malzemeler üretilirken, bazı endüstriyel uygulamalar zaten12,13, bu tür malzemelerin uzamsal deseni için güvenilir bir yöntem ortaya çıkmıştır.
Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3B yazıcıyı 3B bakteriyel yazıcıya dönüştürmenin düz ileriye dönük bir yöntemi gösterilmektedir. Protokol, yaşam bakterilerini içeren ve sürdürmeye yarayan bir biyo-mürekkebin nasıl hazırlanacağı, hem de 3D baskının gerçekleştirilebilecek alt yüzeylerini nasıl hazırlamaktır. Bu yöntem, malzeme üretebilen çeşitli doğal ve mühendislik bakteriyel suşları ile kullanmak için uygundur. Bu bakteriler, bir 3D baskılı yapı içinde dağınık bir şekilde dağıtılır ve hala bakteri tarafından üretilen istenilen malzemelerin bir uzamsal dağılımı neden olacak metabolik aktivite, devam edebilir.
Bu baskı yöntemi biyosilme katkı üretimi sağlar, kendi kendine üretilen bir ekstrellüler matris ile çevrili bakteri toplamları. Biofilms hangi proteinler, polimerler, bakteriyel hücreler, oksijen ve besin tüm uzamsal yapılandırılmış olan heterojen 3D ağlar14. Bir biyofilm şeklinde iken, bakterilerin artan bir antibiyotik direnci ve yapısal sağlamlık sergiler, onları zor tıbbi kateter ve implantlar dahil yüzeylerden ortadan kaldırmak için yapmak. Biyofilm özellikleri için anahtar ve aynı zamanda en büyük zorluk biyofilm araştırma, biyofilm heterojenliği gibi görünüyor15,16,17. Dağınık kontrollü model biyofilmlerinin üretimi, biyofilm bileşenlerinin uzamsal desenlerini yeniden üretmeye veya ayarlamaya izin verecek şekilde özel bir ilgidir, neredeyse her yüzeyde biofillerin istikrarlı bir şekilde birikmesini anlamakta Doğa.
Bu makalede, bir indükör varlığında biyofilm proteinleri üreten mühendislik E. coli bakterileri içeren 3D baskılı Hidrojeller kullanarak biyofilm üretimi için bir yöntem sunar, hem de biyolojik madde oluşumu doğrulama yöntemleri2 . Bu biyosillerin ana ekstrelüler matris bileşenleri, kendinden birleştirilmiş csga proteinlerini içeren18 ' lik kaydırma amiloid lifleridir. E. coli bakterileri csga proteinlerini ifade etmeye indüklenmiş olduğunda, hücreleri baskı yüzeyinin yıkanması karşı koruyan istikrarlı bir model biyofilm oluşturur. Böyle bir 3D baskılı biyofilm, uzamsal olarak kontrol edilebilir ve çok ölçekli biyofilm yapısı-fonksiyon mekaniği veya materomics19soruşturma için yararlı bir araştırma aracı olarak hizmet verebilir. Bu ısmarlama biyofilm diğer uygulamalar arasında antibiyotik direnci mekanizmaları içine daha fazla araştırma sağlayan, biyofilm oluşumu ve mekanik özellikleri ilkelerini anlayış yardımcı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>3D-P Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printing software</td>
			<td>CoLiDo</td>
			<td>Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3886.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td>Model 3500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td>150 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhamnose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>DENE 3100103/25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>ProSense B.V.&#160;</td>
			<td>NE-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium alginate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrooxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28244.295</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional patterning of engineered biofilms with a do-it-yourself bioprinter

Biyosilmler, kendi kendine üretilen bir uzamsal desenli ekstrellüler matriks içinde gömülü bakteri toplamları vardır. Bir biyofilm içindeki bakteriler, potansiyel sağlık tehlikeleri gösteren gelişmiş antibiyotik direnci geliştirir, ama aynı zamanda içme suyu arıtma gibi çevresel uygulamalar için yararlı olabilir. Anti-bakteriyel terapötik ve biyofilm esinlenerek uygulamaların daha da geliştirilmesi, biyofilm oluşturma için yeniden üretilebilen, mühendislere yönelik yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyacaktır. Son zamanlarda, bir bakteriyel mürekkep ile değiştirilmiş bir üç boyutlu (3D) yazıcı kullanarak biyofilm hazırlama yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu makalede, bakteriye bağlı malzeme işleme birden fazla uygulama sunan bu verimli, düşük maliyetli 3D bioprinter oluşturmak için gerekli adımları açıklar. Protokol, Ekstruder 'in, kontrol edilebilir ve sürekli biyo-mürekkep akışını sağlayan bir şırınga pompası sistemine bağlı bir biyo-mürekkep dispenseri ile değiştirildiği uyarlanmış bir ticari 3D yazıcıyla başlar. Biyofilm baskı için uygun bir biyo-mürekkep geliştirmek için, tasarlanan Escherichia coli bakteri alginat bir çözelti içinde askıya alındı, böylece kalsiyum içeren bir yüzey ile temas içinde katılaşma. Baskı substrat içinde bir indükleştirici kimyasal dahil edilen biyo-mürekkep içinde biyofilm proteinleri ifade sürücüler. Bu yöntem, yazdırılan biyosillerin ayrık katmanlarından oluşan çeşitli uzamsal desenler 3D baskı sağlar. Bu tür uzamsal kontrollü biyosiller model sistemleri olarak hizmet verebilir ve diğerleri arasında, antibiyotik direnci önleme veya içme suyu arıtma dahil olmak üzere toplum üzerinde geniş kapsamlı bir etkiye sahip birden fazla alanda uygulamaları bulabilirsiniz.

Biyosilmların başarılı 3D baskı için ilk adım bir bioprinter içine ticari bir 3D yazıcı dönüştürüyor. Bu dönüşüm, yazıcının ekstruder ve ısıtıcısını kaldırarak, polimerik mürekkeple yazdırmak için tasarlanmış ve bunları yaşayan bakterileri içeren biyo-mürekkep yazdırmak için uygun bileşenlerle değiştirerek elde edilir (Şekil 1a). Bir şırınga pompasına bağlı bir boru sistemine bağlı olan ekstruder, bir pipet ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter at JoVE.com

Three-dimensional Patterning of Engineered Biofilms with a Do-it-yourself Bioprinter

Bu makalede, düşük maliyetli bir ticari 3D yazıcıyı, desenli biyosilmların yazdırmayı kolaylaştıracak bir bakteriyel 3D yazıcıya dönüştürme yöntemi açıklanır. Bioprinter ve biyo-mürekkep hazırlama tüm gerekli yönleri, hem de biyolojiler oluşumunu değerlendirmek için doğrulama yöntemleri açıklanmıştır.

Bir do-it-yourself Bioprinter ile tasarlanan Biyosilmların üç boyutlu deseni

Biofilms are aggregates of bacteria embedded in a self-produced spatially-patterned extracellular matrix. Bacteria within a biofilm develop enhanced ...

Bakterilerle 3D biyobaskı yeni geliştirilen bir tekniktir. Bu protokol, bakterilerle basılmış 3D mühendislik biyofilmlerini oluşturmanın kolay bir yolunu sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı ucuz bir ev yapımı 3D yazıcı kullanarak 3D baskılı biyofilm üretmek için yeteneğidir.Bizim 3D yazıcı nın olası bir uygulama yeni antibakteriyel tedaviler geliştirmek için kullanılabilecek tekrarlanabilir model biyofilmler oluşturmaktır. 3D baskı yaklaşımımız aljinat bazlı bioink ile uyumlu her türlü bakteriye uygulanabilir. Bioink ve baskı yüzeyleri hazırlanması oldukça standart prosedürler, 3D baskı işlemi, özellikle Z-ekseninin kalibrasyonu bazı uygulama gerektiren önemli bir adımdır.Ayarlanan erişim yüksekliğinin kalibrasyonu 3D yazıcımızın çözünürlüğünü etkileyecek tir ve kişisel deneyime güçlü bir şekilde bağlıdır. Bu yordam el ile ayarlamalar gerektirir ve yazılı bir biçimde açıklanabilir zordur. 200 mikrolitrelik pipet ucunu silikon boru uzunluğuna bağlayın ve pipet ucunu orijinal ekstrüzyonun yerine 3D yazıcının ekstrüder kafasına monte edin.Sonra, luria-Bertani suyu çözünmüş% 1 agar 400 mililitre beş azı dişil klorür çözeltisi dört mililitre ekleyin ve uygun antibiyotik ve indükleyiciler ile tamamlayın. Daha sonra, 15 milimetre Petri çanak her 150 milimetre içine LB agar çözeltisi 20 mililitre dağıtmak. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kapağı açık, çanak kuru.%3 sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi sterilize etmek için kaynama noktasına üç kez ısıtın. Daha sonra steril çözeltiyi kullanılana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bioink bakteriyel bileşeni hazırlamak için, antibiyotik içeren LB orta 50 mililitre kurucu GFP ekspresyonu için plazmidler taşıyan E.coli bakteri büyümek.Bir gecede 250 RPM ve 37 santigrat derecede kültürü salla. Kültürün bir gecede büyüme sonra, 3, 220 kez yerçekimi beş dakika için bakteri pelet ve sonra supernatant kaldırın. LB orta 10 mililitre bakteri pelet resuspend, ve% 3 sodyum aljinat 10 mililitre ekleyin.3B yazıcıyı bir bilgisayara bağlayın ve 3B yazdırma yazılımını açın. Yazdırma kafasını ana konumuna taşımak için X, Y ve Z eksenleri için Ana Ekran düğmesini tıklatın. Her baskı için, baskı yatağında belirli bir konuma hazırlanmış bir baskı alt katmanı yerleştirin.Baskı kafasını manuel kontrol altında 22 milimetrenin üzerinde bir yüksekliğe yükseltin, böylece hareket sırasında Petri kabının kenarıile çarpışmaz. Baskı kafasını plakanın üst üzerine yerleştirin ve pipet ucu baskı yüzeyine değene kadar aşağı doğru hareket ettirin. Bu Z ekseni konumunu yazdırma yüzeyinin yüksekliği olan Z1 olarak atayın.Ardından, yazdırma kafasını kaldırın ve el ile plaka alanının dışına taşıyın. Yazdırma kafası ile plaka yüzeyi arasındaki çalışma mesafesi Z2 olarak tanımlanıyorsa, yazdırma sırasında Yazdırma programına yazdırma yüzeyinin yüksekliğini ve çalışma mesafesini Z değeri olarak girin. İstenilen şekli yazdırmak için komutlar içeren önceden programlanmış bir G kodu dosyası yükleyin.Her komut satırında, yazdırma kafasının konumu X, Y ve Z eksenlerinde değiştirilebilir. Yazdırma yüzeyinin yüksekliği ve çalışma mesafesi olarak tüm yazdırma adımlarında Z değerini girerseniz emin olun. Şırıngalar içine sıvı bioink yükleyin ve 3D biyoyazıcı şırınga pompası onları monte.Ardından ekstrüzyon hızını saatte 0,3 mililitreye ayarlayın. Yazdır düğmesini tıklatarak bioink'i yazdırma alt katmanına yazdırın. Baskı başlayana kadar ve baskı kafası baskı yüzeyi ile temas etmeden önce şırınga pompasını başlatmak için bekleyin.Yazdırma sırasında, yazdırma kafası hareketini tamamen yazılım la kontrol edin. Baskı kafası baskının son noktasına varır varmaz şırınga pompasını durdurun, aksi takdirde fazla bioink baskı alt katmanına düşecek ve baskı çözünürlüğünü azaltacaktır. 3B yapıların inşası için, yazdırma kafasının tüm hareketleri G-code düzenleyicisinde kontrol edilir.İkinci katmanın yazdırma yüksekliğini artırmak için, ilk katmanın yazdırma yüksekliğini yazın ve koddaki Z değerini 0,2 milimetre artırın. Daha sonra, daha yüksek bir katmana taşınırken Z değerini 0,1 milimetre artırın. Curli lifleri gibi biyofilm bileşenlerinin üretimine izin vermek için yazdırılan numuneleri üç ila altı gün oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.Daha sonra plakayı floresan tarayıcıya yerleştirin ve plakaları görüntüleyin. Aljinat matrisini eritmek için, pH 7'de 0,5 molar sodyum sitrat çözeltisinin 20 mililitresini baskılı substrata ekleyin. 30 rpm sallayarak iki saat boyunca oda sıcaklığında plaka kuluçka.Daha sonra, sitrat tedavisinden önce ve sonra plakaların görüntüleri ile karşılaştırmak için sıvı yı atın ve plakaları tekrar görüntüleyin. 3D biyoyazıcı, hidrojelleri çeşitli iki boyutlu ve üç boyutlu şekillerde kapsülleme bakterileri oluşturabilir. Bu baskılı şekiller daha sonra biyofilm oluşumu başarılı olup olmadığını veya aljinat matris tamamen bir sodyum sitrat çözeltisi kullanılarak çözülmüş olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir.Indüklanabilir Curli üretim plazmidolmadan bioink durumunda, basılı desen tamamen sodyum sitrat tedavisinden sonra çözülmüş, hiçbir biyofilm Curli ağ oluşmuştu anlamına. İndüklenebilir Curli üretim plazmidi içeren bakteriler sodyum sitrat tedavisinden sonra çözünmedi, baskılı bakterilerin bakteri baskılı desen stabilize etmek için yeterince geniş bir Curli ağ oluşturmak mümkün olduğunu gösteren. Çok katmanlı yapılar oluşturmak için, g kodu düzenleyicisi denetleyerek ek katmanlar yazdırılabilir.Bir örnekteki yazdırılan katmanların sayısının artırılması, yazdırılan yapıların genişliğinin ve yüksekliğinin artımlı olarak artmasına neden oldu. Curli proteinlerini inducibly üretmek için tasarlanmış E.coli çok katmanlı yapılar halinde basıldığında, sodyum sitrat tedavisi örnekleri eritmedi, e.coli üreten olmayan içeren çok katmanlı yapılar çözüldü. 3D baskı prosedürünün en kritik bölümleri Z ekseninin kalibrasyonu ve baskının başlatılması ve şırınga pompasının başlatılmasının koordinasyonu.Bu işlem için geliştirilen bioink oldukça yumuşak, düşük tokluk ile. Mekanik stabiliteyi sağlamak ve iyileştirmek için bioink'te daha fazla değişiklik yapılabilir. Bu 3D baskı tekniği, biyomimetik malzemelerin üretilmesini mümkün kılan mükemmel mekanik özelliklere sahip biyofilmlerin üretilmesini sağlar.Bu bakterileri kullanırken eldiven gibi uygun korumayı kullanın.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

Model Vocal Fold Polip'in Neden Olduğu Üç Boyutlu Akış Ayrımının Araştırılması

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Astrocyte ağlar gelişimsel mekanizmaları özetlemek ve sinir sistemi yeniden oluşturma işlemi kolaylaştırmak için tasarlanmış üç boyutlu doku uyumlu

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Three-dimensional Printing of Thermoplastic Materials to Create Automated Syringe Pumps with Feedback Control for Microfluidic Applications

Üç boyutlu termoplastik malzemelerin oluşturmak için yazdırma şırınga pompalar geribildirim denetimiyle mikrosıvısal uygulamalar için otomatik

Microfluidics has become a critical tool in research across the biological, chemical, and physical sciences. One important component of microfluidic ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...