Name: using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens
Uploaded: 2019-05-12T15:00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens a

وقد حظي هذا العمل بالدعم بتمويل من مؤسسه ويلكوم ترست ، وغيتس ، ومركز كامبردج للبحوث الطبية الحيوية. جندي هو طالب الدكتوراه السريرية التي تدعمها الثقة Wellcome.

<ol>
	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+)+liver+stem+cells,+hepatic+organoids+and+regenerative+medicine.">Lgr5(+) liver stem cells, hepatic organoids and regenerative medicine.</a> Regenerative Medicine. 8 (4), 385-387 (2013).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li><li>Dye, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+human+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids.">In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Karthaus, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multipotent+luminal+progenitor+cells+in+human+prostate+organoid+cultures.">Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.</a> Cell. 159 (1), 163-175 (2014).</li><li>Matano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+colorectal+cancer+using+CRISPR-Cas9-mediated+engineering+of+human+intestinal+organoids.">Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).</li><li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+cholangiocytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of cholangiocytes from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 853-861 (2015).</li><li>Leha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+platform+to+characterise+human+induced+pluripotent+stem+cell+lines.">A high-content platform to characterise human induced pluripotent stem cell lines.</a> Methods. 96, 85-96 (2016).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+cancer+mutations+in+cultured+human+intestinal+stem+cells.">Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.</a> Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).</li><li>Schreiber, F., Arasteh, J. M., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Resistance+Mediated+by+IL-22+Signaling+at+the+Epithelial-Microbiota+Interface.">Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).</li><li>Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+opportunities+of+the+IL-22-IL-22R1+system.">Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+functional+interleukin-22+(IL-22)+receptor+complex:+the+IL-10R2+chain+(IL-10Rbeta+)+is+a+common+chain+of+both+the+IL-10+and+IL-22+(IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor,+IL-TIF)+receptor+complexes.">Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-22+promotes+phagolysosomal+fusion+to+induce+protection+against+Salmonella+enterica+Typhimurium+in+human+epithelial+cells.">Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).</li><li>Nozaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+with+intestinal+epithelial+organoids+allows+efficient+expansion+and+motility+analysis+of+intraepithelial+lymphocytes.">Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes.</a> Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+Shiga+toxin+producing+Escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli.</a> PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li><li>Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Intestinal+Organoids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Use+as+an+Infection+System.">Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li></ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

يحدد هذا البروتوكول التفريق بين hiPSCs في iHOs وفائدتها كنموذج لمحاكاة التهابات المعوية. وفيما يلي ، نقدم الخطوط العريضة للخطوات الحاسمة في البروتوكول وأي تعديلات أو تحسينات قمنا بها.
هذا البروتوكول يبسط عمليه التمايز من hiPSCs مقارنه بالعمل المنشور سابقا25. الأساليب المستخدمة سابقا تتطلب نقل hiPSCs من نظم الثقافة Hipscs الأخرى (علي سبيل المثال ، المغذية Hipscs الثقافة) إلى المتوسطة المحددة كيميائيا-البولي فينيل الكحول (اليه-بفا). هذا النقل إلى اليه المعالجة النظيفة-بولي يستغرق عاده 2-3 أسابيع ويتطلب التغذية اليومية لل hiPSCs. كما ان هذا البروتوكول لم يكن فعالا باستمرار ، مع عدم وجود بعض الاختلافات ؛ ولذلك ، فاننا التمايز الثلاثي باستخدام نفس عوامل النمو ولكن بدءا من hiPSCs نمت في ثقافة الخلايا الجذعية المتوسطة (بدلا من اليه التنمية النظيفة-بولي) واستبدال اليه-بولي مع متوسط ثقافة الخلايا الجذعية خلال أيام التمايز 0-3. وقد نجح هذا الأمر بالنسبة للخطوط الخمسة لأفراس النهر المستقلة الثلاثة حتى الآن ، مما يجعل عمليه التمايز أكثر سرعه وكفاءه. وهذا يسمح أيضا لقضاء عطله نهاية الأسبوع خاليه من hiPSCs قبل التمايز ، مما يتيح المزيد من المرونة في ثقافة Hipscs. خطوط الهيدروغرافي التي تنتجها هذه الطريقة وقد تم النمط الظاهري لعلامات ظهاره المعوية كما وصفنا سابقا لخطوط hiPSC Kolf2 ، Yemz1 ، و Lise116 وتظهر تمييز ظاهريا من ihos المنتجة باستخدام السابق البروتوكول.
بعد البذر ، iHOs تتطلب ما لا يقل عن 1 شهر من المرور الروتيني ، مع تقسيم كل 4-7 أيام لتسهيل النضج. لاحظ انه سيكون هناك بعض الاختلاف في تطوير المعهد الهيدروغرافي الكتروني اعتمادا علي خط iPSC المستخدمة وكثافة الثقافة الاوليه. خلال المقاطع القليلة الاولي ، سيكون هناك تلوث واضح الخلايا التي ليست iHOs. هذه سوف يموت في نهاية المطاف ، وترك ثقافة نظيفه كرويه و ، بعد حوالي 4 أسابيع ، المبرعمه ihos. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام نظام التصوير في هود لتحديد ومرور iHOs فقط مع المورفولوجية المطلوب. وبما ان iHOs ناضجه ، فانها سوف تتطلب تقسيم كل 6-7 أيام ، تعتمد علي معدل النمو والكثافة. إذا حدث اي مما يلي ، يجب تقسيم iHOs قبل هذه النقطة: تجاويف الاناره من iHOs تبدا لملء مع الخلايا الميتة ، مصفوفة غشاء الطابق السفلي يبدا في التفكك ، و iHOs تبدا في النمو من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، أو الثقافة هي أيضا كثيفه ووسائل الاعلام تبدا في الذهاب الصفراء بسرعة كبيره.
وبمجرد ان يتم تاسيس ثقافة المعهد الهيدروغرافي الوطني ، إذا كان ظهور التغيرات في اي وقت أو يختلف عن المتوقع (علي سبيل المثال ، تظل الثقافات كرويه ، بدلا من المهد) ، يجب ان يكون التنميط الظاهري عبر مناعي ومؤشرات الخلايا المتكررة للتاكد من ان التفريق بين أنواع الخلايا داخل iHOs (علي سبيل المثال ، الخلايا القدح ، الخلايا Paneth) لا تزال سليمه. إذا كان iHOs لم تعد التفريق ، ثم ينبغي التخلص منها والتفريق أو المرور في وقت سابق من iHOs يجب ان تكون أذابه وأعاده تشكيلها. إذا توقف iHOs للتمييز ، والأسباب المحتملة هي عصر الثقافة (إذا كان أكثر من 6 أشهر من العمر) ، ونشاط عوامل النمو (ضمان ان يتم أعاده تشكيل هذه وفقا لتعليمات الشركات المصنعة وابقي المجمدة في الارصفه الصغيرة لتجنب عده دورات تجميد الذوبان) ، والممرات المتكررة جدا أو العنيفة (بشكل عام ، يجب ان يحدث المرور مره واحده في الأسبوع فقط ، وإذا تم فصل iHOs يدويا بقوة جدا علي أساس منتظم ، فانها سوف تتوقف عن التفريق بشكل كامل).
انشانا عن طريق التسلسل RNA ان آيل-22 التحفيز 18 ح قبل العدوى اوبريجولاتيس الجينات المضادة للميكروبات وتلك المشاركة في النمط الظاهري الدفاع الحاجز. قبل استخدام ihso الجديدة لمقايسات تنطوي علي المسبق مع rhil-22 (أو خلوي بديل إذا كان النظام قيد الاستخدام لهذا) ، فانه من المستحسن للتحقق من نشاط الجينات المعروف ان اوبريجولاتيد من قبل السايسيسين (في حاله IL-22 ، استخدمنا DUOX2 و LCN2) عبر Qpcr بعد تحفيز ihos ، لضمان التعبير مستقبلات والإشارات سليمه. قبل أول استخدام ل IL-22 ، ونحن أيضا نفذت مناعي لتحديد موقع مستقبلات IL-22 علي iHOs لإثبات ان التعبير عن مستقبلات IL-22 كان القاعدية ، وهذا يعني انه يمكن تحقيق التحفيز ببساطه عن طريق أضافه rhIL-22 إلى ثقافة الهيدروغرافي المتوسطه. ومع ذلك ، إذا تم التعبير عن مستقبلات بشكل غير ملائم ، قد يكون هذا البروتوكول ليتم تكييفها لتقديم يغاندس بشكل غير صحي.
وترتبط المزالق المتعلقة بنظام الحقن المجهري عموما بحساسية الابر المطلوبة للحقن. هنا ، ونحن نستخدم نصائح الحفر المتاحة تجاريا مع تجويف 6 μm. فمن الممكن لسحب ابر الحقن من الشعيرات الدموية الزجاجية26 علي الرغم من ان هذا قد يكون اقل موحده ، مما يؤدي إلى تسرب من طرف ابره أو احجام غير متناسقة يجري حقنها في ihos. ومن المهم التاكد من ان الحقن قد وقعت في تجويف الهيدروغرافي ، وهو سبب واحد لاستخدام الفينول الأحمر كصبغه ؛ سيتم توسيع iHOs بشكل واضح وعقد الاحمرار الأحمر ، مما يسمح اليقين حول التي تم حقن iHOs. في بعض الأحيان سوف تسد الابر مع الحطام من جدار الهيدروغرافي الخاص. إذا كانت هذه هي الحالة ، قم بازاله طرف الابره من داخل الشبكة الهيدروغرافية الكترونيه واضغط علي زر التنظيف علي نظام الحقن المجهري. وهذا سوف تنتج فتره وجيزة من ارتفاع ضغط الهواء الذي ينبغي ان مسح الانسداد. وسوف تحفز أيضا بعض تسرب من البكتيريا البكتيرية علي لوحه; لذلك ، إذا حدث هذا ، يجب ان تتكرر الإجراءات النظيفة علي جميع لوحات لضمان المساواة في البكتيريا البكتيرية لكل لوحه. واحده من المزايا الكبيرة لل iHOs المشتقة من hiPSC هي حجمها. العضوية المعوية من الفئران والعضوية البشرية الاوليه هي أصغر بكثير (قياس ما يصل إلى ~ 100 ميكرون و 100-300 ميكرومتر ، علي التوالي27، مقابل 250-1500 μm لل ihos المشتقة hipsc) ، وهذا يعني ان حقن كميات كبيره من organoids سيكون إبطا. وهذا يسمح لتجارب الحقن علي نطاق أوسع ان تكون ثلاثية في iHOs المشتقة hiPSC. ومن الممكن أيضا لدراسة محتويات الاناره من iHOs عن طريق حصاد لهم ما بعد الاصابه وفصل يدويا iHOs إلى DPBS ، والإفراج عن محتوياتها الاناره. للحقن المجهري ، نوصي باستخدام تركيز عال من البكتيريا. وجدنا ان تركيزات اقل لم تكن كافيه لتوليد استجابه من IECs تتالف من iHOs. بالاضافه إلى ذلك ، كان من الصعب في وقت لاحق تحديد موقع البكتيريا المستوعبة باستخدام المجهر. قد يكون من الممكن الحصول علي الأمثل لسلالات بكتيرية مختلفه.
وباختصار ، فان iHOs المشتقة من hiPSC توفر نموذجا واعدا لتشريح الاستجابة الظهاريه للالتهابات المعوية مباشره ، سواء عن طريق دراسة حسابات الغزو داخل الخلايا ، أو التصوير ، أو قياس مستويات السايسيسين في سوبرناتانتس الهيدروغرافي ، أو حصاد الجيش النيبالي الريبي دراسة التغيرات العابرة بعد التعرض لمسببات الامراض. وسوف تكون فائدتها أكثر وضوحا في المستقبل لإنشاء نماذج العدوى لمسببات الامراض المقيدة للإنسان وفي استغلال إمكانيات استخدام هذه التكنولوجيا لتخصيص البحوث عن طريق دراسة الطفرات الوراثية المرتبطة بالامراض المحددة والتصدي للمخدرات.

في السنوات الاخيره ، تم تعزيز دراسة التفاعلات بين المضيف والممرض من خلال تطوير نماذج "organoid" ، حيث يمكن إنتاج التمثيلات ثلاثية الابعاد لظهاره الأمعاء من المقدمين المختلفين. ويمكن توليد "الاوليه" العضوية مباشره من الخلايا الجذعية المعوية التي تحصد من الخزعات المعوية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن توليد الأرغن المعوية من hiPSCs. ويمكن ان يقال نفسه من العديد من الانسجه ، مع المعدة1، الكبد2، البنكرياس3،4، الدماغ5،6، الرئة7، والبروستاتا8 organoids المستخدمة من قبل العديد من الباحثين لنموذج المرض. هناك العديد من التطبيقات المثيرة للنظام organoid ، بما في ذلك النمذجة السرطان9 وفحص المخدرات10، ولكن هنا نركز علي استخدام ihos كنموذج العدوى ، وذلك باستخدام S. [ انتركا ] [سرفار] [تيموريوم] ([س.]. التيفوئيد) كممرض مثالي والمعالجة المسبقة مع IL-22 كعلاج.
وفي هذه الدراسة ، فان الهياس المستخدمة لتوليد الهيدروغرافية هي "Kolf2" iPSCs ، المتولدة من فرد سليم ومتاحه من اتحاد مبادرة الخلايا الجذعية مستحث البشرية (Hipscs ؛ www.hipsci.org) ، وهي لوحه مرجعيه مفتوحة الوصول تتميز خطوط hiPSC11. ميزه واحده من استخدام hiPSCs كمقدمي لل organoids هو ان هناك الآن بنوك واسعه من خطوط iPSC المانحين الصحية المتاحة ، وهذا يعني انه يمكن التحقق من صحة النتائج في عدد من خطوط الخلايا مع خلفيات وراثيه مختلفه. الاضافه إلى ذلك ، إذا كان الباحثون يرغبون في النظر في الاشكال المحددة المرتبطة بالمرض واحده الاشكال النيوكليوتيد (SNPs) ، فمن الممكن استخدام CRISPR/كاس 9 لهندسه الطفرات في خط خليه صحية ، التالي إنتاج كل من خط متحولة والحفاظ علي ايزوتون خط التحكم للمقارنة12. في تجربتنا ، والعضوية المعوية المشتقة hiPSC هي أكبر في الحجم من نظرائهم الاساسيه وأكثر اتساقا في الثقافة ، مما يجعل لأقل الحقن المجهرية الصعبة من الناحية الفنية ويحتمل ان تسمح مجموعه أكثر تنوعا من مسببات الامراض لتكون درس. ويمكن الديتريوم الحفاظ علي النظام الكتروني للمنظمة ، وقد نشرنا ثقافات المعهد الهيدروغرافي الكتروني لمده تصل إلى سنه لإنتاج مواد لتجريبها.
في الجسم الحيوي, IECs تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التوازن المعوي وقد تمنع مباشره مسببات الامراض, علي الرغم من ان أليات التي يحدث هذا لا يفهم جيدا. ومن المعروف ان سيتوكين آيل-22 ان يكون لها دور في الحفاظ علي الحاجز الظهاريه الأمعاء13 وتشارك في الحث وإفراز الببتيدات المضادة للميكروبات و مستقطبات استجابه للعدوى14. يتم إنتاجه من قبل خلايا T المنشطة (وخاصه ، خلايا Th17) وكذلك من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ويربط إلى مستقبلات هيتيروديميريك تتالف من IL-22R1 و IL-10R2 الوحدات الفرعية15. عبرت المستقبل ل [آيل-22] [بسلي] علي [اياكس], يعني ان في ال [أو] نموذج, هو يمكن ان [بريوسنويد] ال [ارغنويدس] مع [رهيل-22] ببساطه بإضافته إلى ثقافة متوسطه16. عيب واحد من النظام العضوي هو انه يفتقر إلى الاستجابة المناعية المرتبطة التي يتم تسليمها عاده من قبل أنواع الخلايا المناعية الأخرى. ومع ذلك, النماذج الناشئة التي تحاول الزراعة العضوية العضوية مع الخلايا الليمفاوية المعوية لتمثيل أفضل هذا17,18.
ان استخدام نظام الحقن المجهري هو المفتاح لمحاكاة العدوى في نموذج الشبكة الهيدروغرافية الكترونيه ، لان هذا يسمح بالتسليم المباشر لمسببات الامراض إلى السطح الابيكي لظهاره ، كما يحدث في حاله العدوى المجرية. وأضافه الفينول الأحمر إلى المحلول البكتيري الذي يحقن في الهيدروغرافية المذكورة هي التي أصيبت بالعدوى ، التالي تجنب الحقن المتكرر لنفس الهيدروغرافية. Organoids كما السفن لنمذجة العدوى تنمو في الاستخدام ، مع مسببات الامراض مثل الملوية بيلوري،19 نوروفيروس ،20 الروتا ،21 شيغا-المنتجة للسموم القولونية 22، وقد ثبت ان الشبكة العنكبوتية23، وفيروس زيكا24 ، علي قيد الحياة وتتكرر داخل هذه النظم. ويمكن تطبيق هذه التكنولوجيا علي نطاق أوسع من مسببات الامراض ، ولا سيما الكائنات الحية التي يصعب استزراعها ، مثل البروتوزوا ، أو مسببات الامراض المقيدة بالإنسان ، من أجل الحصول علي معلومات مباشره عن الاستجابة الظهاريه البشرية للعدوى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:785px;" width="785">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M6250-10ML</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">5 mm glass bottom injection dishes</td>
			<td style="width:107px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:101px;">P50G-0-14-F</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12634010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Alexa fluor 647 phalloidin</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A22287</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17504044</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">BMP-4 recombinant human protein</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">PHC9534</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10 &#956;g/mL, final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Cell recovery solution (cell lifting solution)</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">354253</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:101px;">ab120890-5mg</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3 mM, final concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Collagenase, type IV powder</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17104019</td>
			<td style="width:303px;">Reconstitute at 0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Corning cryogenic vials</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Costar TC treated 24 well culture plates</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">DAPI dilactate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D9564-10MG</td>
			<td style="width:303px;">Use at 10 nM concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Dulbecco&#8217;s PBS (No MgCl2 or CaCl2)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190-144</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Dulbecco&#8217;s PBS (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D8662-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system)</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">920000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Eppendorf Femtojet express&#160; (microinjection system)</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">5248 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">G1272-10ML</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Goat anti-Salmonella, CSA-1</td>
			<td style="width:107px;">Insight Biotechnology</td>
			<td style="width:101px;">02-91-99</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1:20 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15630056</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">KnockOut Serum Replacement (setrum replacment)</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">10828010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMAX supplement (glutamine supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A2916801</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">LY294002</td>
			<td style="width:107px;">Promega UK</td>
			<td style="width:101px;">V1201</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 50 mM, final concentration 10&#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">356231</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">MEM non-essential amino acids&#160; solution (100x)</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">11140035</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">N2 serum-free supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17502048</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15140163</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P0290-100ML</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25&#176; tip angle, 6 &#181;m inner diameter</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">5195000087</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Prostaglandin E2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">P0409-1MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human FGF basic</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">233-FB-025</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human IL-22</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">6057-NG-100</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">6057-NG-100</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human R-spondin1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">4645-RS-025</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Recombinant human/mouse/rat Activin A</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">338-AC-050</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:275px;">Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium)</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Gibco</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">12648010</td>
			<td rowspan="2" style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:101px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3&#956;M, final concentration 3mM</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">61870010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Triton X-100 (cell lysis buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">RES9690T-A101X</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Versene (EDTA solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15040066</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Vitronectin XF</td>
			<td style="width:107px;">Stemcell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:101px;">7180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Y-27632 dihydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Y0503-1MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens

المعوية ' organoid ' (الهيدروغرافي) النظام ، حيث الهياكل ثلاثية الابعاد ممثل البطانة الظهاريه من الأمعاء البشرية يمكن ان تنتج من الخلايا الجذعية مستحث الإنسان المستحثة (hiPSCs) والحفاظ عليها في الثقافة ، ويوفر فرصه مثيره لتسهيل نمذجة الاستجابة الظهاريه للعدوى المعوية. في الجسم الحيوي, الخلايا الظهاريه المعوية (IECs) تلعب دورا رئيسيا في تنظيم التوازن المعوي وقد تمنع مباشره مسببات الامراض, علي الرغم من ان أليات التي يحدث هذا لا توضح تماما. وقد تبين ان السايتوكيني interleukin-22 (آيل-22) تلعب دورا في صيانة والدفاع عن الحاجز الظهاريه الأمعاء ، بما في ذلك حمل الإفراج عن الببتيدات المضادة للميكروبات و مستقطبات ردا علي العدوى.
ونحن وصف التفريق بين السيطرة الصحية hiPSCs في iHOs عن طريق أضافه مجموعات خلوية محدده إلى ثقافتهم المتوسطة قبل تضمينها في الطابق السفلي غشاء المبنية علي أساس مصفوفة نظام الثقافة المعوية. مره واحده مدمجه, وتزرع iHOs في وسائل الاعلام تستكمل مع نوجين, R-سبوندين-1, عامل نمو البشرة (EGF), CHIR99021, بروستاغلاندين E2, و 27632 ثنائي هيدروكلوريد مونوهيدرات. وتؤدي المقاطع الاسبوعيه من خلال التعطيل اليدوي للهيكل التنظيمي للمنظمة الهيدروغرافية الخاصة إلى تشكيل النظام الرئيسي الذي يضم بعض الهياكل المبنية علي السرداب/الزغب. جميع iHOs تظهر ظهاره متمايزة تتكون من الخلايا القدح ، والخلايا الغدد الصماء ، والخلايا Paneth ، والأمعاء المستقطبة ، والتي يمكن تاكيدها عن طريق المناعي لعلامات محدده من كل مجموعه فرعيه الخلية ، ونقل المجهر الكترون (TEM) ، والكمية PCR (qPCR). لنموذج العدوى ، السالمونيلا معوي سيرفار التيفوئيد SL1344 هي ميكروحقن في تجويف ihos وحضنت لمده 90 دقيقه في 37 درجه مئوية ، ويتم اجراء فحص الحماية جنتاميسين تعديل لتحديد مستويات داخل الخلايا الغزو البكتيري. يتم التعامل مع بعض iHOs أيضا مع الإنسان المؤتلف IL-22 (rhIL-22) قبل العدوى لتحديد ما إذا كان هذا السايسيسين واقيه ضد عدوي السالمونيلا .

بعد بدء عمليه التمايز ، يجب ان تمر الخلايا من خلال مرحله تشكيل الأديم الباطن النهائي متبوعا زخرفه المؤخر قبل التضمين في مصفوفة غشاء القبو. خزان سوف تشكل والثقافات مع كميات كبيره من المواد الملوثة سيتم مسح علي مدي فتره من عده أسابيع كما iHOs ناضجه. تظهر الصور التوضيحية لعمليه التمايز والتضمين والمرور في الشكل 1.
الاعداد لنظام الحقن المجهري كما هو موضح في الشكل 2. و iHOs هي ميكروحقن مع محلول الفينول الأحمر/البكتيرية والاحتفاظ بلونها الأحمر, السماح للتعرف علي iHOs المصابة لمنع الحقن المكررة. يتم اجراء التهم من البكتيريا داخل الخلايا مطلي بعد فحص الحماية جنتاميسين تعديل; المسبق مع rhIL-22 يقيد S. عدوي التيتيموريريوم ، مع عدد اقل من البكتيريا داخل الخلايا التي لوحظت بعد علاج rhIL-22 (الشكل 3). ونحن أيضا بشكل روتيني معالجه iHOs المصابة للمناعة ، أو TEM ، من أجل تسهيل التصور من التفاعلات المضيفة IEC-البكتيرية (الشكل 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig1.jpg"> الشكل 1: التفريق الموجه من iPSCs إلى iHOs. تسلسل تمثيلي من التمايز من iPSCs إلى iHOs ، مما يدل علي التغييرات المورفولوجية التي لوحظت وعوامل النمو اللازمة لدفع هذه التغييرات. يتم تشكيل الأديم الباطن النهائي في اليوم 4 من التمايز ، بعد التعرض لتركيزات محدده من مجموعات من activin A ، FGF ، BMP-4 ، LY294002 ، و CHIR99021. بعد 8 أيام ، وزخرفه من هذا الأديم الباطن نهائي مع تركيزات محدده من CHIR99021 والنتائج حمض الريتينويك في تشكيل هندغوت. التضمين اللاحق ، يتم ملاحظه التشكيل الكروي. بعد المرور المستمر باستخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي الداعم مضافه مع المتوسطة تستكمل مع عوامل الانتشار المعوية R-سبوندين 1 ، نوجين ، egf ، CHIR99021 ، وبروستاغلاندين E2 ، والتقدم الخزان في ihos التي المبرعمه. (تم التقاط الصور بالتكبير بدقه 4x – 10x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2.jpg"> الشكل 2: الحقن المجهري للمنظمة الهيدروغرافية الخاصة مع S. Typhimurium. (ا) نظام الحقن المجهري (انظر جدول المواد) المرفق في الغرفة البيئية ؛ وهذا يسمح للحقن iHOs في بيئة تسيطر عليها (37 درجه مئوية/5 ٪ CO2). (ب) يتم تسليم العين البكتيرية مباشره إلى تجويف الشبكة الهيدروغرافية التابعة باستخدام ميكروشعري ملحق بنظام الحقن المجهري. (ج) من خلال خلط البكتيريا البكتيرية مع الفينول الأحمر ، فمن الواضح التي قد أصيبت ihos ، التالي تجنب الحقن المكررة من نفس المعهد الهيدروغرافي التابع. تم التقاط الصور في التكبير 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig3.jpg"> الشكل 3: المعالجة المسبقة من iHOs المستمدة من خط الخلية Kolf2 مع rhIL-22 يقيد S. SL1344 في الخلايا الظهاريه المعوية. لاختبارات الحماية جنتاميسين ، تم التعامل مع iHOs مع 100 ng/mL rhIL-22 18 h قبل العدوى ، أو ترك دون علاج ، وحضن لمده 90 دقيقه بعد الاصابه. المعطيات [منس] من ثلاثه [تشنيكل] فنيه ل ثلاثه احيائيه متماثلة ± [سيم]. لاختبار اهميه, وقد استخدمت الاختبارات مان ويتني يو; p < 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2.jpg"> الشكل 4: تفاعل IECs مع s. تيموريريوم SL1344. هذه اللوحات تثبت iHOs حقن مع S. SL1344 وحضنت لمده 3 ساعات ، قبل التثبيت والمعالجة ل (ا) المناعي أو (ب) المجهر الكترون الإرسال. في اللوحة A، وينظر البكتيريا داخل التجويف الهيدروغرافي والتفاعل مع ظهاره. وملطخه نوى مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) ديلاكتوات (الأزرق) ، اغشيه الخلايا مع phمسبوك (الأحمر) ، والبكتيريا مع CSA-1 (الأخضر). تؤخذ الصور في التكبير 20x. ويبين الفريق باء ثلاثه مسارات مختلفه للمعالجة داخل الخلايا من السالمونيلا بعد الغزو ؛ وينظر إلى البكتيريا (ا) داخل فجوه التي تحتوي علي السالمونيلا، (ب) الحرة داخل السيتوبلاسما ، و (ج) التي تمر بالغيار الذاتية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>RPMI/B27 المتوسطة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مكون:</td>
			<td>المبلغ:</td>
		</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640 وسائل الاعلام مع الملحق الجلوتامين</td>
			<td>500 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 المصل خاليه 50x الملحق</td>
			<td>10 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>متوسط النمو القاعدي للمنظمة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مكون:</td>
			<td>المبلغ:</td>
		</tr>
<tr>
<td>متقدم DMEM/F12</td>
			<td>500 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 المصل خاليه 50x الملحق</td>
			<td>10 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>مكمل مصل الدم الخالي من N2 100x</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES 1 M</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-الجلوتامين 200 mM</td>
			<td>5 مل</td>
		</tr>
<tr>
<td>عوامل النمو لمتوسط نمو قاعده الهيدروغرافية الخاصة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مكون:</td>
			<td>المبلغ:</td>
		</tr>
<tr>
<td>المؤتلف الإنسان R-spondin1</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>المؤتلف الإنسان نوجين</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>عامل نمو البشرة (EGF)</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>بروستانت</td>
			<td>2.5 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد مونوهيدرات</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفات إعلاميه.

Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens a

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث المعوية المشتقة لدراسة وتعديل الحماية الخلوية الظهاريه ضد السالمونيلا ومسببات الامراض الأخرى

الإنسان المستحثة مستحث الخلايا الجذعية (hiPSC)-المشتقات المعوية المستمدة توفر فرصا مثيره لنمذجة الامراض المعوية في المختبر. ونحن نظهر التمايز من hiPSCs في العضوية المعوية (iHOs) ، وتحفيز هذه iHOs مع السايتوكينات ، والحقن المجهري من السالمونيلا التيفوئيد في التجويف الهيدروغرافي ، مما يتيح دراسة الغزو الظهاريه من قبل هذا الممرض.

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

يوضح هذا البروتوكول فائدة الجهاز العضوي المعوي المشتق من الخلايا الجذعية لنمذجة الغزو الظهاري بواسطة مسببات الأمراض المعوية ، وتعديل هذه العملية باستخدام السيتوكينات. الحقن الدقيق يسمح لمسبب المرض من الفائدة التي يمكن تسليمها مباشرة في تجويف تجويف تجويف الجهاز ، وتكرار عملية أكثر قربا من العدوى في الجسم الحي. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة مسببات الأمراض المعوية المختلفة أو السيتوكينات البديلة ذات الأهمية.أود أن أقترح استكمال تشغيل تجريبية من الإجراء مع الأحمر الفينول فقط من أجل السيطرة على تقنية الحقن المجهري قبل استخدام مسببات الأمراض. في اليوم الثاني، تبدأ التمايز عن طريق تغيير وسائل الإعلام إلى 10 ملليلتر من الخلايا الجذعية المتوسطة ثقافة، تكملها عوامل النمو. في اليوم السادس، تغيير وسائل الإعلام إلى 10 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI-B27، تستكمل مع ستة micromolar CHIR99021، بالإضافة إلى ثلاثة حمض الريتينويك ميكرومولر للبدء في نقش endoderm الخلفي إلى hindgut.في يوم التمايز 10، تضمين hindgut في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. أولا، إزالة وسائل الإعلام من لوحة hindgut، وغسل لوحة مع الكالسيوم المغنيسيوم خالية من DPPS مرة واحدة. إضافة خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز إلى لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.المقبل، تعطيل collagenase بإضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز إلى لوحة. يجب أن تكون الخلايا الخلفية عائمة عند هذه النقطة. جمع تعليق hindgut في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.ثم جهاز الطرد المركزي في 240 مرات-G لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي، الماصات قبالة السوبر، إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز، وكسر hindgut إلى قطع أصغر عن طريق الأنابيب بلطف، والطرد المركزي مرة أخرى في 95 مرات-G لمدة دقيقة واحدة. غسل الخلايا في وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز مرتين.إعادة تعليق الخلايا في 300 إلى 500 ميكرولترات من متوسطة النمو الأساسية، وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولترات من هذا الحل إلى 1.5 ملليلتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إعداد لوحة 24-جيدا على سخان لوحة في 37 درجة مئوية. و بقعة من أصل 60 ميكرولترات من خليط مصفوفة الخلية hindgut في بئر واحد من لوحة 24-جيدا.السماح لها لتعيين لفترة وجيزة والتحقق من كثافة تحت المجهر. بعد اكتشاف بقية المصفوفة في لوحة 24 جيدا، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم إضافة 800 ميكرولتررس من وسائل الإعلام نمو قاعدة تحتوي على عوامل النمو إلى كل بئر من لوحة 24-جيدا.لتمرير organoids، أولا إزالة وسائل الإعلام منها، واستبدالها مع 500 ميكرولترات لكل بئر من حل رفع الخلية. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 40 إلى 50 دقيقة، وعند هذه النقطة يجب أن تكون تطفو organoids في الحل. بلطف الماصات organoids وخلايا رفع الحل في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر، في محاولة لعدم تفريق organoids.بعد السماح للعضية لتسوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ، وإزالة supernatant والخلايا المفردة. resuspend organoids في خمسة ملليلتر من متوسطة النمو الأساسية ، والماصات لهم بلطف لغسل. جهاز طرد مركزي في 95-مرات-G لمدة دقيقتين.المقبل، إعداد لوحة 24-جيدا على سخان لوحة في 37 درجة مئوية داخل غطاء محرك السيارة، وإزالة سوبرنات من بيليه organoid. ثم، باستخدام ماصة P1000، resuspend organoids في 300 إلى 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام نمو قاعدة لتفريق organoids إلى قطع أصغر. ضع ما يقرب من 100 ميكرولترات من الأعضاء في 1.5 ملليلتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي والماصات لفترة وجيزة لخلط.بقعة من أصل 60 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر واحد من لوحة 24-جيدا. بعد تركه لتوطد لمدة 30 ثانية، والتحقق من كثافة تحت المجهر. بعد اكتشاف بقية المصفوفة في لوحة 24 بئرًا ، ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تراكبها بـ 800 ميكرولترات من وسيط النمو الأساسي مع عوامل النمو وفقًا للمخطوطة.بالنسبة لمقايس الحقن الدقيق مع التحفيز المسبق للإنسان المؤتلف IL-22 ، أضف IL-22 الإنسان المؤتلف إلى وسائل الإعلام الثقافية إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام لكل ملليلتر قبل 18 ساعة من الحقن. تحميل طبق الحقن الدقيق التي تحتوي على organoids على مرحلة المجهر، وإزالة الغطاء، وجلب organoids في التركيز، وعلى استعداد لبدء الحقن. بدوره حاقن ومحطات السيطرة على الذراع على.تأكد من تعيين حاقن لضغط 600 كيلوباسكال ووقت حقن 0.5 ثانية. إذا لم يكن بالفعل تراجع بعيدا عن مرحلة المجهر، تدوير ذراع الحقن للتأكد من ذلك، وإزالة رأس قبضة لها. تحميل طرف الحفر مع 10 ميكرولترات من inoculum، تجتاح تلميح الحفر بلطف في نهايتها حادة.ضع طرف الحفر في رأس القبضة ثم أعد توصيله بذراع الحقن الدقيق. نقل الذراع بلطف في وضع حيث تقع الإبرة واحد إلى اثنين من السنتيمتر فوق طبق الحقن الدقيق. استخدام السيطرة على الذراع لوضع طرف إبرة في وسط الطبق، وخفضه حتى يكون فقط على سطح وسائل الإعلام.برمج محطة التحكم في الذراع لإعادة الإبرة إلى هذه النقطة بعد كل الحقن. ركز المجهر على الأعضاء وحدد الهدف الذي يتم حقنه. ضع الإبرة فوق حق الجهاز في أن يتم حقنها ، وتحريك الإبرة لأسفل وبشكل لاحق في تجويف الجهاز.اضغط على زر الحقن على الحقن الدقيق للسماح لخليط البكتيريا الملطخة بالفينول بالخروج من الإبرة. وحقن كل عضور ثلاث مرات. عندما يتم حقن جميع الأعضاء المطلوبة، وإزالة لوحة الحقن الدقيق من المرحلة، واستبدال الغطاء، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.بعد الحضانة، الاستنشاق وسائل الإعلام النمو واستبداله بثلاثة ملليلترات من محلول رفع الخلايا. ثم، احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحريك الجهازيات بلطف وحل رفع الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من DPBS.جهاز طرد مركزي في 370-مرات-G لمدة ثلاث دقائق. إزالة عظمى، وإضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام نمو قاعدة تحتوي على 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر gentamicin. بعد ذلك ، مع P1000 ، ماصة صعودا وهبوطا ما يقرب من 50 مرة لتفريق organoids.إضافة أربعة ملليلتر المزيد من وسائل الإعلام، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لقتل البكتيريا خارج الخلية. بعد ذلك، الطرد المركزي الأجهزة في 370 مرات-G لمدة ثلاث دقائق. استلهموا المُنطّع، تاركين أقلّ قدر مُمكن.اغسل الأعضاء بـ DPBS مرة واحدة والطرد المركزي مرة أخرى. إضافة 500 ميكرولتردات من العازلة تحلل، والماصة صعودا وهبوطا ما يقرب من 50 مرة لتفكك يدويا organoids الأمعاء البشرية. بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، تخفف بشكل متسلسل الحل الناتج عشرة أضعاف في DPBS.الماصات ثلاثة قطرات 20 ميكرون من الحلول أنيق ومخففة على لوحات أجار LB الدفء قبل. وأخيرا، احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها والمضي قدما في حساب مستعمرة. تم حقن الأعضاء المعوية البشرية الصغيرة مع محلول البكتيريا الحمراء الفينول.الاحتفاظ بهذا اللون الأحمر من قبل organoids يمنع الحقن مكررة. المعالجة المسبقة للعضيات المعوية البشرية المستمدة من خط الخلية COF-2 مع الإنسان المؤتلف IL-22 يقيد غزو S.typhimurium SL1344 في الخلايا الظهارية المعوية. تمت معالجة العضية المصابة لتلطيخ المناعة، أو المجهر الإلكتروني للإرسال، من أجل تسهيل تصور التفاعلات البكتيرية للإيك IEC المضيفة.يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من العضية المحقونة للنظر في الاستجابة المستنسخة للعدوى. يمكن أيضًا استخدام المنظار الفلوري والمجهر الإلكتروني لمراقبة التفاعلات المُضيفة للأمراض بمزيد من التفصيل. أهم شيء أن نتذكر هو التأكد من أن كنت قد ممارسة كافية على الحقن الدقيقة لتكون قادرة على استكمال الحقن الخاص بك بسرعة وكفاءة لنتائج متسقة.دقيقة حقن نصائح الحفر لها غرامة, نقطة حادة, وينبغي توخي الحذر عند تحميل وتفريغ لهم من حاقن الصغرى. هذه التقنية تسمح لتفاعلات مسببات الأمراض الخلايا الظهارية التي يمكن دراستها في التفاصيل التي لم يسبق الحصول عليها. هذا النموذج العدوى سوف تكون ذات فائدة خاصة لأولئك الذين يدرسون مسببات الأمراض البشرية الخاصة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

إرساء ثقافة السائل المغطاة من مجرى الهواء الإنسان المستقطب طلائي Calu-3 خلايا لدراسة استجابة الخلية المضيفة لمسببات الأمراض التنفسية<em&gt; في المختبر</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids كنموذج للأمراض المعدية: ثقافة الإنسان وOrganoids المعدة الفئران وهيليكوباكتر بيلوري Microinjection من

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

تطوير اللعابية الأجسام المضادة المناعية المتعددة لقياس التعرض البشري للمسببات البيئية

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

التمايز المستحث للخلايا الشبيهة بالخلايا M في الطبقات الأحادية المعوية اللفائفية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...