Name: using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens
Uploaded: 2019-05-12T15:00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens a

इस काम को वेलकम ट्रस्ट, गेट्स फाउंडेशन और कैम्ब्रिज बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर से फंडिंग ने सपोर्ट किया । E.A.L. एक नैदानिक पीएचडी छात्र वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित है.

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	<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., Boj, S. 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M., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+Resistance+Mediated+by+IL-22+Signaling+at+the+Epithelial-Microbiota+Interface.">Pathogen Resistance Mediated by IL-22 Signaling at the Epithelial-Microbiota Interface.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3676-3682 (2015).</li><li>Sabat, R., Ouyang, W., Wolk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+opportunities+of+the+IL-22-IL-22R1+system.">Therapeutic opportunities of the IL-22-IL-22R1 system.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (1), 21-38 (2014).</li><li>Kotenko, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+functional+interleukin-22+(IL-22)+receptor+complex:+the+IL-10R2+chain+(IL-10Rbeta+)+is+a+common+chain+of+both+the+IL-10+and+IL-22+(IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor,+IL-TIF)+receptor+complexes.">Identification of the functional interleukin-22 (IL-22) receptor complex: the IL-10R2 chain (IL-10Rbeta ) is a common chain of both the IL-10 and IL-22 (IL-10-related T cell-derived inducible factor, IL-TIF) receptor complexes.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2725-2732 (2001).</li><li>Forbester, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-22+promotes+phagolysosomal+fusion+to+induce+protection+against+Salmonella+enterica+Typhimurium+in+human+epithelial+cells.">Interleukin-22 promotes phagolysosomal fusion to induce protection against Salmonella enterica Typhimurium in human epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10118-10123 (2018).</li><li>Nozaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+with+intestinal+epithelial+organoids+allows+efficient+expansion+and+motility+analysis+of+intraepithelial+lymphocytes.">Co-culture with intestinal epithelial organoids allows efficient expansion and motility analysis of intraepithelial lymphocytes.</a> Journal of Gastroenterology. 51 (3), 206-213 (2016).</li><li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids.">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li><li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro.">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li><li>Karve, S. S., Pradhan, S., Ward, D. V., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+model+human+responses+to+infection+by+commensal+and+Shiga+toxin+producing+Escherichia+coli.">Intestinal organoids model human responses to infection by commensal and Shiga toxin producing Escherichia coli.</a> PLOS ONE. 12 (6), e0178966 (2017).</li><li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids.">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li><li>Garcez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+impairs+growth+in+human+neurospheres+and+brain+organoids.">Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids.</a> Science. 352 (6287), 816-818 (2016).</li><li>Forbester, J. L., Hannan, N., Vallier, L., Dougan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Intestinal+Organoids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Use+as+an+Infection+System.">Derivation of Intestinal Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells for Use as an Infection System.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल ihos में hipscs के भेदभाव और एक मॉडल है जिसमें आंत्र संक्रमण अनुकरण करने के रूप में उनकी उपयोगिता की रूपरेखा । नीचे, हम प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम और किसी भी संशोधन या सुधार हमने बनाया है रूपरेखा ।
यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित कार्य25की तुलना में hipscs की विभेदन प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है । पहले इस्तेमाल की गई विधियों में अन्य hiPSC संस्कृति प्रणालियों (उदा., फीडर-निर्भर hiPSC संस्कृति) से hiPSCs का स्थानांतरण रासायनिक रूप से परिभाषित माध्यम-polyvinyl शराब (CDM-PVA) के लिए आवश्यक है । CDM-PVA के लिए यह स्थानांतरण आमतौर पर लेता है 2 – 3 सप्ताह और hiPSCs के दैनिक खिलाने की आवश्यकता है. यह प्रोटोकॉल भी नहीं लगातार प्रभावी था, कुछ भिंनता के साथ असफल; इसलिए, हम एक ही वृद्धि कारकों का उपयोग कर भेदभाव trialed लेकिन स्टेम सेल संस्कृति माध्यम में उगाया hiPSCs के साथ शुरू (बजाय सीडीएम-PVA) और अंतर के दौरान स्टेम सेल संस्कृति माध्यम से CDM-PVA के प्रतिस्थापन 0 – 3. यह पांच स्वतंत्र hiPSC लाइनों के लिए सफल रहा है इस प्रकार अब तक trialed, भेदभाव प्रक्रिया बहुत अधिक तेजी से और कुशल बना । यह भी सप्ताहांत में भेदभाव से पहले hipscs के मुक्त संवर्धन की अनुमति देता है, hipsc संस्कृति में अधिक लचीलापन की अनुमति । इस विधि द्वारा उत्पादित iHO लाइनों के रूप में हम पहले hiPSC लाइनों Kolf2, Yemz1, और Lise116 के लिए वर्णित किया गया है और phenotyped iHOs से अविवेच्य प्रकट का उपयोग करके आंत्र उपकला के मार्कर के लिए phenotyped किया गया है पिछले प्रोटोकॉल.
बोने के बाद, iHOs नियमित passaging के ंयूनतम 1 महीने की आवश्यकता है, बंटवारे के साथ हर 4-7 दिन परिपक्वता की सुविधा के लिए । ध्यान दें कि वहां iHO iPSC लाइन का इस्तेमाल किया और प्रारंभिक संस्कृति के घनत्व के आधार पर विकास में कुछ बदलाव होगा । पहले कुछ पैसेज के दौरान वहां पर दूषित कोशिकाएं दिखाई देगी जो iHOs नहीं हैं । ये अंततः मर जाएगा, गोलाकार की एक स्वच्छ संस्कृति छोड़कर, लगभग 4 सप्ताह के बाद, budded iHOs । इसके अलावा, एक में हुड इमेजिंग प्रणाली का चयन करें और वांछित morphology के साथ केवल iHOs पारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । IHOs परिपक्व के रूप में, वे हर 6-7 दिन विभाजन की आवश्यकता होगी, विकास दर और घनत्व पर निर्भर है । यदि निंन में से कोई भी हो, iHOs इस बिंदु से पहले विभाजित किया जाना चाहिए: iHOs के luminal cavities को मृत कोशिकाओं के साथ भरने के लिए शुरू, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को विघटित करने के लिए शुरू होता है, iHOs तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स से बाहर हो जाना शुरू, या संस्कृति भी है घने और मीडिया के लिए बहुत जल्दी पीला जाना शुरू होता है ।
एक बार जब iho संस्कृति की स्थापना की है, अगर किसी भी समय ihos परिवर्तन की उपस्थिति या अपेक्षा से अलग है (उदाहरण के लिए, संस्कृतियों गोलाकार रहते हैं, के बजाय नवोदित), कोशिका मार्कर के लिए immunohistoरसायनशास्त्र और qpcr के माध्यम से फीनोटाइपिंग होना चाहिए यह सुनिश्चित करने के लिए दोहराया जाता है कि ihos (जैसे, जाम कोशिकाओं, paneth कोशिकाओं) के भीतर कोशिका प्रकार के विभेदन बरकरार रहता है । यदि iHOs अब फर्क नहीं कर रहे हैं, तो वे छोड़ दिया और फिर से अलग किया जाना चाहिए या iHOs के एक पूर्व पारित होने thawed और पुनर्गठित किया जाना चाहिए । यदि iHOs अंतर करने के लिए संघर्ष, संभावित कारणों संस्कृति की उंर है (यदि यह 6 महीने से अधिक है), विकास कारकों की गतिविधि (यह सुनिश्चित करें कि इन निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार पुनर्गठित कर रहे है और छोटे aliquots में जमे हुए रखा से बचने के लिए एकाधिक फ्रीज-thaw के चक्र), भी अक्सर या हिंसक मार्ग (सामान्य में, passaging केवल एक सप्ताह में एक बार होना चाहिए, और ihos मैन्युअल रूप से एक नियमित आधार पर भी सख्ती से वियोजित रहे हैं, तो वे पूरी तरह से अंतर करने के लिए संघर्ष करेंगे).
हम आरएनए अनुक्रमण के माध्यम से स्थापित किया है कि आईएल-22 उत्तेजना 18 एच संक्रमण से पहले रोगाणुरोधी जीन और बाधा रक्षा phenotype में शामिल लोगों Assays है के लिए नए iHsO के प्रयोग से पहले rhIL-22 के साथ prestimulation शामिल (या एक वैकल्पिक cytokine अगर इस प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है), यह cytokine द्वारा upregulated होने के लिए जाना जाता जीन की गतिविधि की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है (IL-22 के मामले में , हम iHOs की उत्तेजना के बाद qPCR के माध्यम से DUOX2 और LCN2) का इस्तेमाल किया, रिसेप्टर अभिव्यक्ति और अक्षुण्ण संकेत सुनिश्चित करने के लिए । पहले IL-22 का उपयोग करने के लिए, हम भी immunohistochemistry iHO संस्कृति के लिए IL-22 रिसेप्टर की अभिव्यक्ति बेसल था स्थापित करने के लिए आईएल 22 रिसेप्टर का पता लगाने के लिए बाहर किया मध्यम. हालांकि, अगर एक रिसेप्टर apically व्यक्त की है, इस प्रोटोकॉल के लिए लिगन्डों apically देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Microinjection प्रणाली के बारे में नुकसान आम तौर पर इंजेक्शन के लिए आवश्यक सुई की विनंरता से संबंधित हैं । यहाँ, हम एक 6 μm लुमेन के साथ वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध ड्रिल सुझावों का उपयोग करें । यह ग्लास केशिकाओं26 से इंजेक्शन सुई खींच संभव है, हालांकि यह कम वर्दी हो सकता है, सुई टिप या असंगत मात्रा ihos में इंजेक्शन किया जा रहा से रिसाव के लिए अग्रणी । यह सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन iHO lumen, जो एक डाई के रूप में phenol लाल के उपयोग के लिए एक कारण है में जगह ले ली है करने के लिए महत्वपूर्ण है; iHOs दिखाई विस्तार और लाल inoculum पकड़, निश्चितता के बारे में जो iHOs इंजेक्शन दिया गया है की अनुमति देगा । कभी कभार सुई iHO दीवार से मलबे के साथ रोकना होगा; यदि यह मामला है, iHO अंदर से सुई टिप निकालें और microinjection प्रणाली पर साफ बटन दबाएँ । यह उच्च हवा का दबाव है जो रुकावट साफ करना चाहिए की एक संक्षिप्त अवधि का उत्पादन होगा । यह भी थाली पर जीवाणु संरोप के कुछ रिसाव प्रेरित करेगा; इसलिए, यदि ऐसा होता है, तो साफ कार्रवाई सभी प्लेटों पर दोहराया जाना चाहिए प्रति थाली बैक्टीरियल संरोप की समानता सुनिश्चित करने के लिए । HiPSC-व्युत्पंन iHOs का एक बड़ा लाभ उनके आकार है । चूहों और प्राथमिक मानव ऑर्गेनॉयड से आंत्र ऑर्गेनॉइड बहुत छोटे होते हैं (~ १०० μm और 100 – 300 μm, क्रमशः27, बनाम 250-1500 μm के लिए hipsc-व्युत्पंन iHOs), जिसका अर्थ है कि ऑर्गेनॉइड की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन धीमी हो जाएगा । यह बड़े पैमाने पर इंजेक्शन प्रयोगों hiPSC व्युत्पंन iHOs में trialed किया जा करने के लिए अनुमति देता है । यह भी उन के बाद संक्रमण फसल और मैंयुअल रूप से dpbs में ihos वियोजी, उनके luminal सामग्री जारी द्वारा ihos के luminal सामग्री का अध्ययन करने के लिए संभव है । Microinjection के लिए, हम बैक्टीरिया की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग करने की सलाह देते हैं । हमने पाया है कि कम सांद्रता iHOs शामिल IECs से एक प्रतिक्रिया उत्पंन करने के लिए पर्याप्त नहीं थे । इसके अतिरिक्त, यह बाद में भली भांति microscopy का उपयोग कर बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए मुश्किल था । Inoculums के लिए अलग बैक्टीरियल उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
संक्षेप में, hipsc व्युत्पंन ihos सीधे आंत्र संक्रमण के लिए उपकला प्रतिक्रिया विदारक के लिए एक होनहार मॉडल प्रदान करते हैं, चाहे intracellular आक्रमण गिनती, इमेजिंग, iho supernatants में cytokine स्तर को मापने, या कटाई आरएनए का अध्ययन करके रोगजनकों के लिए जोखिम के बाद अध्ययन के ट्रांसक्रिप् शनल परिवर्तन । उनकी उपयोगिता मानव प्रतिबंधित रोगजनकों के लिए संक्रमण मॉडल की स्थापना के लिए भविष्य में और भी स्पष्ट हो जाएगा इस तकनीक का उपयोग करने के लिए विशिष्ट रोग से संबंधित आनुवंशिक परिवर्तन का अध्ययन करके अनुसंधान को निजीकृत करने की संभावनाओं का शोषण और नशीली दवाओं की प्रतिक्रियाएं ।

हाल के वर्षों में, ऑर्गेनोइड मॉडलों के विकास द्वारा मेजबान-रोगज़नक़ अन्योन्य क्रियाओं के अध्ययन को बढ़ाया गया है, जिसमें विभिन्न प्रजनकों से आंत्र उपकला का 3-डी निरूपण किया जा सकता है । ' प्राथमिक ' ऑर्गेनॉयड आंत्र बायोप्सी से काटा आंतों स्टेम कोशिकाओं से सीधे उत्पंन किया जा सकता है । इसके अलावा, hiPSCs से आंतों ऑर्गेनॉयड पैदा किए जा सकते हैं । एक ही कई ऊतकों के बारे में कहा जा सकता है, गैस्ट्रिक1, जिगर2, अग्नाशय3,4, मस्तिष्क5,6, फेफड़े7, और प्रोस्टेट8 ऑर्गेनॉयड मॉडल करने के लिए बहुत से शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया रोग. वहां कई अंगाभ प्रणाली के रोमांचक अनुप्रयोगों मॉडलिंग9 कैंसर और दवा स्क्रीनिंग10सहित, कर रहे हैं, लेकिन यहां हम एक संक्रमण मॉडल के रूप में ihos के उपयोग पर ध्यान केंद्रित, एस का उपयोग कर । एन्टेरिका सेनोवर टाइफिमूरियम (एस. Typhimurium) एक अनुकरणीय रोगज़नक़ और आईएल-22 के साथ एक चिकित्सा के रूप में pretreatment के रूप में ।
इस अध्ययन में, iHO उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया hiPSCs ' Kolf2 ' है iPSCs, एक स्वस्थ व्यक्ति से उत्पंन और मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल पहल कंसोर्टियम (Hipscs; www.hipsci.org), विशेषता का एक खुला उपयोग संदर्भ पैनल से उपलब्ध 7. hiPSC लाइंस11. ऑर्गेनॉयड के लिए progenitors के रूप में hiPSCs का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि अब स्वस्थ दाता iPSC लाइनों उपलब्ध के व्यापक बैंकों रहे हैं, जिसका अर्थ है कि परिणाम विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ सेल लाइनों की एक संख्या में मान्य किया जा सकता है. इसके अलावा, शोधकर्ताओं के लिए विशिष्ट रोग से संबंधित एकल न्यूकोटाइड बहुरूपताओं (snps) पर देखने के लिए इच्छा करना चाहिए, यह crispr का उपयोग करने के लिए संभव है/Cas9 एक स्वस्थ कोशिका लाइन में उत्परिवर्तन इंजीनियर, जिससे दोनों एक उत्परिवर्ती लाइन का उत्पादन और समजीनी को बनाए रखने 12तुलना के लिए नियंत्रण रेखा । हमारे अनुभव में, hiPSC-आंत्र ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन उनके प्राथमिक समकक्षों की तुलना में आकार में बड़े होते है और संस्कृति में अधिक सुसंगत, एक कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण microinjection के लिए बना रही है और संभावित रोगजनकों की एक और विविध रेंज होने की अनुमति अध्ययन. iHOs cryogenically संरक्षित किया जा सकता है, और हम एक साल तक के लिए iHO संस्कृतियों प्रचारित किया है प्रयोग के लिए सामग्री का उत्पादन ।
Vivo में, IECs आंतों homeostasis के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सीधे रोगजनकों को बाधित कर सकते हैं, हालांकि तंत्र जिसके द्वारा यह होता है अच्छी तरह से समझ में नहीं आता. Cytokine IL-22 आंत उपकला बैरियर13 के रखरखाव में एक भूमिका है और संक्रमण14के जवाब में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और chemokines के प्रेरण और स्राव में शामिल करने के लिए जाना जाता है । यह सक्रिय टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित है (विशेष रूप से, Th17 कोशिकाओं) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं और एक heterodiभाजक रिसेप्टर il-22r1 और il-10r2 सब यूनिटों15से बना करने के लिए बाइंड कर देता । IL-22 के लिए रिसेप्टर आईईसी पर basally व्यक्त की है, जिसका अर्थ है कि Iecs मॉडल में, यह केवल संस्कृति मध्यम16के लिए इसके अलावा द्वारा rhil-22 के साथ ऑर्गेनॉयड pretreat संभव है । अंगाभ प्रणाली का एक नुकसान यह है कि यह आम तौर पर अंय प्रतिरक्षा सेल प्रकार द्वारा दिया संबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अभाव है; हालांकि, मॉडल उभर रहे है कि करने के लिए कोकल्चर के लिए आंतों लिम्फोसाइटों के साथ ऑर्गेनॉइड का प्रयास बेहतर यह17,18का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Microinjection प्रणाली का उपयोग iHO मॉडल में संक्रमण अनुकरण करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह उपकला की शीर्षस्थ सतह के लिए रोगजनकों के प्रत्यक्ष वितरण की अनुमति देता है, के रूप में vivo में संक्रमण के मामले में हो जाएगा । IHO में इंजेक्शन बैक्टीरियल समाधान के लिए phenol लाल के अलावा कि संक्रमित किया गया है, इस प्रकार एक ही iHO के दोहराया इंजेक्शन से बचने के निशान । संक्रमण मॉडलिंग के लिए जहाजों के रूप में organoids उपयोग में बढ़ रहे हैं, हेलिकोबेक्टर के रूप में रोगजनकों के साथ पायलोरी,19 नोरोवायरस,20 रोटावायरस,21 shiga विष का उत्पादन एचेरीचिया कोलाई22, क्रिप्टोस्पोरीडियम23, और zika वायरस24 जीवित और इन प्रणालियों के भीतर दोहराने के लिए दिखाया गया है. इस तकनीक रोगजनकों की एक व्यापक श्रेणी के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से जीव है कि संस्कृति के लिए मुश्किल है, जैसे प्रोटोजोआ, या मानव प्रतिबंधित रोगजनकों के लिए, संक्रमण के लिए मानव उपकला प्रतिक्रिया के बारे में प्रत्यक्ष जानकारी प्राप्त करने के लिए ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:785px;" width="785">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M6250-10ML</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">5 mm glass bottom injection dishes</td>
			<td style="width:107px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:101px;">P50G-0-14-F</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">12634010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Alexa fluor 647 phalloidin</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A22287</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1:1000 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">B27 serum-free supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17504044</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 50x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">BMP-4 recombinant human protein</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">PHC9534</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10 &#956;g/mL, final concentration 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Cell recovery solution (cell lifting solution)</td>
			<td style="width:107px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">354253</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">CHIR99021</td>
			<td style="width:107px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:101px;">ab120890-5mg</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3 mM, final concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Collagenase, type IV powder</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17104019</td>
			<td style="width:303px;">Reconstitute at 0.1%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Corning cryogenic vials</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Costar TC treated 24 well culture plates</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">DAPI dilactate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D9564-10MG</td>
			<td style="width:303px;">Use at 10 nM concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Dulbecco&#8217;s PBS (No MgCl2 or CaCl2)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">14190-144</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Dulbecco&#8217;s PBS (with MgCl2 and CaCl2)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D8662-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Epidermal growth factor</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Eppendorf TransferMan NK2 (microinjection system)</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">920000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Eppendorf Femtojet express&#160; (microinjection system)</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">5248 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Essential 8 Flex medium kit (stem cell culture medium)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A2858501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">EVOS XL imaging system (in-hood imaging system)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">G1272-10ML</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10 mg/mL, final concentration 0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Goat anti-Salmonella, CSA-1</td>
			<td style="width:107px;">Insight Biotechnology</td>
			<td style="width:101px;">02-91-99</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1:20 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15630056</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">KnockOut Serum Replacement (setrum replacment)</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">10828010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMAX supplement (glutamine supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">A2916801</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 200 mM, final concentration 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">LY294002</td>
			<td style="width:107px;">Promega UK</td>
			<td style="width:101px;">V1201</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 50 mM, final concentration 10&#956;M</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Matrigel, GFR, phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">356231</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">MEM non-essential amino acids&#160; solution (100x)</td>
			<td style="width:107px;">Gibco</td>
			<td style="width:101px;">11140035</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">N2 serum-free supplement</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">17502048</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100x, final concentration 1x</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15140163</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 10,000 U/mL, final concentration 100 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Phenol red</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P0290-100ML</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Piezo Drill Tip Mouse ICSI, 25&#176; tip angle, 6 &#181;m inner diameter</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">5195000087</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Prostaglandin E2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">P0409-1MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 2.5 mM, final concentration 2.5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human FGF basic</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">233-FB-025</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human IL-22</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">6057-NG-100</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human Noggin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">6057-NG-100</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Recombinant human R-spondin1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">4645-RS-025</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 25 mg/mL, final concentration 500 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Recombinant human/mouse/rat Activin A</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:101px;">338-AC-050</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 100 &#956;g/mL, final concentration 100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:275px;">Recovery cell culture freezing medium (cell freezing medium)</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">Gibco</td>
			<td rowspan="2" style="width:101px;">12648010</td>
			<td rowspan="2" style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:101px;">R2625-50MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3&#956;M, final concentration 3mM</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">RPMI 1640 media with Glutamax supplement (RPMI Medium with L-glutamine supplement)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">61870010</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Triton X-100 (cell lysis buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">RES9690T-A101X</td>
			<td style="width:303px;">Use at 1% concentration</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:275px;">Versene (EDTA solution)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:101px;">15040066</td>
			<td style="width:303px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Vitronectin XF</td>
			<td style="width:107px;">Stemcell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:101px;">7180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:275px;">Y-27632 dihydrochloride monohydrate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Y0503-1MG</td>
			<td style="width:303px;">Stock concentration 3 mM, final concentration 10 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens

आंतों ' organoid ' (iHO) प्रणाली है, जिसमें 3-D संरचनाओं के प्रतिनिधि मानव आंत के उपकला अस्तर मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से उत्पादित किया जा सकता है (hiPSCs) और संस्कृति में बनाए रखा, एक रोमांचक अवसर प्रदान करता है की सुविधा आंत्र संक्रमण के लिए उपकला प्रतिक्रिया की मॉडलिंग. Vivo में, आंतों उपकला कोशिकाओं (IECs) आंतों homeostasis को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और सीधे रोगजनकों को बाधित कर सकते हैं, हालांकि तंत्र जिसके द्वारा यह होता है पूरी तरह से स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. Cytokine interleukin-22 (आईएल-22) के रखरखाव और आंत उपकला बाधा के बचाव में एक भूमिका निभाते दिखाया गया है, संक्रमण के जवाब में रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और chemokines की रिहाई उत्प्रेरण भी शामिल है ।
हम एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में उंहें embedding से पहले स्वस्थ नियंत्रण iHOs में विशिष्ट cytokine युग्म के अलावा के माध्यम से hiPSCs के भेदभाव का वर्णन-प्रोआंतों संस्कृति प्रणाली आधारित है । एक बार एंबेडेड, ihos noggin के साथ पूरक मीडिया में बड़े हो रहे हैं, R-spondin-1, एपिडर्मल विकास कारक (egf), CHIR99021, E2 प्रोस्टाग्लैंडीन, और वाई-२७६३२ dihydrochloride मोनोहाइड्रेट. IHO ultrastructure के मैनुअल व्यवधान से साप्ताहिक मार्ग budded iHOs के गठन के लिए सीसा, कुछ एक तहखाना/ सभी ihos एक विभेदित उपकला जाम कोशिकाओं, enteroendocrine कोशिकाओं, paneth कोशिकाओं से मिलकर प्रदर्शित करता है, और polarized enteroendocrine, जो प्रत्येक कोशिका सबसेट के विशिष्ट मार्कर के लिए immunostaining के माध्यम से पुष्टि की जा सकती है, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम), और मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) । मॉडल संक्रमण करने के लिए, साल्मोनेला enterica serovar typhimurium SL1344 ihos के लुमेन में microअंतःक्षिप्त रहे हैं और ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए इनक्यूबिटेड, और एक संशोधित जेंटॅमाइसिन संरक्षण परख intracellular के स्तर की पहचान करने के लिए किया जाता है बैक्टीरियल आक्रमण । कुछ ihos भी पुनः संयोजक मानव IL-22 (rhil-22) संक्रमण से पहले स्थापित करने के लिए कि क्या इस cytokine साल्मोनेला संक्रमण के खिलाफ सुरक्षात्मक है के साथ pretreated कर रहे हैं ।

भेदभाव की प्रक्रिया के शुरू होने के बाद, कोशिकाओं को निश्चित अंत: स्तर के चरण के माध्यम से पारित करना चाहिए के बाद हिर्गट patterning के बाद तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में embedding से पहले । Spheroids फार्म और दूषित सामग्री की बड़ी मात्रा के साथ संस्कृतियों iHOs परिपक्व के रूप में कई हफ्तों की अवधि में स्पष्ट हो जाएगा । विभेदन, embedding, और passaging प्रक्रिया के प्रतिमान छवियों चित्रा 1में दिखाए जाते हैं ।
Microinjection प्रणाली के सेटअप के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । IHOs phenol लाल/बैक्टीरियल समाधान के साथ microअंतःक्षिप्त और उनके लाल रंग को बनाए रखने, संक्रमित iHOs की पहचान की अनुमति डुप्लिकेट इंजेक्शन को रोकने के लिए कर रहे हैं । मढ़वाया intracellular बैक्टीरिया की गिनती संशोधित जेंटॅमाइसिन संरक्षण परख के बाद किया जाता है; आरआईआईएल-22 के साथ prestimulation एस को प्रतिबंधित करता है । आरआईएल-22 उपचार के बाद कम intracellular बैक्टीरिया के साथ मनाया जा रहा है typhimurium संक्रमण, (चित्रा 3) । हम भी नियमित रूप से immunostaining, या TEM के लिए संक्रमित iHOs प्रक्रिया, आदेश में मेजबान आईईसी के दृश्य की सुविधा के लिए-बैक्टीरियल बातचीत (चित्रा 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig1.jpg"> चित्र 1: आईपीएससी को iHOs में विभेदन का निर्देश दियागया । IPSCs से iHOs के लिए विभेदन के प्रतिनिधि अनुक्रम, रूपात्मक परिवर्तन का प्रदर्शन और इन परिवर्तनों को चलाने के लिए आवश्यक वृद्धि कारकों. निश्चित अंतश् चर्म विभेदन के 4 दिन में निर्मित किया गया है, activin एक, FGF, BMP-4, LY294002, और CHIR99021 के संयोजन के विशिष्ट सांद्रता के लिए जोखिम के बाद । 8 दिनों के बाद, CHIR99021 और रेटिनॉइक एसिड के विशिष्ट सांद्रता के साथ इस निश्चित अंतर्त्वचा के patterning हिर्गट गठन में परिणाम है । पोस्टएंबेडिंग, गोलाभ गठन मनाया जाता है । निरंतर के बाद एक समर्थन तहखाने के साथ एक सहायक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स मढ़ा का उपयोग कर passaging के साथ prointestinal प्रसार कारकों आर-स्पॉडिन 1, noggin, egf, CHIR99021, और प्रोस्टाग्लैंडीन E2, spheroids में प्रगति budded ihos । (छवियां 4x-10x आवर्धन पर ले जाया गया) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig1large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2.jpg"> चित्रा 2: एसके साथ एक Iho के microinjection । Typhimurium. (क) माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली ( सामग्री तालिकादेखें) पर्यावरण चैंबर में संलग्न; यह एक नियंत्रित वातावरण में iHOs के इंजेक्शन की अनुमति देता है (३७ डिग्री सेल्सियस/ (ख) जीवाणु संरोप को माइक्रोइंजेक्शन प्रणाली से जुड़ी माइक्रोकेशिका का उपयोग करके सीधे ही आईएचओ ल्यूमेन में वितरित कर दिया जाता है । (ग) फीनॉल रेड के साथ बैक्टीरियल इननोकुलम मिलाने से यह स्पष्ट हो जाता है कि कौन-कौन से आईफास संक्रमित हुए हैं, इस प्रकार इहो के डुप्लीकेट इंजेक्शन से परहेज करें । चित्र 10x आवर्धन पर लिया गया था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig2v2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig3.jpg"> चित्रा 3: आरआईएल-22 के साथ Kolf2 कोशिका रेखा से व्युत्पन्न iHOs के Pretreatment एस को प्रतिबंधित करता है । आंत्र उपकला कोशिकाओं में typhimurium SL1344 आक्रमण. के लिए जेंटॅमाइसिन सुरक्षा assays हैं, ihos के साथ इलाज किया गया १०० एनजी/एमएल rhil-२२ १८ एच संक्रमण से पहले, या अनुपचारित छोड़ दिया, और ९० मिनट के बाद संक्रमण के लिए इनक्यूबिटेड । डेटा तीन तकनीकी का मतलब है तीन जैविक के लिए प्रतिकृति ± SEM प्रतिकृति । महत्व परीक्षण के लिए, मान-Whitney यू परीक्षण इस्तेमाल किया गया; पी < ०.०००१ । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig3large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2.jpg"> चित्रा 4: एस Typhimurium SL1344 के साथ IECs की बातचीत. इन पैनलों iHOs एस के साथ इंजेक्शन का प्रदर्शन Typhimurium SL1344 और 3 एच के लिए, निर्धारण और प्रसंस्करण के लिए पहले (एक) इम्यूनोफ्लोरेसेंस या (ख) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इनक्यूबिटेड । एकपैनल में, बैक्टीरिया iho लुमेन के भीतर देखा और उपकला के साथ बातचीत कर रहे हैं । नाभिक के साथ 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) dilactate (नीला), कोशिका झिल्ली phalloidin के साथ (लाल), और बैक्टीरिया CSA-1 (हरा) के साथ दाग रहे हैं । चित्र 20x आवर्धन पर लिया जाता है । पैनल बी आक्रमण के बाद साल्मोनेला के तीन अलग intracellular प्रसंस्करण रास्ते को दर्शाता है; जीवाणु (a) साल्मोनेला-युक्त vacuole के भीतर, (ख) कोशिका द्रव्य के भीतर मुक्त, और (ग) autophagy के दौर से गुजर । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59478/59478fig4v2large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>RPMI/B27 मध्यम</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>घटक:</td>
			<td>राशि:</td>
		</tr>
<tr>
<td>ग्लूटेमीन अनुपूरक के साथ RPMI १६४० मीडिया</td>
			<td>५०० मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 50x</td>
			<td>10 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>iHO आधार विकास मध्यम</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>घटक:</td>
			<td>राशि:</td>
		</tr>
<tr>
<td>उंनत DMEM/F12</td>
			<td>५०० मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 50x</td>
			<td>10 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>N2 सीरम-नि: शुल्क अनुपूरक 100x</td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M HEPES</td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>एल-ग्लूटामीन २०० मिमी</td>
			<td>5 मिलीलीटर</td>
		</tr>
<tr>
<td>IHO आधार विकास के लिए विकास कारक मध्यम</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>घटक:</td>
			<td>राशि:</td>
		</tr>
<tr>
<td>पुनः संयोजक मानव R-spondin1</td>
			<td>५०० एनजी/एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>पुनर्योगवादी मानव नोगिन</td>
			<td>१०० एनजी/एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF)</td>
			<td>१०० एनजी/एमएल</td>
		</tr>
<tr>
<td>प्रोस्टाग्लैलइन E2</td>
			<td>२.५ μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-२७६३२ डाइहाइड्रोक्लोराइड मोनोहाइड्रेट</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: मीडिया रेसिपी ।

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग आंतों ऑर्गेनॉइड व्युत्पंन का अध्ययन करने और साल्मोनेला और अंय रोगज़नक़ों के खिलाफ उपकला कोशिका संरक्षण को संशोधित

मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC)-व्युत्पन्न आंत्र ऑर्गेनॉइड विट्रो में मॉडल आंत्र रोगों के लिए रोमांचक अवसर प्रदान करते हैं । हम आंतों ऑर्गेनॉइड (iHOs) में hiPSCs के भेदभाव, cytokines के साथ इन iHOs की उत्तेजना प्रदर्शित करता है, और iHO lumen में साल्मोनेला typhimurium के microinjection, इस से एक उपकला के आक्रमण के अध्ययन को सक्षम करने से रोगज़नक़.

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

एक माउस के आवेदन Peyer पैच आंतों लूप परख ligated एम कोशिकाओं द्वारा बैक्टीरियल तेज मूल्यांकन

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

के नैदानिक ​​अनुप्रयोग<em&gt; स्लीपिंग ब्यूटी</em&gt; और कृत्रिम कोशिकाओं को पेश करने के लिए आनुवंशिक रूप से परिधीय और गर्भनाल रक्त से टी कोशिकाओं को संशोधित एंटीजन

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Polarized मानव airway के एक तरल से ढके संस्कृति की स्थापना उपकला Calu 3 मेजबान सेल श्वसन रोगज़नक़ों रिस्पांस कोशिकाओं के अध्ययन<em&gt; इन विट्रो में</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

संक्रामक रोगों के लिए मॉडल के रूप में Organoids: हेलिकोबेक्टर के मानव की संस्कृति और murine पेट Organoids और microinjection

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

एक लार एंटीबॉडी मल्टीप्लेक्स Immunoassay का विकास पर्यावरण रोगजनकों के लिए मानव एक्सपोजर को मापने के लिए

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

स्व-प्रतिरक्षात्मकता खिलाफ स्टेम सेल व्युत्पन्न विशिष्ट प्रतिजन विनियामक टी कोशिकाओं के विकास

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

माउस और मानव व्युत्पंन प्राथमिक गैस्ट्रिक उपकला Monolayer उत्थान के अध्ययन के लिए संस्कृति

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

बैक्टीरियल रोगजनकों के खिलाफ Immunological प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए Opsonophagocytic हत्या परख

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न Ileal Enteroid Monolayers में एम सेल की तरह कोशिकाओं के प्रेरित भेदभाव

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...