Name: targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy
Uploaded: 2019-08-10T14:00:00
Duration: 9 min 9 s
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L'équipement pour le volume EM a été fourni par une généreuse subvention du gouvernement flamand.

<ol>
	<li>Linberg, K. A., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+interplexiform+cell+synapses+in+the+human+retina.">An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).</li><li>Peddie, C. J., Collinson, L. 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(pt 2), 71-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three+dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 11, 329 (2004).</li><li>Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10 Available from: <a target="_blank" href="https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2019)</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Sommer, C., Str&#228;hle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+Interactive+Learning+and+Segmentation+Toolkit.">ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit.</a> Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La microscopie électronique de volume est plus difficile et prend plus de temps que seM ou TEM conventionnel. En raison de la nécessité de tacher les tissus ou les cellules en bloc, les étapes de traitement doivent être assez longues pour assurer la pénétration des réactifs dans tout l'échantillon. L'utilisation de l'énergie micro-ondes pour faciliter la pénétration permet un traitement plus court et plus efficace et améliore la coloration. Parce que la préparation pour EM est beaucoup plus stricte que pour la microscopie légère toutes les solutions et réactifs doivent être contrôlés de qualité strictement. Les changements dans le pH, la tonicité, l'utilisation de réactifs impurs et l'introduction de contaminants dus à une mauvaise technique peuvent tous avoir des effets délétères sur l'image finale.
Volume EM nécessite également des protocoles personnalisés pour chaque type d'échantillon différent. Tissus mammifères de différents types: les plantes, les cellules simples telles que la levure, trypanosomes, C. elegans, etc, tous ont besoin de leurs propres variations pour obtenir des résultats optimaux. La fixation et la coloration doivent être conçues de manière à préserver l'intégrité structurelle et à garder l'échantillon le plus près possible de sa morphologie in vivo. La fixation des tissus à la température physiologique, au pH et à la tonicité est essentielle pour rendre l'échantillon aussi réaliste qu'il peut l'être. La congélation à haute pression (HPF) des échantillons peut aider à préserver une situation plus réaliste, (ou peut-être simplement produire des artefacts différents), mais pour d'autres que les cellules et les tissus très minces HPF échouera que la glace vitrée ne peut être générée en petits volumes. Par conséquent, pour de nombreuses questions, la fixation chimique est la seule option. Peu importe si la fixation est HPF ou chimique, dans toute expérience EM les résultats structurels doivent être soigneusement comparés aux résultats similaires de la cellule vivante ou de l'imagerie tissulaire pour voir si elles sont cohérentes. La coloration doit également être optimisée tout en tenant compte de la question spécifique à laquelle il faut répondre et du protocole qui sera utilisé pour la visualisation des images numériques.
Avoir à la fois un système SBF-SEM et FIB à proximité est un grand avantage dans de nombreuses expériences. Le grand champ de vision et la résolution élevée de X,Y de SBF-SEM facilitent la recherche de structures/cellules/événements individuels et fournissent une orientation spatiale globale des cellules dans les tissus. En outre, sa capacité à permettre l'imagerie à travers un échantillon en Z est très puissante; cependant, les reconstructions qui nécessitent des détails géométriques fins peuvent échouer ou produire des artefacts en utilisant cette technique en raison des voxels non-isotropes qu'elle génère. La FIB est limitée par la physique du processus à un champ d'imagerie plus petit, mais sa résolution 3D est suffisante pour des reconstructions très précises. La combinaison des deux techniques est simple car les échantillons peuvent passer du SBF-SEM à la FIB sans traitement ni préparation. Nous reconnaissons que l'utilisation du SBF-SEM pour la recherche à travers un échantillon pour trouver une zone particulière est une utilisation très coûteuse d'un outil beaucoup plus capable. Cependant, la possibilité de voir immédiatement le nouveau blockface et de déterminer si le retour sur investissement a été atteint est un grand avantage. En outre, les alternatives d'utiliser des sections LM semi-minces en série (0,5 m) peuvent enlever les petites structures avant qu'elles ne soient détectées, et inspecter un bloc à l'aide de sections TEM simples qui doivent être coupées, mises sur une grille et ensuite vues dans un TEM tout aussi coûteux n'est pas efficace comme la méthode présentée.
Étant donné que de nombreux programmes existent pour segmenter et rendre les données, et que les besoins d'une structure donnée peuvent ne pas être mieux servis par une seule application, aucun flux de travail standard ne peut être proposé. Certaines structures simples peuvent être segmentées à l''intérieur d'un algorithme de seuil s'ils se situent dans des valeurs à échelle grise très étroites. Les structures neuronales peuvent être segmentées semi-automatiquement à l'aide d'un programme tel qu'Ilastik11, mais il sera moins utile sur des organites de forme plus aléatoire ou complexe comme les urgences. Microscopy Image Browser est un programme très flexible qui peut aligner, segmenter et rendre des données EM volume, mais nécessite une interaction utilisateur significative12. En règle générale, le temps nécessaire pour visualiser numériquement les résultats dépassera largement le temps de préparation de l'échantillon et de l'imagerie.
Les techniques de volume EM ont ouvert la troisième dimension à l'analyse ultrastructurale. D'autres méthodes d'obtention de l'EM 3D ont des limites dans leur volume (tomographie TEM), ou leur efficacité (section série TEM). Bien que, pour la plupart, les techniques EM de volume soient trop complexes et coûteuses pour être mises en œuvre dans des laboratoires individuels, le nombre d'installations de base partagées qui les offrent a augmenté et le nombre de types d'échantillons photographiés avec succès a augmenté rapidement. Pour ceux qui ont une question spécifique et un tissu particulier, il est probable que quelqu'un sera en mesure d'offrir des conseils et des instructions sur sa préparation et l'imagerie. L'équipement EM de volume peut être amélioré pour inclure la capacité de traiter de plus grands échantillons dans le SBF-SEM et la capacité de moudre de plus grands ROIs avec le FIB. Les logiciels qui sont en mesure de segmenter les structures d'intérêt d'une manière plus automatisée simplifiera considérablement le processus d'analyse des données et l'amélioration de la vitesse de calcul permettra de réduire le temps nécessaire pour le faire. Malgré ses limites actuelles, le volume EM reste un outil utile et la combinaison du SBF-SEM et du FIB-SEM fournit un flux de travail efficace pour identifier les événements rares et les imagerie à haute résolution.

Ce protocole décrit un flux de travail pour le ciblage efficace de la microscopie électronique tridimensionnelle à haute résolution (EM) vers une région d'intérêt spécifique (ROI). Depuis ses débuts dans les années 1930, EM a été une technique essentiellement bidimensionnelle. Les premières images publiées étaient des tissus entiers ou des cellules, mais qui ont rapidement cédé la place à des sections qui ont été coupées à la main à l'aide d'un ultramicrotome et photographiés à l'aide d'un microscope électronique de transmission (TEM). TEM produit des micrographies à très haute résolution où même les plus petites structures cellulaires sont clairement discernables. Cependant, la minceur de la section nécessaire pour que le tissu soit représenté par le faisceau d'électrons a rendu l'information dans la dimension Z minimale. Étant donné que les cellules sont des structures tridimensionnelles, les interactions entre les structures cellulaires et les surfaces cellulaires ont dû être déduites à partir de données limitées. Cela a soulevé le risque de mauvaise interprétation, en particulier dans les structures qui étaient complexes. Certains microscopistes ont réussi à obtenir des structures 3D plus précises par des cellules et des tissus sectionnants en série, puis en les reconstituant minutieusement à partir d'images TEM individuelles1. Il s'agissait d'un processus très laborieux et avant l'avènement de l'imagerie numérique et le rendu informatique, les résultats étaient également difficiles à visualiser. Ces dernières années, deux techniques ont été introduites qui sont devenues collectivement connues sous le nom de microscopie électronique de volume (volume EM)2 qui ont rendu l'EM en trois dimensions accessible à plus de laboratoires.
L'idée d'obtenir une pile d'images à partir d'un bloc intégré à l'intérieur d'un microscope électronique remonte à 1981, lorsque Steve Leighton et Alan Kuzirian ont construit un microtome miniature et l'ont placé dans la chambre d'un microscope électronique à balayage3 (SBF-SEM) . Ce prototype a finalement été copié et amélioré 23 ans plus tard par Denk et Horstmann4 et commercialisé par la suite. À peu près au même moment, les scientifiques biologiques ont pris connaissance d'une autre technologie utilisée principalement dans la science des matériaux, le faisceau d'ions ciblé. Cette technique utilise un faisceau d'ions d'une sorte (Gallium, plasma) pour enlever une très petite quantité de matériau de surface d'un échantillon (FIB-SEM)5. Les deux techniques utilisent la section suivie de l'imagerie fournissant une série d'images qui peuvent être combinées dans un X, Y, Z, pile. Les deux techniques fournissent des informations 3D mais à des échelles de résolution différentes. SBF-SEM est limité par les propriétés physiques du couteau diamant à des tranches pas plus minces que 50 nm pour les longues séries d'imagerie en série; cependant, la taille du bloc d'échantillon qui peut être sectionné est grande, jusqu'à 1 mm x 1 mm x 1 mm. En raison du grand format d'acquisition numérique du détecteur d'électrons dispersés arrière (32k x 32k pixels) qui reçoit un signal de la face de bloc , les tailles de pixels d'image peuvent être aussi petites que 1 nm. Il en résulte des voxels non isotropes où la dimension X,Y est souvent plus petite que la Z. En raison de la précision du faisceau d'ions, FIB-SEM a la capacité de collecter des images avec des voxels isotropes de 5 nm. Cependant, la superficie totale qui peut être imaginée est assez petite. Un tableau récapitulatif de divers échantillons et volumes photographiés avec les deux techniques a été publié précédemment3.
La préparation des tissus pour le volume EM est plus difficile que pour le TEM ou le SEM standard parce que les échantillons doivent être tachés pour fournir une génération de signal adéquate dans le SEM. Fréquemment, les colorations doivent être optimisées non seulement pour le type de tissu particulier, mais aussi pour l'ajout certaines structures cellulaires pour faciliter l'identification et la reconstruction. Le protocole utilisé ici est basé sur la norme NCMIR6. Une coloration supplémentaire signifie généralement des étapes de protocole supplémentaires. Ainsi, pour le volume EM, les protocoles standard doivent être étendus afin d'assurer suffisamment de temps pour que les réactifs pénètrent dans l'échantillon. Le traitement assisté par micro-ondes peut réduire le temps nécessaire pour la coloration de quelques heures à quelques minutes et rendre la préparation de l'échantillon EM de volume plus efficace7. Cette méthode s'applique à tous les types de cellules et de tissus8 et aux questions de recherche où l'inhomogénéité du tissu rend l'échantillonnage d'une zone spécifique essentielle9.
Une fois qu'une pile de données est obtenue, elle peut être alignée et les structures d'intérêt segmentées du reste des données et modélisées en 3D. Bien que l'automatisation de l'imagerie de nombreuses tranches de tissu a rendu l'acquisition d'image relativement simple, le processus de reconstruction numérique et de visualisation des données est une tâche longue. Les logiciels à cette fin ne sont pas encore intégrés ni entièrement automatisés. Étant donné qu'une grande partie des premiers travaux utilisant le volume EM était orientée vers les neurosciences, les techniques de coloration et de segmentation numérique des structures telles que les axones sont assez avancées par rapport à d'autres cellules et organites. Tandis que la littérature sur d'autres tissus non-neuronaux se développe rapidement, les structures non linéaires ou irrégulières exigent plus d'entrée manuelle.
L'utilisation de SBF-SEM et de FIB-SEM est une approche utile pour le ciblage et l'imagerie de structures tissulaires spécifiques et non homogènes à haute résolution en 3D. La combinaison de cela avec le traitement des tissus assistés par micro-ondes qui diminue considérablement le temps nécessaire à la préparation de l'échantillon. Ensemble, ce flux de travail fera de la génération de données d'image voxel isotropiques à haute résolution de structures fines un processus efficace et plus rapide.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3View 2XP</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>NA</td>
			<td>In chamber ultramicrotome for SBFI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer 0.2M solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy resin (circuit works)</td>
			<td>RS components</td>
			<td>496-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diatome Histo 4.0mm diamond knife</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>40-HIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizing tablet</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>DTV-1200W</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding Mold</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High MW Weight Tannic Acid</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco Biowave Pro +</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum Q150T ES sputter coater</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>27645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate 0.2M</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spurrs Resin kit</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>14300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy

Ce protocole permet l'imagerie efficace et efficace d'échantillons de cellules ou de tissus en trois dimensions au niveau de la microscopie électronique. Pendant de nombreuses années, la microscopie électronique (EM) est restée une technique intrinsèquement bidimensionnelle. Avec l'avènement des techniques d'imagerie par microscope électronique à balayage en série (volume EM), utilisant soit un microtome intégré, soit un faisceau d'ions focalisés pour trancher puis visualiser les tissus intégrés, la troisième dimension devient facilement accessible. Microscopie électronique à balayage de blocs en série (SBF-SEM) utilise un ultramicrotome enfermé dans la chambre SEM. Il a la capacité de manipuler de grands spécimens (1 000 m x 1 000 m) et d'imager de grands champs de vision à la petite taille de Pixel X, Y, mais est limité dans la dimension Z par le couteau de diamant. Le faisceau d'ions focalisé SEM (FIB-SEM) n'est pas limité en résolution 3D, (les voxels isotropes de 5 nm sont réalisables), mais le champ de vision est beaucoup plus limité. Ce protocole démontre un flux de travail pour combiner les deux techniques pour permettre de trouver des régions d'intérêt individuelles (ROI) dans un grand champ, puis d'imagerie du volume ciblé subséquent à haute résolution de voxel isotropique. La préparation de cellules ou de tissus fixes est plus exigeante pour les techniques em de volume en raison du contraste supplémentaire nécessaire pour la génération efficace de signal dans l'imagerie SEM. De tels protocoles prennent du temps et demandent beaucoup de main-d'œuvre. Ce protocole intègre également le traitement assisté par micro-ondes des tissus facilitant la pénétration des réactifs, ce qui réduit le temps nécessaire pour le protocole de traitement de jours à heures.

Les images du SBF-SEM donnent un aperçu du tissu, donnant un aperçu de l'orientation spatiale des cellules et des connexions intercellulaires (Figure 4A). L'imagerie FIB-SEM subséquente sur une nouvelle région, qui est habituellement une région d'intérêt déterminée après l'inspection de la course SBF-SEM, ajoute des détails à haute résolution de cellules et/ou structures spécifiques (figure 4B).
Figure 4C ,D montrent la différence dans le rendu des voxels non-isotropes des données SBF-SEM (Figure 4C) et les données isotropiques voxel FIB-SEM (Figure 4D). L'épaisseur z utilisée dans sBF-SEM signifie que le rendu montre clairement les sections, résultant en un effet d'escalier sur la surface. Dans les données FIB-SEM, les sections de 5 nm garantissent que le rendu semble beaucoup plus lisse et que les sections individuelles se fondent complètement dans la surface.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig1.jpg"> Figure 1 : Création de la face du bloc à partir d'un échantillon incorporé de résine. (A) Une pointe racine enchâssée dans la résine. (B) À l'aide d'une lame de rasoir, l'excès de résine est coupé jusqu'à ce qu'il reste un bloc de 0,5 mm2. (C,D) Le bloc taillé est collé sur une goupille métallique et après une nuit dans le four, les côtés du bloc sont taillés et la surface lissée avec un couteau en diamant à l'aide d'un ultramicrotome. (E) À l'intérieur du SBF-SEM, l'échantillon est orienté de sorte que le blockface et le retour sur investissement puissent être reconnus, barre d'échelle de 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig2.jpg"> Figure 2 : Corrélation entre le SBF-SEM et le FIB-SEM. Aperçu des images du block-face à l'aide du SBF-SEM (A) et de la FIB-SEM (B), barre d'échelle de 5 m. (C,D) Zoom sur le retour sur investissement. La boîte rouge délimite la région à être représentée avec FIB-SEM, barre d'échelle de 5 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig3.jpg"> Figure 3 : Système FIB-SEM et étapes de préparation. (A) Schéma indiquant l'orientation du faisceau FIB, du faisceau SEM et de l'échantillon. L'échantillon doit être placé au point de coïncidence des faisceaux FIB et SEM pour pouvoir moudre et imager sur la même région. (B) Dessin schématique de la tranchée nécessaire à l'imagerie SEM des sections enlevées par la FIB. (C) Image prise avec le faisceau FIB montrant le dépôt de platine sur le roi-échange, barre d'échelle 5 m. (D) Image prise avec le faisceau FIB montrant les lignes utilisées pour l'auto-focus et le suivi 3D. Les lignes au milieu sont utilisées pour l'auto-focus et les lignes extérieures fournissent un suivi 3D. Dépôt de carbone sur le dessus des lignes fournit le contraste nécessaire (platine vs carbone) pour effectuer ces tâches, échelle bar 5 m. (E) Image prise avec le faisceau FIB après le fraisage de la tranchée, barre d'échelle 5 m. (F) Image prise avec le faisceau SEM montrant le région d'intérêt représentée pendant la course FIB-SEM, barre d'échelle de 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig4.jpg"> Figure 4 : Résultats SBF-SEM et FIB-SEM avant et après la segmentation. (A) vue 3D du jeu de données SBF-SEM (100 x 100 x 40 m, barre d'échelle de 10 m), (B) vue 3D du jeu de données FIB-SEM (17 x 10 x 5,4 m, barre d'échelle de 2 m),( C) Les vacuoles rendus segmentés à partir des données SBF-SEM par seuil, barre d'échelle à 2 m D. mented à partir des données FIB-SEM par seuil, barre d'échelle de 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig4large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="10">Protocole pour le traitement par micro-ondes</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">émission #</td>
			<td rowspan="2">description</td>
			<td rowspan="2">Prompt de l'utilisateur (on/off)</td>
			<td rowspan="2">Temps (hr:min:sec)</td>
			<td rowspan="2">Puissance (Watts)</td>
			<td rowspan="2">Température (C)</td>
			<td rowspan="2">Refroidisseur de charge (off/auto/on)</td>
			<td rowspan="2">Vacuum/Bubbler Pump (off/bubb/vac cycle/vac on/vap)</td>
			<td>Temp stable</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Pompe (on/off)</td>
			<td>Température (C)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">8</td>
			<td rowspan="3">Tch</td>
			<td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">9</td>
			<td rowspan="5">Osmium</td>
			<td>de</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">10</td>
			<td>50% EtOH</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>de</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>70% EtOH</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>de</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>90% EtOH</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>de</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% EtOH</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>de</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% EtOH</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>de</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>0,1 M CACODYLATE</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>0,1 M CACODYLATE</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>ddH2O</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>sur</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="7">16</td>
			<td rowspan="7">Acétate uranyl</td>
			<td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>de</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>de</td>
			<td>CYCLE DE VIDE</td>
			<td>sur</td>
			<td>30</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1. Protocole détaillé pour le traitement par micro-ondes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>pas</td>
			<td>courant</td>
			<td>Temps estimé</td>
		</tr>
<tr>
<td>Déposition Platine</td>
			<td>3n A</td>
			<td>10-15 minutes</td>
		</tr>
<tr>
<td>Milling Autotune et marques de suivi</td>
			<td>50-100 pA</td>
			<td>4-6 minutes</td>
		</tr>
<tr>
<td>Déposition de carbone</td>
			<td>3 nA</td>
			<td>5-10 minutes</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trench grossier de fraisage</td>
			<td>15-30 nA</td>
			<td>30-50 minutes</td>
		</tr>
<tr>
<td>Surface de polissage</td>
			<td>1.5-3 nA</td>
			<td>15-20 minutes</td>
		</tr>
<tr>
<td>Course d'imagerie</td>
			<td>700 pA-1.5 nA</td>
			<td>Heures-jours</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2. Courants de fraisage FIB utilisés pour la préparation de l'échantillon et l'imagerie

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Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

Études ciblées utilisant le visage de bloc en série et la microscopie électronique focalisée de faisceau d'ion

Ici, nous présentons un protocole pour combiner efficacement la face de bloc de série et la microscopie électronique focalisée de faisceau d'ions pour cibler une zone d'intérêt. Cela permet une recherche efficace, en trois dimensions, et la localisation d'événements rares dans un grand champ de vision.

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Tout projet de sciences de la vie qui nécessite une étude ultrastructure 3D d’une région spécifique d’intérêt pour un échantillon biologique complexe peut faire usage de cette technique. La procédure de préparation de l’échantillon est la même pour deux modalités d’imagerie étant SBF/SEM et FIB-SEM. L’utilisation du four à micro-ondes accélère considérablement la partie de traitement de l’échantillon.Bien que montré ici pour les bouts de racine, ce protocole peut être employé pour n’importe quel système biologique de modèle avec des ajustements minimaux. Avant d’utiliser ce workflow pour corréler le SBF/SEM et le FIB-SEM, il faut connaître les technologies individuelles. L’exécution de certaines étapes est facile à démontrer mais difficile à décrire dans le texte écrit.Peter Borghgraef, technicien dans notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, couper les extrémités des racines des semis fixes d’Arabidopsis thaliana sur les plaques d’agar et mettre deux à trois pointes dans les tubes d’Eppendorf contenant le même fixatif pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin, avec une pipette, remplacer fixatif par 0,1 tampon de phosphate molaire au pH 6,8 dans les tubes avec les tubes sur une table rotative à 100 RPM et laver pendant 10 minutes.Répétez ensuite le lavage à l’aide d’un tampon de phosphate frais cinq fois. Dans une hotte de fumée, post-fixer les extrémités des racines en remplaçant le tampon de phosphate par 2% de tétoxyde d’osmium et 0,2% de ruthénium rouge en tampon phosphate molaire 0,1 à pH 6,8 avec les tubes avec couvercles ouverts au micro-ondes et commencer le programme. Puis jetez la solution dans les tubes et lavez les pointes des racines deux fois avec de l’eau distillée double pendant cinq minutes chacune.Pour le troisième et le quatrième lavage à l’eau distillée double, utilisez le four à micro-ondes pour aider au lavage. Après le premier lavage à l’eau distillée double de 40 secondes, sortez les échantillons d’extrémité des racines du four à micro-ondes et remplacez l’eau distillée double par de l’eau fraîche distillée double. Remettre les échantillons au micro-ondes et poursuivre le programme.Ensuite, préparez la solution TCH en ajoutant 0,1 gramme de thiocarbohydrazide à 10 millilitres d’eau distillée double dans un tube de 15 millilitres. Placer le tube au four et chauffer à 60 degrés Celsius pendant une heure pour dissoudre. Filtrez ensuite la solution TCH à l’aide d’un filtre seringue de 0,22 micromètre.Remplacez immédiatement la solution dans les tubes d’échantillon par la solution TCH filtrée et continuez avec le protocole. Maintenant, immerger les échantillons dans l’éthanol et les placer dans le micro-ondes pour se déshydrater dans des étapes classées de 50%70%90%, puis deux fois de traitement 100% éthanol. Après le traitement de déshydratation par oxyde de propylène, ajouter 50% de résine spurr dans les tubes pour commencer l’infiltration des extrémités des racines pendant au moins deux heures.Après l’incubation finale dans la résine de 100%Spurr, placez les extrémités des racines dans les moules d’intégration et remplissez les moules avec de la résine fraîche 100% Spurr et polymérisez dans un four à 65 degrés Celsius pendant 36 à 48 heures. Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir pour couper grossièrement l’échantillon polymérisé en un mince bloc. Avec le côté ayant le tissu exposé face vers le bas, fixez l’échantillon au centre d’une goupille en métal avec de la résine époxy conductrice pour avoir le tissu touchant la goupille en métal.Placer l’échantillon dans un four à 65 degrés Celsius pour guérir l’époxy pendant la nuit. Le matin, chargez la goupille métallique dans le support et utilisez une lame de rasoir pour éliminer tout excès d’époxy de l’échantillon. Pour lisser davantage la face de l’échantillon, chargez le support avec la goupille métallique dans le support pour l’ultramicrotome.Dans l’ultramicrotome, utilisez un couteau en verre ou en diamant pour lisser la face des côtés du bloc formant une pyramide. Assurez-vous qu’au moins une partie du tissu est déjà exposée sur la face du bloc. Placez ensuite le bloc d’échantillon paré dans le revêtement de pulvérisateur et ajustez les réglages en platine à deux à cinq nanomètres pour enrober l’échantillon d’une fine couche.Insérez le support dans le microscope SBF-SEM. Apportez le couteau à diamants près de la surface de l’échantillon et coupez la partie supérieure de l’échantillon pour enlever la couche de platine et exposer une partie du tissu. Réglez ensuite la tension d’accélération à 1,5 à 2 kilovolts.Capturez une image du tissu et configurez une course d’imagerie. À l’aide du logiciel Fidji, sélectionnez le fichier, importez, séquencez d’image et localisez la pile d’images pour charger les images. Après avoir ajusté l’image en fonction du manuscrit, vérifiez l’alignement en faisant défiler l’ensemble de données.Utilisez la commande d’sauvegarde sous le menu de fichiers pour enregistrer l’ensemble de données alignés en tant que fichier TIFF 3D. Analyser attentivement l’ensemble de données pour voir si le retour sur investissement est inclus et contient les informations nécessaires à la question biologique. Sur la dernière image de la pile, qui est la face de bloc actuelle dans le microscope SBF-SEM, sélectionnez un nouveau roi pour FIB-SEM.Après avoir recouvert de platine à nouveau, chargez l’échantillon dans le FIB-SEM et utilisez le détecteur d’électrons secondaire à 15 kilovolts et une nanoampe pour localiser le retour sur investissement identifié dans le SBF-SEM sur la face du bloc. Déplacez et inclinez la scène pour amener le retour sur investissement sur l’échantillon dans le point de coïncidence des faisceaux FIB et SEM, à l’aide du faisceau FIB et du système d’injection de gaz. Déposez une couche protectrice d’un micromètre de platine sur la surface au-dessus du retour sur investissement.Ensuite, à l’aide d’un faible courant de fraisage allant de 50 à 100 picoamps, les lignes fines de l’usine dans le dépôt de platine pour l’autofocusing et le suivi 3D pendant la course d’imagerie. Puis, à l’aide d’un courant de fraisage élevé de 30 nanoampes, moudre une tranchée de 30 micromètres devant le retour sur investissement créant la surface d’imagerie pour le faisceau SEM. Après avoir lissage de la surface de l’image, démarrez l’imagerie et surveillez la stabilité du processus pendant les 50 à 100 premières sections.Une fois que le système fonctionne bien, quittez la pièce et assurez-vous qu’il y a le moins de perturbations possible dans la pièce. Les images du SBF-SEM donnent un aperçu du tissu donnant un aperçu de l’orientation spatiale des cellules et des connexions intracellulaires. L’imagerie FIB-SEM ultérieure sur une nouvelle région ajoute des détails à haute résolution de cellules et de structures spécifiques.Les données du SBF-SEM montrent un rendu différent des voxels non isotropes des données isotropes voxel FIB-SEM. SBF-SEM présente un effet d’escalier sur la surface tandis que les données FIB-SEM ayant les cinq sections nanométriques assure que le rendu semble beaucoup plus lisse et les sections individuelles se fondent complètement dans la surface. Ce protocole décrit l’imagerie d’une région unique dans un seul échantillon et tout écart par rapport au flux de travail peut causer des dommages à l’échantillon, rendant impossible la relocalisation de la région d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Biology

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Recherche

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