Name: targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy
Uploaded: 2019-08-10T14:00:00
Duration: 9 min 9 s
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मात्रा EM के लिए उपकरण Flanders की सरकार से एक उदार अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.

<ol>
	<li>Linberg, K. A., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+interplexiform+cell+synapses+in+the+human+retina.">An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).</li><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Leighton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+&#8211;+A+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM &#8211; A technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three+dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 11, 329 (2004).</li><li>Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10 Available from: <a target="_blank" href="https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2019)</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Sommer, C., Str&#228;hle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+Interactive+Learning+and+Segmentation+Toolkit.">ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit.</a> Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

वॉल्यूम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पारंपरिक SEM या TEM की तुलना में अधिक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली है। क्योंकि ऊतकों या कोशिकाओं एन ब्लॉक दाग की जरूरत है, प्रसंस्करण कदम काफी लंबे समय के लिए नमूना भर में अभिकर्मकों के प्रवेश सुनिश्चित होना चाहिए. माइक्रोवेव ऊर्जा का उपयोग प्रवेश की सुविधा के लिए कम, अधिक कुशल प्रसंस्करण के लिए बनाता है और धुंधला सुधार. क्योंकि EM के लिए तैयारी प्रकाश माइक्रोस्कोपी सभी समाधानऔर अभिकर्मकों के लिए की तुलना में अधिक कठोर है गुणवत्ता कड़ाई से नियंत्रित किया जाना चाहिए. पीएच, टॉनिसिटी, अशुद्ध अभिकर्मकों के उपयोग, और खराब तकनीक के कारण contaminants की शुरूआत में परिवर्तन सभी अंतिम छवि पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है.
वॉल्यूम EM भी प्रत्येक भिन्न नमूना प्रकार के लिए अलग-अलग अनुरूप प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। विभिन्न प्रकार के स्तन के ऊतक: पौधे, एकल कोशिकाएं जैसे खमीर, ट्रिपेनोसोम, सी एलिगनआदि, सभी को इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए अपनी विविधताओं की आवश्यकता होती है। फिक्सिंग और धुंधला संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने और संभव के रूप में विवो आकृति विज्ञान में इसके करीब के रूप में नमूना रखने के लिए इतनी के रूप में डिजाइन किया जाना चाहिए। शारीरिक तापमान, पीएच और टॉनिकता पर ऊतकों का निर्धारण जीवन की तरह के रूप में नमूना बनाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह हो सकता है. उच्च दबाव ठंड (HPF) नमूनों की एक और अधिक जीवन की तरह स्थिति को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं, (या शायद सिर्फ अलग कलाकृतियों उपज), लेकिन कोशिकाओं और बहुत पतली ऊतकों HPF के रूप में विफल हो जाएगा के अलावा अन्य के लिए केवल छोटे संस्करणों में उत्पन्न किया जा सकता है. इसलिए कई सवालों के लिए रासायनिक निर्धारण ही एकमात्र विकल्प है. कोई फर्क नहीं पड़ता अगर निर्धारण HPF या रासायनिक है, किसी भी EM प्रयोग में संरचनात्मक परिणाम ध्यान से लाइव सेल या ऊतक इमेजिंग से इसी तरह के परिणामों की तुलना में अगर वे संगत कर रहे हैं देखने की जरूरत है. दाग भी अनुकूलित किया जाना चाहिए, जबकि विशिष्ट सवाल है कि जवाब दिया जा करने की जरूरत है और प्रोटोकॉल है कि डिजिटल छवियों के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया जाएगा पर विचार.
दोनों एक SBF-SEM और निकट निकटता में FIB प्रणाली होने के कई प्रयोगों में एक महान लाभ है. देखने के बड़े क्षेत्र और उच्च एक्स, SBF-SEM के वाई संकल्प व्यक्तिगत संरचनाओं / कोशिकाओं / घटनाओं सरल खोजने बनाता है और ऊतकों में कोशिकाओं की एक समग्र स्थानिक अभिविन्यास प्रदान करता है. इसके अलावा, $ में एक नमूना के माध्यम से इमेजिंग की अनुमति देने की क्षमता बहुत शक्तिशाली है; हालांकि, पुनर्निर्माण है कि ठीक ज्यामितीय विस्तार की आवश्यकता विफल या गैर-isotropic voxels यह उत्पन्न करता है के कारण इस तकनीक का उपयोग कर कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं. FIB एक छोटे इमेजिंग क्षेत्र के लिए प्रक्रिया के भौतिकी द्वारा सीमित है, लेकिन इसके 3 डी संकल्प बहुत सटीक पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त है. दो तकनीकों के संयोजन के रूप में नमूने आगे प्रसंस्करण या तैयारी के बिना FIB करने के लिए SBF-SEM से स्थानांतरित कर सकते हैं सरल है. हम स्वीकार करते हैं कि एक विशेष क्षेत्र को खोजने के लिए एक नमूना के माध्यम से खोज के लिए SBF-SEM का उपयोग कर एक बहुत अधिक सक्षम उपकरण का एक बहुत महंगा उपयोग है. हालांकि, तुरंत नए blockface देखने और ROI तक पहुँच गया है कि क्या यह निर्धारित करने की क्षमता एक बड़ा लाभ है। इसके अतिरिक्त, सीरियल अर्द्ध-thin (0.5 डिग्री) LM वर्गों का उपयोग करने के विकल्प छोटे संरचनाओं को दूर कर सकते हैं इससे पहले कि वे पता लगाया है, और एक एकल TEM वर्गों जो काट दिया जाना है का उपयोग कर एक ब्लॉक का निरीक्षण, एक ग्रिड पर डाल दिया और फिर एक समान रूप से महंगा TEM में देखा के रूप में नहीं है प्रस्तुत विधि के रूप में कुशल.
चूँकि कई प्रोग्राम डेटा को सेगमेंट और रेंडर करने के लिए मौजूद हैं, और किसी दिए गए संरचना की आवश्यकताओं को किसी एकल अनुप्रयोग द्वारा श्रेष्ठ रूप से कार्य नहीं किया जा सकता है, इसलिए कोई मानक वर्कफ़्लो प्रस्तावित नहीं किया जा सकता. कुछ सरल संरचनाएँ एक दहलीज एल्गोरिथ्म के साथ विभाजित किया जा सकता है अगर वे बहुत संकीर्ण ग्रे पैमाने मूल्यों के भीतर आते हैं. न्यूरोनल संरचनाओं अर्द्ध स्वचालित रूप से इस तरह के Ilastik11 के रूप में एक कार्यक्रम का उपयोग कर विभाजित किया जा सकता है, लेकिन यह इस तरह के ईआर के रूप में अधिक यादृच्छिक या जटिल आकार organelles पर कम उपयोगी हो जाएगा। माइक्रोस्कोपी छवि ब्राउज़र एक बहुत लचीला प्रोग्राम है जो वॉल्यूम EM डेटा को संरेखित, सेगमेंट और रेंडर कर सकता है, लेकिन इसके लिए महत्वपूर्ण उपयोगकर्ता इंटरैक्शन12की आवश्यकता होती है। एक सामान्य नियम के रूप में परिणामों को डिजिटल रूप से विज़ुअलाइज़ करने के लिए आवश्यक समय बहुत नमूना और इमेजिंग तैयार करने के लिए समय से अधिक हो जाएगा।
वॉल्यूम EM तकनीक ultrastructural विश्लेषण करने के लिए तीसरे आयाम खोल दिया है. 3 D EM प्राप्त करने की अन्य विधियों में उनके वॉल्यूम (TEM टोमोग्राफी), या उनकी दक्षता (सीरियल अनुभाग TEM) की सीमाएँ हैं। हालांकि सबसे अधिक भाग मात्रा EM तकनीक के लिए भी जटिल और महंगा करने के लिए व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं में लागू किया जा रहे हैं, साझा कोर उन्हें पेशकश सुविधाओं की संख्या बढ़ रही है और नमूना प्रकार की संख्या सफलतापूर्वक छवि तेजी से बढ़ गया है. एक विशिष्ट प्रश्न और एक विशेष ऊतक के साथ उन लोगों के लिए यह संभावना है कि किसी को सलाह और इसकी तैयारी और इमेजिंग पर निर्देश की पेशकश करने में सक्षम हो जाएगा. वॉल्यूम EM उपकरण SBF-SEM में बड़े नमूने और एफआईबी के साथ बड़ा ROIs मिलिंग की क्षमता को संभालने की क्षमता शामिल करने के लिए सुधार किया जा सकता है। सॉफ्टवेयर है जो एक और अधिक स्वचालित तरीके से ब्याज की संरचनाओं को विभाजित करने में सक्षम है काफी डेटा का विश्लेषण करने की प्रक्रिया को सरल और कंप्यूटिंग गति में सुधार ऐसा करने के लिए आवश्यक समय कम हो जाएगा. अपनी वर्तमान सीमाओं के बावजूद, मात्रा EM अभी भी एक उपयोगी उपकरण है और SBF-SEM और FIB-SEM के संयोजन दुर्लभ घटनाओं की पहचान करने और उन्हें उच्च संकल्प पर इमेजिंग के लिए एक कुशल कार्यप्रवाह प्रदान करता है.

यह प्रोटोकॉल रुचि के किसी विशिष्ट क्षेत्र (ROI) के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन, त्रि-आयामी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के कुशल लक्ष्यीकरण के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है. 1930 के दशक में अपनी शुरुआत के बाद से, EM एक अनिवार्य रूप से दो आयामी तकनीक किया गया है. पहले प्रकाशित छवियों पूरे ऊतकों या कोशिकाओं के थे, लेकिन है कि जल्द ही वर्गों है कि हाथ से एक ultramicrotome का उपयोग कर काट रहे थे और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) का उपयोग कर छवि के लिए रास्ता दे दिया. TEM बहुत उच्च संकल्प micrographs जहां भी सेलुलर संरचनाओं की छोटी स्पष्ट रूप से स्पष्ट कर रहे हैं पैदा करता है. तथापि, ऊतक के लिए आवश्यक अनुभाग की पतलापन इलेक्ट्रॉन बीम द्वारा छवि किए जाने के लिए $ आयाम न्यूनतम में जानकारी बनाई. चूँकि कोशिकाएँ त्रि-आयामी संरचना होती हैं, इसलिए सेल संरचनाओं और कोशिका सतहों के बीच होने वाली क्रियाओं को सीमित डेटा से अनुमान लगाया जाना था। इसने गलत व्याख्या की क्षमता को बढ़ाया, विशेष रूप से उन संरचनाओं में जो जटिल थे। कुछ microscopists धारावाहिक अनुभाग कोशिकाओं और ऊतकों द्वारा और अधिक सटीक 3 डी संरचनाओं को प्राप्त करने में कामयाब रहे और फिर परिश्रम से उन्हें व्यक्तिगत TEM छवियों1से पुनर्निर्माण. यह एक बहुत ही श्रम गहन प्रक्रिया थी और डिजिटल इमेजिंग और कंप्यूटर प्रतिपादन परिणाम के आगमन से पहले भी कल्पना करना मुश्किल था. हाल के वर्षों में दो तकनीकों जो सामूहिक मात्रा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मात्रा EM)2 है कि तीन आयामों में EM अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना दिया है के रूप में जाना जाता है शुरू किया गया है.
एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के अंदर एक एम्बेडेड ब्लॉक से छवियों के एक ढेर प्राप्त करने का विचार 1981 को वापस पता लगाया जा सकता है जब स्टीव Leighton और एलन Kuzirian एक लघु microtome का निर्माण किया और यह एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखा3 (SBF-SEM) . इस प्रोटोटाइप अंततः नकल की और सुधार किया गया था 23 साल बाद Denk और Horstmann4 द्वारा और बाद में commercialized. मोटे तौर पर एक ही समय में जैविक वैज्ञानिकों सामग्री विज्ञान में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया एक और तकनीक के बारे में पता बन गया, ध्यान केंद्रित आयन बीम. इस तकनीक के एक नमूने से सतह सामग्री की एक बहुत छोटी राशि को दूर करने केलिए किसी तरह (गैलियम, प्लाज्मा) के एक आयन बीम का उपयोग करता है (एफआईबी-SEM) 5. दोनों तकनीकों इमेजिंग छवियों जो एक एक्स, वाई, जेड, ढेर में जोड़ा जा सकता है की एक श्रृंखला प्रदान करने के बाद अनुभागीकरण रोजगार. दोनों तकनीकों 3 डी जानकारी प्रदान करते हैं, लेकिन अलग संकल्प तराजू पर. SBF-SEM लंबे सीरियल इमेजिंग रन के लिए कोई पतली से अधिक 50 एनएम स्लाइस करने के लिए हीरे चाकू के भौतिक गुणों द्वारा सीमित है; हालांकि नमूना ब्लॉक आकार है कि अनुभाग किया जा सकता है बड़ा है, अप करने के लिए 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी. वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर के बड़े डिजिटल अधिग्रहण प्रारूप के कारण (32k x 32k पिक्सल) कि ब्लॉक चेहरे से एक संकेत प्राप्त करता है , छवि पिक्सेल आकार के रूप में 1 एनएम के रूप में छोटा हो सकता है. यह गैर-isotropic voxels में परिणाम है जहाँ एक्स,Y आयाम अक्सर $ से छोटा है. आयन बीम की शुद्धता की वजह से, FIB-SEM isotropic voxels के साथ छवियों को इकट्ठा करने की क्षमता है $ 5 एनएम. हालांकि, कुल क्षेत्र है कि छवि की जा सकती है काफी छोटा है. दो तकनीकों के साथ छवि किए गए विभिन्न नमूनों और मात्राओं का सारांश तालिका पहले3प्रकाशित किया जा चुका है।
मात्रा EM के लिए ऊतक तैयारी मानक TEM या SEM के लिए की तुलना में अधिक कठिन है क्योंकि नमूने SEM में पर्याप्त संकेत पीढ़ी प्रदान करने के लिए दाग होना चाहिए. अक्सर, sstainings न केवल विशेष ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी जोड़ने के लिए पहचान और पुनर्निर्माण को आसान बनाने के लिए कुछ सेलुलर संरचनाओं के विपरीत। यहाँ प्रयुक्त प्रोटोकॉल एनसीएमआईआर मानक6पर आधारित है। अतिरिक्त धुंधला आमतौर पर अतिरिक्त प्रोटोकॉल कदम का मतलब है. इस प्रकार मात्रा EM के लिए, मानक प्रोटोकॉल नमूने घुसना करने के लिए अभिकर्मकों के लिए पर्याप्त समय सुनिश्चित करने के लिए बढ़ाया जा करने के लिए की जरूरत है. माइक्रोवेव सहायता प्राप्त प्रसंस्करण घंटे से मिनट के लिए धुंधला करने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकते हैं और मात्रा EM नमूना तैयारी अधिक कुशल7बनाता है. यह विधि सभी कोशिकाओं और ऊतकों के प्रकारों पर लागू होती हैऔर अनुसंधान प्रश्नों पर लागू होती है जहां ऊतक की असमांगता किसी विशिष्ट क्षेत्र के नमूने को आवश्यक9बनाती है .
एक बार एक डेटा स्टैक प्राप्त किया जाता है यह गठबंधन किया जा सकता है और ब्याज की संरचनाओं डेटा के बाकी हिस्सों से विभाजित और 3 डी में मॉडलिंग की. हालांकि ऊतक के कई स्लाइस इमेजिंग के स्वचालन छवि अधिग्रहण अपेक्षाकृत सरल बना दिया है, डिजिटल पुनर्निर्माण और डेटा visualizing की प्रक्रिया एक समय लेने वाली काम है. इस उद्देश्य के लिए सॉफ्टवेयर अभी तक एकीकृत और न ही पूरी तरह से स्वचालित नहीं है. मात्रा EM का उपयोग कर जल्दी काम के बहुत से तंत्रिका विज्ञान की ओर निर्देशित किया गया था के बाद से, इस तरह के axons के रूप में दाग और डिजिटल रूप से खंडित संरचनाओं के लिए तकनीक काफी दूर अन्य कोशिकाओं और organelles की तुलना में उन्नत है. जबकि अन्य गैर-न्यूरोनल ऊतकों पर साहित्य तेजी से बढ़ रहा है, nonlinear या अनियमित संरचनाओं और अधिक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता है.
दोनों SBF-SEM और FIB-SEM का उपयोग लक्ष्यीकरण और 3 डी में उच्च संकल्प पर विशिष्ट, nonhomogeneous, ऊतक संरचनाओं इमेजिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है. संयोजन है कि माइक्रोवेव के साथ सहायता प्रदान की ऊतक प्रसंस्करण है कि काफी समय नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक कम हो जाती है. एक साथ इस कार्यप्रवाह ठीक संरचनाओं के उच्च संकल्प isotropic voxel छवि डेटासेट एक कुशल और अधिक तेजी से प्रक्रिया पैदा कर देगा.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3View 2XP</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>NA</td>
			<td>In chamber ultramicrotome for SBFI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer 0.2M solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy resin (circuit works)</td>
			<td>RS components</td>
			<td>496-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diatome Histo 4.0mm diamond knife</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>40-HIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizing tablet</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>DTV-1200W</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding Mold</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High MW Weight Tannic Acid</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco Biowave Pro +</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum Q150T ES sputter coater</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>27645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate 0.2M</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spurrs Resin kit</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>14300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy

इस प्रोटोकॉल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संकल्प स्तर पर तीन आयामों में सेल या ऊतक के नमूने के कुशल और प्रभावी इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. कई वर्षों के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) एक स्वाभाविक दो आयामी तकनीक बनी हुई है. सीरियल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप इमेजिंग तकनीक (मात्रा EM) के आगमन के साथ, या तो एक एकीकृत microtome या ध्यान केंद्रित आयन बीम का उपयोग करने के लिए टुकड़ा तो एम्बेडेड ऊतकों को देखने, तीसरे आयाम आसानी से सुलभ हो जाता है. सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBF-SEM) SEM कक्ष में संलग्न एक ultramicrotome का उपयोग करता है. यह बड़े नमूनों को संभालने की क्षमता है (1,000 डिग्री x 1,000 $m) और छवि छोटे एक्स, वाई पिक्सेल आकार पर देखने के बड़े क्षेत्रों, लेकिन हीरे चाकू द्वारा जेड आयाम में सीमित है. केंद्रित आयन बीम SEM (FIB-SEM) 3 डी संकल्प में सीमित नहीं है, (5 एनएम के isotropic voxels प्राप्त कर रहे हैं), लेकिन देखने के क्षेत्र में बहुत अधिक सीमित है. इस प्रोटोकॉल एक बड़े क्षेत्र में ब्याज (ROIs) के अलग-अलग क्षेत्रों को खोजने के लिए अनुमति देने के लिए दो तकनीकों के संयोजन के लिए एक कार्यप्रवाह को दर्शाता है और फिर उच्च isotropic voxel संकल्प पर बाद में लक्षित मात्रा इमेजिंग. स्थिर कोशिकाओं या ऊतकों की तैयारी SEM इमेजिंग में कुशल संकेत पीढ़ी के लिए आवश्यक अतिरिक्त विषम के कारण मात्रा EM तकनीकों के लिए अधिक मांग है. इस तरह के प्रोटोकॉल समय लेने और श्रम गहन हैं. इस प्रोटोकॉल में माइक्रोवेव सहायता प्राप्त ऊतक प्रसंस्करण अभिकर्मकों के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने को भी शामिल किया गया है, जो प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के लिए दिन से घंटों के लिए आवश्यक समय को कम करता है।

एसबीएफ-सेम की छवियां ऊतक का अवलोकन प्रदान करती हैं, जो कोशिकाओं के स्थानिक अभिविन्यास और अंतरकोशिकीय कनेक्शनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करती हैं (चित्र 4क)। एक नए क्षेत्र पर बाद में FIB-SEM इमेजिंग, जो आमतौर पर SBF-SEM रन के निरीक्षण के बाद निर्धारितब्याज का एक क्षेत्र है, विशिष्ट कोशिकाओं और /
चित्र 4C ,D SBF-SEM डेटा के गैर-आइसोट्रोपिक वोक्सल्स के रेंडरिंग में अंतर दिखाता है (चित्र 4C) और समस्थानिक वोसेल एफआईबी-SEM डेटा (चित्र 4D) . SBF-SEM में प्रयुक्त z मोटाई का अर्थ है कि प्रतिपादन स्पष्ट रूप से वर्गों को दिखाता है, जिसके परिणामस्वरूप सतह पर एक 'सीढ़ी' प्रभाव होता है। FIB-SEM डेटा में 5 एनएम वर्गों सुनिश्चित करें कि प्रतिपादन बहुत चिकनी और व्यक्तिगत वर्गों पूरी तरह से सतह में मिश्रण प्रकट होता है.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig1.jpg"> चित्र 1: एक राल एम्बेडेड नमूने से ब्लॉक चेहरे का निर्माण. (ए) राल में एम्बेडेड रूट-टिप। (बी) एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग अतिरिक्त राल दूर छंटनी की है जब तक 0.5 मिमी2 के एक ब्लॉक रहता है. (सी, डी) छंटनी ब्लॉक एक धातु पिन पर चिपके हुए है और ओवन में एक रात के बाद, ब्लॉक के पक्षों छंटनी कर रहे हैं और सतह एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग कर एक हीरे चाकू के साथ smoothened। (ई) एसबीएफ-एसईएम के अंदर, नमूना उन्मुख होता है ताकि ब्लॉकफेस और आरओआई को पहचाना जा सके, स्केल बार ] 20 उ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig2.jpg"> चित्र 2: SBF-SEM और FIB-SEM के बीच सहसंबंध. SBF-SEM (A) और FIB-SEM (B), स्केलबार $ 5 $m. (C,D) ROI पर ज़ूम का उपयोग करके ब्लॉक-फ़ेस की अवलोकन छवियों का अवलोकन करें. लाल बॉक्स FIB-SEM, स्केल बार $ 5 m के साथ छवि बनाने के लिए क्षेत्र को रेखांकित करता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig3.jpg"> चित्र 3: FIB-SEM योजना और तैयारी कदम. (क) योजना में एफआईबी बीम, SEM बीम और नमूने के अभिविन्यास को दर्शाने की गई है। नमूना एक ही क्षेत्र पर मिल और छवि करने में सक्षम होने के लिए FIB और SEM बीम के संयोग बिंदु पर तैनात होने की जरूरत है. (बी) एफआईबी द्वारा हटाए गए खंडों के SEM इमेजिंग के लिए आवश्यक ट्रेंच की योजना ड्राइंग। (सी) आरओआई पर प्लेटिनम जमा दिखा एफआईबी बीम के साथ ली गई छवि, स्केल बार 5 डिग्री (डी) छवि ऑटो फोकस और 3 डी ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया लाइनों दिखा एफआईबी बीम के साथ लिया. बीच में लाइनों ऑटो फोकस के लिए उपयोग किया जाता है और बाहर लाइनों 3 डी ट्रैकिंग प्रदान करते हैं. लाइनों के शीर्ष पर कार्बन जमाव इन कार्यों को करने के लिए आवश्यक विपरीत (प्लेटिनम बनाम कार्बन) प्रदान करता है, स्केलबार 5 डिग्री मी . (ई) खाई की मिलिंग के बाद एफआईबी बीम के साथ ली गई छवि, स्केलबार 5 डिग्री मी. (एफ) छवि SEM बीम के साथ ली गई है जो SEM बीम के साथ ली गई है FIB-SEM रन के दौरान छवि ब्याज का क्षेत्र, स्केल बार 2 $m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig4.jpg"> चित्र 4: SBF-SEM और FIB-SEM परिणाम से पहले और विभाजन के बाद. (ए) एसबीएफ-सेम डेटासेट का 3डी दृश्य (100 x 100 x 40 मीटर, स्केल बार ] 10 $m ), (B ) FIB-SEM डेटासेट का 3D दृश्य (17 x 10 x 5.4 m , स्केल बार ] 2 $m ), (सी) रेंडेड धानी को एसबीएफ-सेम डेटा से विभाजित किया गया है। फिबी-SEM डेटा से थ्रेशोल्डिंग, स्केल बार $ 2 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="10">माइक्रोवेव प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">प्रोग्राम #</td>
			<td rowspan="2">विवरण</td>
			<td rowspan="2">उपयोगकर्ता प्रॉम्प्ट (ऑन/</td>
			<td rowspan="2">समय (hr:min:sec)</td>
			<td rowspan="2">बिजली (वाट्स)</td>
			<td rowspan="2">अस्थायी (जेडसी)</td>
			<td rowspan="2">लोड कूलर (ऑफ/</td>
			<td rowspan="2">वैक्यूम/बबलर पम्प (ऑफ/बब्ब/वैक चक्र/वैक ऑन/वैप)</td>
			<td>स्टेडी टेम्प</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>पम्प (ऑन/ऑफ)</td>
			<td>अस्थायी (जेडसी)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">8</td>
			<td rowspan="3">टीएचएच</td>
			<td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">9</td>
			<td rowspan="5">OSMIUM</td>
			<td>बंद</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">10</td>
			<td>50% EtOH</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>बंद</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>70% EtOH</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>बंद</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>90% EtOH</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>बंद</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% EtOH</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>बंद</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% EtOH</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>बंद</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>0.1एम काकोडाइलेट</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>0.1एम काकोडाइलेट</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>डीडीएच2हे</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>डीडीएच2हे</td>
			<td>पर</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="7">16</td>
			<td rowspan="7">यूरेनिल ऐसीटेट</td>
			<td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>बंद</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>बंद</td>
			<td>वैक्यूम साइकिल</td>
			<td>पर</td>
			<td>30</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1. माइक्रोवेव प्रसंस्करण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>चरण</td>
			<td>वर्तमान</td>
			<td>अनुमानित समय</td>
		</tr>
<tr>
<td>निक्षेप प्लेटिनम</td>
			<td>3n ए</td>
			<td>10-15 मिनट</td>
		</tr>
<tr>
<td>मिलिंग ऑटोट्यून और ट्रैकिंग मार्क्स</td>
			<td>50-100 पीए</td>
			<td>4-6 मिनट</td>
		</tr>
<tr>
<td>निक्षेप कार्बन</td>
			<td>3 एन ए</td>
			<td>5-10 मिनट</td>
		</tr>
<tr>
<td>मिलिंग मोटे खाई</td>
			<td>15-30 एनए</td>
			<td>30-50 मिनट</td>
		</tr>
<tr>
<td>पॉलिश सतह</td>
			<td>1.5-3 एन.ए.</td>
			<td>15-20 मिनट</td>
		</tr>
<tr>
<td>इमेजिंग रन</td>
			<td>700 पीए-1.5 एनए</td>
			<td>घंटे-दिन</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2. नमूना तैयारी और इमेजिंग रन के लिए इस्तेमाल किया FIB मिलिंग धाराओं

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Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

सीरियल ब्लॉक चेहरे और केंद्रित आयन बीम स्कैन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग लक्षित अध्ययन

यहाँ, हम कुशलतापूर्वक सीरियल ब्लॉक चेहरे और ध्यान केंद्रित आयन बीम स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संयोजन के लिए ब्याज के एक क्षेत्र को लक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. यह तीन आयामों में कुशल खोज की अनुमति देता है, और दृश्य के एक बड़े क्षेत्र में दुर्लभ घटनाओं का पता लगाने.

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

किसी भी जीवन विज्ञान परियोजना है कि एक जटिल जैविक नमूने में ब्याज की एक विशिष्ट क्षेत्र के 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चर जांच की आवश्यकता है इस तकनीक का उपयोग कर सकते हैं । नमूना तैयारी प्रक्रिया दो इमेजिंग तौर-तरीकों के लिए एक ही है SBF/SEM और FIB-SEM जा रहा है । माइक्रोवेव का उपयोग नमूना प्रसंस्करण भाग को काफी गति देता है।हालांकि रूट टिप्स के लिए यहां दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूनतम समायोजन के साथ किसी भी जैविक मॉडल प्रणाली के लिए किया जा सकता है। SBF/SEM और FIB-SEM सहसंबद्ध करने के लिए इस कार्यप्रवाह का उपयोग करने से पहले, एक व्यक्तिगत प्रौद्योगिकियों से परिचित होना चाहिए । कुछ चरणों के निष्पादन आसानी से प्रदर्शन किया है, लेकिन लिखित पाठ में वर्णन करने के लिए मुश्किल है ।प्रक्रिया का प्रदर्शन पीटर बोर्गग्रेफ होगा जो हमारी प्रयोगशाला में तकनीशियन है। शुरू करने के लिए, आगर प्लेटों पर फिक्स्ड अरबीडोप्सिस थैलियाना रोपण के रूट टिप्स काटें और चार डिग्री सेल्सियस पर एक ही फिक्स्ड रातोंरात युक्त एपेंडोर्फ ट्यूबों में दो से तीन सुझाव डालें। सुबह, एक पिपेट के साथ, 100 आरपीएम पर घूर्णन टेबल पर ट्यूबों के साथ ट्यूबों में पीएच 6.8 पर 0.1 मोलर फॉस्फेट बफर के साथ फिक्सेटिव को बदलें और 10 मिनट के लिए धोएं।फिर ताजा फॉस्फेट बफर का उपयोग करके धोने को पांच बार दोहराएं। एक धूम हुड में, फास्फेट बफर को 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड और 0.2% रुथनियम रेड में 0.1 मोलर फॉस्फेट बफर में पीएच 6.8 में एक माइक्रोवेव में खुले ढक्कन के साथ ट्यूबों के साथ बदलकर रूट टिप्स को ठीक करें। फिर ट्यूबों में समाधान को त्यागें और रूट टिप्स को डबल डिस्टिल्ड पानी के साथ दो बार पांच मिनट के लिए धो लें।तीसरे और चौथे डबल आसुत पानी धोने के लिए, धोने की सहायता करने के लिए माइक्रोवेव का उपयोग करें । पहले 40 सेकंड डबल डिस्टिल्ड वॉटर वॉश के बाद रूट टिप सैंपल को माइक्रोवेव से बाहर निकालें और डबल डिस्टिल्ड वॉटर को फ्रेश डबल डिस्टिल्ड वॉटर से रिप्लेस करें। नमूनों को माइक्रोवेव में वापस रखें और कार्यक्रम जारी रखें।इसके बाद, 15 मिलीलीटर ट्यूब में 10 मिलीलीटर डबल आसुत पानी में 0.1 ग्राम थिओकार्बोहाइड्राजाइड जोड़कर टीसीएच समाधान तैयार करें। ट्यूब को ओवन में रखें और एक घंटे तक 60 डिग्री सेल्सियस पर हीट करें। फिर 0.22 माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके TCH समाधान को फ़िल्टर करें।तुरंत फ़िल्टर किए गए TCH समाधान के साथ नमूना ट्यूबों में समाधान को बदलें और प्रोटोकॉल जारी रखें। अब नमूनों को इथेनॉल में विसर्जित करें और उन्हें माइक्रोवेव में 50% 70% 90% और फिर 100% इथेनॉल उपचार के दो बार के वर्गीकृत चरणों में निर्जलित करने के लिए रखें। प्रोपलीन ऑक्साइड डिहाइड्रेशन उपचार के बाद, कम से कम दो घंटे के लिए रूट टिप्स की घुसपैठ शुरू करने के लिए ट्यूबों में 50% स्पर राल जोड़ें।100% स्पर राल में अंतिम इनक्यूबेशन के बाद, मोल्डों को एम्बेड करने में रूट टिप्स रखें और मोल्ड्स को ताजा 100% स्पर राल के साथ भरें और 36 से 48 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बहुलक हों। सबसे पहले, एक रेज़र ब्लेड का उपयोग मोटे तौर पर एक पतली ब्लॉक में बहुलक नमूना ट्रिम करने के लिए । पक्ष के साथ नीचे का सामना करना पड़ ऊतक उजागर होने के साथ, प्रवाहकीय epoxy राल के साथ एक धातु पिन के केंद्र के लिए नमूना संलग्न करने के लिए धातु पिन को छूने ऊतक है ।रात भर एपॉक्सी का इलाज करने के लिए नमूने को 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें। सुबह में, वाहक में धातु पिन लोड करें और नमूने से किसी भी अतिरिक्त एपॉक्सी को हटाने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। नमूने के चेहरे को और अधिक चिकना करने के लिए, वाहक को अल्ट्रामाइक्रोटोम के लिए धारक में धातु पिन के साथ लोड करें।अल्ट्रामाइक्रोटोम में, पिरामिड बनाने वाले ब्लॉक के किनारों के चेहरे को चिकना करने के लिए ग्लास या डायमंड नाइफ का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कम से कम कुछ ऊतक पहले से ही ब्लॉक चेहरे पर उजागर होते हैं। फिर छंटनी किए गए नमूना ब्लॉक को स्पटर कोटर में रखें और एक पतली परत के साथ नमूने को कोट करने के लिए दो से पांच नैनोमीटर पर प्लेटिनम के लिए सेटिंग्स को समायोजित करें।एसबीएफ-एसईएम माइक्रोस्कोप में वाहक डालें। नमूना सतह के करीब हीरे चाकू लाओ और नमूना के ऊपरी हिस्से से ट्रिम करने के लिए प्लेटिनम परत को हटाने और ऊतक के हिस्से का पर्दाफाश । फिर तेज वोल्टेज को डेढ़ से दो किलोवोल्ट में सेट करें।ऊतक की एक छवि पर कब्जा और एक इमेजिंग रन स्थापित करें। फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, फ़ाइल, आयात, छवि अनुक्रम का चयन करें और छवियों को लोड करने के लिए छवि स्टैक का पता लगाएं। पांडुलिपि के अनुसार छवि को समायोजित करने के बाद, डेटा सेट के माध्यम से स्क्रॉल करके संरेखण की जांच करें।3D TIFF फ़ाइल के रूप में गठबंधन डेटा सेट को सहेजने के लिए फ़ाइल मेनू के तहत सेव कमांड का उपयोग करें। यह देखने के लिए सेट किए गए डेटा का सावधानीपूर्वक विश्लेषण करें कि क्या आरओआई शामिल है और इसमें जैविक प्रश्न के लिए आवश्यक जानकारी शामिल है। स्टैक की अंतिम छवि पर, जो एसबीएफ-सेम माइक्रोस्कोप में वर्तमान ब्लॉक चेहरा है, एफआई-एसईएम के लिए एक नए आरओआई का चयन करें।प्लैटिनम के साथ फिर से कोटिंग करने के बाद, नमूना को एफआईबी-एसईएम में लोड करें और ब्लॉक चेहरे पर एसबीएफ-एसईएम में पहचाने गए आरओआई का पता लगाने के लिए 15 किलोवोल्ट और एक नैनोम्प पर माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करें। FIB बीम और गैस इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग करते हुए, एफआईबी और एसईएम बीम के संयोग बिंदु में नमूने पर आरओआई लाने के लिए चरण को स्थानांतरित करें और झुकाएं। आरओआई के ऊपर सतह पर प्लेटिनम की एक माइक्रोमीटर सुरक्षात्मक परत जमा करें।इसके बाद, इमेजिंग रन के दौरान 50 से 100 पिकोम्स, मिल फाइन लाइन्स को ऑटोफोकसिंग के लिए प्लेटिनम जमाव में मिल करते हैं। फिर 30 नैनोम्प्स की एक उच्च मिलिंग वर्तमान का उपयोग कर, एसईएम बीम के लिए इमेजिंग सतह बनाने आरओआई के सामने 30 माइक्रोमीटर की खाई मिल । छवि की सतह को चौरसाई करने के बाद, इमेजिंग रन शुरू करें और पहले 50 से 100 वर्गों के दौरान प्रक्रिया की स्थिरता की निगरानी करें।एक बार सिस्टम सुचारू रूप से चलने के बाद, कमरे को छोड़ दें और सुनिश्चित करें कि कमरे में जितना संभव हो उतना कम अशांति है। एसबीएफ-एसईएम की छवियां कोशिकाओं और इंट्रासेलर कनेक्शन के स्थानिक अभिविन्यास में अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले ऊतकों का अवलोकन प्रदान करती हैं। एक नए क्षेत्र पर बाद में FIB-SEM इमेजिंग विशिष्ट कोशिकाओं और संरचनाओं के उच्च संकल्प विस्तार कहते हैं ।एसबीएफ-एसईएम डेटा आइसोट्रोपिक वोक्सल एफआईएसएल-एसईएम डेटा से गैर-आइसोट्रोपिक वोक्सल के विभिन्न प्रतिपादन दिखाता है। एसबीएफ-एसईएम सतह पर एक सीढ़ी प्रभाव प्रस्तुत करता है जबकि पांच नैनोमीटर वर्गों वाले एफआईएफबी-एसईएम डेटा यह सुनिश्चित करता है कि प्रतिपादन बहुत चिकनी दिखाई देता है और व्यक्तिगत वर्ग पूरी तरह से सतह में मिश्रण करते हैं। यह प्रोटोकॉल एक ही नमूने में एक अद्वितीय क्षेत्र की इमेजिंग का वर्णन करता है और कार्यप्रवाह से किसी भी विचलन से नमूना को नुकसान हो सकता है जिससे ब्याज के क्षेत्र को स्थानांतरित करना असंभव हो जाता है।

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स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वॉल्यूम जानकारी के लक्षित अधिग्रहण के लिए सरणी टोमोग्राफी वर्कफ़्लो

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

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