Name: targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy
Uploaded: 2019-08-10T14:00:00
Duration: 9 min 9 s
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ボリュームEMのための機器は、フランダース政府からの寛大な助成金によって提供されました。

<ol>
	<li>Linberg, K. A., Fisher, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+study+of+interplexiform+cell+synapses+in+the+human+retina.">An ultrastructural study of interplexiform cell synapses in the human retina.</a> Journal of Comparative Neurology. 243, 561-576 (1986).</li><li>Peddie, C. J., Collinson, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+third+dimension:+volume+electron+microscopy+comes+of+age.">Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age.</a> Micron. 61, 9-19 (2014).</li><li>Leighton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEM+images+of+block+faces,+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+&#8211;+A+technical+note.">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM &#8211; A technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. (pt 2), 71-76 (1981).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three+dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 11, 329 (2004).</li><li>Heymann, J. A., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+specific+3D+imaging+of+cells+and+tissues+with+a+dual+beam+microscope.">Site specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope.</a> Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2006).</li><li>. NCMIR Methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. V7_01_10 Available from: <a target="_blank" href="https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2019)</li><li>Giberson, R. T., Austin, R. L., Charlesworth, J., Adamson, G., Herrera, G. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy.">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li><li>Sommer, C., Str&#228;hle, C., K&#246;the, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ilastik:+Interactive+Learning+and+Segmentation+Toolkit.">ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit.</a> Eighth IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI). Proceedings. , 230-233 (2011).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), e1002340 (2016).</li></ol>

著者は何も開示していない。

体積電子顕微鏡は、従来のSEMやTEMよりも困難で時間がかかります。組織または細胞をブロックに染色する必要があるため、処理ステップは、試料が試料全体に浸透するのを確実にするのに十分な長さでなければなりません。マイクロ波エネルギーを使用して浸透を容易にすると、より短く、より効率的な処理ができ、染色が改善されます。EMの調製は光顕微鏡検査よりもはるかに厳しいので、すべての溶液と試薬は品質を厳密に制御する必要があります。pHの変化、トニシティ、不純な試薬の使用、および不十分な技術による汚染物質の導入は、すべて最終的な画像に有害な影響を及ぼす可能性があります。
ボリュームEMはまた、異なるサンプルタイプごとに個別に調整されたプロトコルを必要とします。異なるタイプの哺乳類組織:植物、酵母などの単一細胞、トリパノソーム、C.エレガンスなど、すべてが最適な結果を達成するために独自のバリエーションを必要とします。固定と染色は、構造的完全性を維持し、サンプルを可能な限り生体内形態に近づけるように設計する必要があります。生理的温度、pHおよびトニシティでの組織の固定は、サンプルを可能な限り実物そっくりにするために重要です。サンプルの高圧凍結(HPF)は、より生命的な状況を維持するのに役立つかもしれませんが(またはおそらく異なるアーティファクトを生み出すだけかもしれません)、細胞や非常に薄い組織以外のHPFは、静脈氷が少量でしか生成できないため失敗します。したがって、多くの質問のために化学的固定が唯一の選択肢です。固定がHPFまたは化学的であるかどうかにかかわらず、EM実験では、構造結果を生細胞または組織イメージングの同様の結果と慎重に比較して、それらが一貫しているかどうかを確認する必要があります。また、回答が必要な特定の質問と、デジタル画像の視覚化に使用されるプロトコルを考慮しながら、染色を最適化する必要があります。
SBF-SEMとFIBシステムの両方を近接して持つことは、多くの実験で大きな利点です。SBF-SEMの大きな視野と高いX、Y分解能は、個々の構造/細胞/イベントを簡単に見つけ出し、組織内の細胞の全体的な空間的な向きを提供します。さらに、Zのサンプルを通してイメージ投射を可能にする能力は非常に強力である;ただし、細かい幾何学的ディテールを必要とする再構成は、生成される非等方性ボクセルのために、この手法を使用して失敗したり、アーティファクトを生成したりする可能性があります。FIBは、プロセスの物理学によってより小さいイメージング分野に制限されますが、その3D解像度は非常に正確な再構成のために十分です。サンプルは、さらなる処理や調製なしでSBF-SEMからFIBに移動できるため、2つの技術を組み合わせることは簡単です。我々は、特定の領域を見つけるためにサンプルを検索するためにSBF-SEMを使用することは、はるかに有能なツールの非常に高価な使用であることを認めます。ただし、新しいブロックフェースをすぐに確認し、ROI に到達したかどうかを判断する機能は大きな利点です。さらに、シリアル半薄(0.5 μm)LMセクションを使用する代替案は、検出される前に小さな構造物を除去し、切断し、グリッド上に置き、同等に高価なTEMで見なければならない単一のTEMセクションを使用してブロックを検査する場合があります。提示された方法として効率的です。
データをセグメント化してレンダリングするプログラムが多数存在し、特定の構造体のニーズが単一のアプリケーションでは最適でない場合があるため、標準ワークフローを提案することはできません。一部の単純な構造体は、非常に狭い灰色のスケール値内に収まる場合、しきい値アルゴリズムでセグメント化できます。神経構造は、Ilastik11などのプログラムを使用して半自動セグメント化できますが、ERなどのよりランダムな形の小器官にはあまり役に立ちません。顕微鏡画像ブラウザは、ボリュームEMデータを整列、セグメント化、およびレンダリングできる非常に柔軟なプログラムですが、ユーザーとの重要な操作が必要です12.原則として、結果をデジタルで視覚化するのに必要な時間は、サンプルとイメージングの準備時間を大幅に超えます。
体積EM技術は、超構造解析に第3次元を開いた。3D EMを得る他の方法は、その体積(TEM断層撮影)、またはその効率(シリアルセクションTEM)に制限があります。ほとんどの部分体積EM技術は複雑でコストがかかりすぎて個々のラボで実装できませんが、それらを提供する共有コア設備の数は増加しており、正常に画像化されたサンプルタイプの数は急速に増加しています。特定の質問と特定の組織を持つ人のために、誰かがその準備とイメージングに関するアドバイスや指示を提供することができる可能性が高いです。ボリュームEM装置は、SBF-SEMでより大きなサンプルを処理する能力とFIBでより大きなROIを粉砕する能力を含むように改善することができます。より自動化された方法で関心のある構造をセグメント化できるソフトウェアは、データを分析するプロセスを大幅に簡素化し、計算速度を向上させるため、必要な時間を短縮できます。現在の制限にもかかわらず、ボリュームEMはまだ有用なツールであり、SBF-SEMとFIB-SEMを組み合わせることで、まれなイベントを識別し、高解像度でイメージングするための効率的なワークフローを提供します。

このプロトコルは、目的の特定の領域(ROI)に対する高解像度の3次元電子顕微鏡(EM)の効率的なターゲティングのためのワークフローを記述する。1930年代に始まって以来、EMは本質的に2次元の技術でした。最初に公開された画像は、組織全体または細胞であったが、それはすぐに超微小トームを使用して手で切断され、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して画像化されたセクションに道を譲った。TEMは、細胞構造の最小でも明確に識別可能な非常に高解像度の顕微鏡写真を生成します。しかし、組織が電子ビームによって画像化されるのに必要な断面の薄さは、Z次元の情報を最小限に抑えた。細胞は三次元構造であるため、細胞構造と細胞表面との相互作用は限られたデータから推測されなければならなかった。これは、特に複雑な構造において、誤解の可能性を高めました。一部の顕微鏡学者は、細胞や組織を連続断面化することによって、より正確な3D構造を得て、個々のTEM画像1からそれらを苦労して再構築することができました。これは非常に手間のかかるプロセスであり、デジタルイメージングとコンピュータレンダリングの出現前には、結果を視覚化することも困難でした。近年、より多くの実験室でEMを3次元で利用できるようになった体積電子顕微鏡(体積EM)2として総称されるようになった2つの技術が導入されている。
電子顕微鏡内の埋め込みブロックから画像のスタックを取得するという考えは、スティーブ・レイトンとアラン・クジリアンがミニチュアマイクロトームを構築し、走査型電子顕微鏡3(SBF-SEM)のチャンバーに置いた1981年までさかのぼることができます。.このプロトタイプは最終的にデンクとホルストマン4によって23年後にコピーされ、改良され、その後製品化されました。ほぼ同時に、生物科学者は、主に材料科学、焦点を合わせたイオンビームで使用される別の技術に気づきました。この技術は、何らかの種類のイオンビーム(ガリウム、プラズマ)を使用して、サンプル(FIB-SEM)5から非常に少量の表面材料を除去する。どちらの手法も、X、Y、Z、スタックに組み合わせることができる一連の画像を提供するイメージングに続いて断面を採用しています。どちらの手法も、3D 情報を提供しますが、解像度のスケールが異なります。SBF-SEMは、長いシリアルイメージング実行のために50 nm以下の薄さのスライスにダイヤモンドナイフの物理的特性によって制限されます。しかし、断面できるサンプルブロックサイズは、最大1mm x 1 mm x 1 mm. ブロック面から信号を受信する背面散乱電子検出器(32k x 32kピクセル)の大きなデジタル集録フォーマットのため、イメージ ピクセル サイズは 1 nm と小さくすることができます。この結果、X,Y 次元がZより小さくなる非等方性ボクセルが発生します。イオンビームの精度のために、FIB-SEMは等方性ボクセル≤5 nmで画像を収集する能力を有する。ただし、画像化できる総面積は非常に小さいです。2 つの手法でイメージ化されたさまざまなサンプルとボリュームの概要表が以前に 3.
体積EMの組織調製は、サンプルをSEMで適切なシグナル生成を提供するために染色する必要があるため、標準的なTEMまたはSEMよりも困難です。識別と再構成を容易にするために、特定の細胞構造とは対照的です。ここで使用されるプロトコルは NCMIR 標準6に基づいています。追加の染色は、通常、追加のプロトコルステップを意味します。したがって、体積EMの場合、試薬が試料に浸透するのに十分な時間を確保するために、標準プロトコルを拡張する必要があります。マイクロ波支援処理は、数時間から数分までの染色に必要な時間を短縮し、ボリュームEMサンプル調製をより効率的に7.この方法は、すべての細胞および組織タイプ8に適用可能であり、組織の不均一性が特定の領域のサンプリングを不可欠なものにする問題を研究する9.
データ スタックを取得したら、データ スタックを整列し、残りのデータからセグメント化し、3D でモデル化します。組織の多くのスライスをイメージングの自動化は、画像の取得を比較的簡単にしましたが、データをデジタル的に再構築および視覚化するプロセスは時間のかかる作業です。この目的のためのソフトウェアはまだ統合されていないか、完全に自動化されていません。ボリュームEMを用した初期の研究の多くは神経科学に向けられたため、軸ゾンなどの構造を染色し、デジタルセグメント化する技術は、他の細胞や小器官に比べてかなり進歩しています。他の非神経組織の文献が急速に成長している間、非線形または不規則な構造はより多くの手動入力を必要とする。
SBF-SEMとFIB-SEMの両方を使用することは、3Dで高解像度で特定の、非均質な組織構造を標的化およびイメージングするための有用なアプローチです。マイクロ波アシストティッシュ処理と組み合わせることで、サンプル調製に必要な時間を大幅に短縮できます。このワークフローを組み合わせることで、微細構造の高解像度等方性ボクセル画像データセットを効率的かつ迅速なプロセスにします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3View 2XP</td>
			<td>Gatan</td>
			<td>NA</td>
			<td>In chamber ultramicrotome for SBFI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer 0.2M solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive epoxy resin (circuit works)</td>
			<td>RS components</td>
			<td>496-265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diatome Histo 4.0mm diamond knife</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>40-HIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizing tablet</td>
			<td>Wacom</td>
			<td>DTV-1200W</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat Embedding Mold</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluteraldehyde 25% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High MW Weight Tannic Acid</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead Citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>19170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco Biowave Pro +</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>36700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum Q150T ES sputter coater</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>27645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reichert-Jung Ultracut ultramicrotome</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>No longer available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate 0.2M</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>11653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spurrs Resin kit</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>14300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>EM Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy

このプロトコルは電子顕微鏡の決断レベルの3次元の細胞か組織のサンプルの有効で、有効なイメージ投射を可能にする。長年にわたり、電子顕微鏡(EM)は本質的に2次元技術のままです。シリアル走査型電子顕微鏡イメージング技術(体積EM)の出現により、統合されたマイクロトームまたは集積イオンビームを使用してスライスし、埋め込み組織を表示することで、第3次元が容易にアクセスできるようになります。シリアルブロック顔走査型電子顕微鏡(SBF-SEM)は、SEMチャンバに封入された超微小トームを使用しています。それは大きい標本(1,000 μm x 1,000 μm)および小さいX、Yピクセルサイズのイメージ大きい視野を扱う機能を有するが、ダイヤモンドナイフによってZ次元で限られている。集値イオンビームSEM(FIB-SEM)は、3D分解能に限定されないが、(≤5nmの等方性ボクセルは達成可能である)が、視野ははるかに限定される。このプロトコルは、2 つの手法を組み合わせて、大きなフィールドで対象領域 (ROI) を見つけ、その後のターゲットボリュームを高等方性ボクセル解像度でイメージングするためのワークフローを示します。固定細胞または組織の準備は、SEMイメージングにおける効率的な信号生成に必要な余分なコントラストのために、体積EM技術に対してより厳しい。このようなプロトコルは、時間がかかり、労働集約的です。このプロトコルはまた試薬の浸透を促進するマイクロ波支援ティッシュ処理を組み込み、処理プロトコルに必要な時間を数日から数時間に減らす。

SBF-SEMからの画像は、組織の概要を提供し、細胞および細胞間接続の空間的な向きに関する洞察を与える(図4A)。その後の新しい領域でのFIB-SEMイメージングは、通常、SBF-SEM実行の検査後に決定される関心領域であり、特定の細胞および/または構造の高解像度の詳細を追加する(図4B)。
図 4C,Dは、SBF-SEMデータ(図4C)と同方性ボクセルFIB-SEMデータ(図4D)の非同方性ボクセルのレンダリングの違いを示す。SBF-SEM で使用される z の厚さは、レンダリングがセクションを明確に示し、サーフェスに「階段」効果をもたらすことを意味します。FIB-SEM データでは、5 nm セクションを使用すると、レンダリングがはるかに滑らかに見え、個々のセクションがサーフェスに完全にブレンドされます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig1.jpg"> 図1:樹脂埋め込みサンプルからのブロック面の作成。(A) 樹脂に埋め込まれた根元。(B) カミソリブレードを使用して、余分な樹脂は0.5mm2のブロックが残るまでトリミングされます。(C, D)トリミングされたブロックは金属ピンに接着され、オーブンで夜を過ごした後、ブロックの側面がトリミングされ、表面は超マイクロトームを使用してダイヤモンドナイフで滑らかにされます。(E) SBF-SEM内では、ブロックフェースとROIが認識できるようにサンプルの向きが広がり、スケールバー= 20 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig2.jpg"> 図2:SBF-SEMとFIB-SEMの相関SBF-SEM (A) および FIB-SEM (B) を使用したブロック面の概要イメージ、 スケール バー = 5 μm (C,D) ROI のズーム。赤いボックスは、FIB-SEM でイメージされる領域を描き、スケール バー = 5 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig3.jpg"> 図 3: FIB-SEM スキームと準備手順(A) FIBビーム、SEMビーム、サンプルの向きを示すスキーム。サンプルを FIB ビームと SEM ビームの偶然の一致ポイントに配置して、同じ領域でミルアンドイメージを作成する必要があります。(B) FIBによって除去されたセクションのSEMイメージングに必要なトレンチの概略図。(C) ROI上のプラチナ堆積を示すFIBビームで撮影した画像、スケールバー5 μm(D)自動焦点と3Dトラッキングに使用される線を示すFIBビームで撮影した画像。中央の線はオートフォーカスに使用され、外側の線は 3D トラッキングを提供します。ラインの上のカーボン堆積は、これらのタスクを実行するために必要なコントラスト(プラチナ対カーボン)を提供し、スケールバー5μm.(E)トレンチの粉砕後にFIBビームで撮影された画像、スケールバー5μm(F)を示すSEMビームで撮影した画像FIB-SEMの実行中に画像化された対象領域、スケールバー2 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59480/59480fig4.jpg"> 図 4: セグメンテーションの前後に SBF-SEM および FIB-SEM の結果が出ます。(A) SBF-SEM データセットの 3D ビュー (100 x 100 x 40 μm、スケール バー = 10 μm)、(B) FIB-SEM データセットの 3D ビュー (17 x 10 x 5.4 μm、スケール バー = 2 μm) (C) SBF-SEM データからレンダリングされたバキュールを SBF-SEM データからレンダリングした mしきい値によってFIB-SEMデータからインメント、スケールバー = 2 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59480/59480fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="10">マイクロ波処理のためのプロトコル</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">プログラム#</td>
			<td rowspan="2">説明</td>
			<td rowspan="2">ユーザー プロンプト (オン/オフ)</td>
			<td rowspan="2">時間(時間:分秒)</td>
			<td rowspan="2">電力(ワット)</td>
			<td rowspan="2">気温 (°C)</td>
			<td rowspan="2">ロードクーラー(オフ/オート/オン)</td>
			<td rowspan="2">真空/バブラーポンプ(オフ/バブ/vacサイクル/vacオン/vap)</td>
			<td>定常温度</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ポンプ(オン/オフ)</td>
			<td>気温 (°C)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">8</td>
			<td rowspan="3">TCH</td>
			<td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">9</td>
			<td rowspan="5">オスミウム</td>
			<td>オフ</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:02:00</td>
			<td>100</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">10</td>
			<td>50% エトウ</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>オフ</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>70% エトウ</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>オフ</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>90% エトウ</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>オフ</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% エトウ</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>オフ</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>100% エトウ</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>オフ</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>0.1M カコジレート</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>0.1M カコジレート</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">15</td>
			<td>ddH2O</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>に</td>
			<td>0:00:40</td>
			<td>250</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td rowspan="7">16</td>
			<td rowspan="7">ウラネル・アセテート</td>
			<td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>オフ</td>
			<td>0:01:00</td>
			<td>150</td>
			<td>50</td>
			<td>オフ</td>
			<td>真空サイクル</td>
			<td>に</td>
			<td>30</td>
		</tr></tbody></table>表 1.マイクロ波処理のための詳細なプロトコル。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>現在の</td>
			<td>推定時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>蒸着プラチナ</td>
			<td>3n A</td>
			<td>10~15分</td>
		</tr>
<tr>
<td>フライス加工オートチューンとトラッキングマーク</td>
			<td>50-100 pA</td>
			<td>4~6分</td>
		</tr>
<tr>
<td>堆積カーボン</td>
			<td>3 nA</td>
			<td>5~10分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ミリング粗いトレンチ</td>
			<td>15-30 nA</td>
			<td>30~50分</td>
		</tr>
<tr>
<td>研磨面</td>
			<td>1.5-3 nA</td>
			<td>15~20分</td>
		</tr>
<tr>
<td>イメージング実行</td>
			<td>700 pA-1.5 nA</td>
			<td>営業時間日数</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.サンプル調製およびイメージング実行に使用されるFIBフライス電流

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Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

シリアルブロック面と集値イオンビームスキャン電子顕微鏡を用いた標的研究

ここでは、シリアルブロック面と集積イオンビーム走査電子顕微鏡を効率的に組み合わせて対象領域を標的とするプロトコルを紹介する。これにより、3 次元で効率的な検索を行い、大きな視野でまれなイベントを検索できます。

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

複雑な生物学的試料に関する特定の領域の3D超構造調査を必要とするライフサイエンスプロジェクトは、この技術を利用できます。サンプル調製手順は、SBF/SEMおよびFIB-SEMである2つのイメージングモダリティで同じです。マイクロ波の使用はサンプル処理部分を実質的にスピードアップする。根のヒントのためにここに示されているが、このプロトコルは、最小限の調整で任意の生物学的モデルシステムに使用することができます。SBF/SEM と FIB-SEM を関連付けるこのワークフローを使用する前に、個々のテクノロジに精通している必要があります。特定のステップの実行は簡単に示されますが、書かれたテキストで記述することは困難です。手順を実証するのは、私たちの研究室の技術者であるピーター・ボルググレイフです。まず、寒天プレートに固定シロイヌナズナの苗の根先をカットし、摂氏4度で一晩同じ固定剤を含むエペンドルフチューブに2〜3つの先端を置きます。午前中、ピペットで、固定液をチューブのpH 6.8の0.1モルリン酸緩衝液に交換し、100 RPMの回転テーブルのチューブで10分間洗浄します。次に、新鮮なリン酸緩衝液を用いて洗浄を5回繰り返す。ヒュームフードでは、リン酸バッファーを 2%オスミウムテトキシドと 0.1 モルリン酸バッファーの 0.2%ルテニウム赤で pH 6.8 の 0.2%ルテニウム赤に置き換えて、マイクロ波で蓋を開いたチューブで根先先端を後固定し、プログラムを開始します。その後、チューブ内の溶液を捨て、根の先端をそれぞれ5分間二重蒸留水で2回洗います。3番目と4番目の二重蒸留水洗浄の場合は、電子レンジを使用して洗浄を支援します。最初の40秒の二重蒸留水洗浄の後、電子レンジから根先の先端サンプルを取り出し、二重蒸留水を新鮮な二重蒸留水に置き換えます。サンプルをマイクロ波に戻し、プログラムを続行します。次に、15ミリリットルのチューブに10ミリリットルの二重蒸留水にチオカルボヒドラジドを0.1グラム加えてTCH溶液を調製する。チューブをオーブンに入れ、摂氏60度で1時間加熱して溶かします。その後、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してTCH溶液をフィルタリングします。サンプルチューブ内の溶液をフィルター処理されたTCH溶液に直ちに交換し、プロトコルを続行します。サンプルをエタノールに浸し、マイクロ波に入れて50%70%90%の段階的なステップで脱水し、100%エタノール処理の2倍にします。プロピレンオキシド脱水処理後、50%スパーの樹脂をチューブに加えて、最低2時間根先先端の浸潤を開始します。100%スパーの樹脂の最終インキュベーションの後、根の先端を埋め込み型に入れ、金型に新鮮な100%スパーの樹脂を充填し、オーブンで36〜48時間摂氏65度で重合します。まず、カミソリの刃を使用して、重合したサンプルを薄いブロックに大まかにトリミングします。露出した組織を下にした側に、導電性エポキシ樹脂で金属ピンの中央にサンプルを取り付け、組織を金属ピンに触れさせる。エポキシを一晩治すために、サンプルを摂氏65度のオーブンに入れます。午前中、金属ピンをキャリアに積み込み、カミソリの刃を使用してサンプルから余分なエポキシを取り除きます。サンプルの表面をさらに滑らかにするには、ウルトラミクロトーム用ホルダーに金属ピンを積み込みます。超ミクロトームでは、ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、ピラミッドを形成するブロックの側面を滑らかにします。少なくとも組織の一部が既にブロック面に露出していることを確認してください。次に、トリミングしたサンプルブロックをスパッタコーターに入れ、2〜5ナノメートルでプラチナに設定を調整し、薄い層でサンプルをコーティングします。SBF-SEM顕微鏡にキャリアを挿入します。ダイヤモンドナイフをサンプル表面に近づけ、サンプルの上部を切り取って白金層を取り除き、組織の一部を露出させます。次に、加速電圧を1.5~2キロボルトに設定します。組織の画像をキャプチャし、イメージング実行を設定します。フィジーのソフトウェアを使用して、ファイル、インポート、画像シーケンスを選択し、画像をロードするイメージスタックを見つけます。原稿に応じて画像を調整した後、データセットをスクロールして配置を確認します。ファイル メニューの下の保存コマンドを使用して、整列したデータ セットを 3D TIFF ファイルとして保存します。データ・セットを慎重に分析して、ROI が含まれているか、また生物学的な質問に必要な情報が含まれているかどうかを確認します。SBF-SEM顕微鏡の現在のブロック面であるスタックの最後の画像で、FIB-SEMの新しいROIを選択します。再度白金でコーティングした後、サンプルをFIB-SEMにロードし、2次電子検出器を15キロボルトと1ナノアンプで使用して、ブロック面上のSBF-SEMで識別されたROIを見つけます。ステージを移動して傾け、FIBビームとガス射出システムを使用して、サンプルのROIをFIBビームとSEMビームの偶然のポイントに持ち込みます。1マイクロメートルの保護層の白金をROIの上の表面に付着する。次に、50~100ピコアンプの範囲の低いミリング電流を用いて、白金堆積物に細線をミルして自動焦点を合わせ、イメージング走行中に3Dトラッキングを行う。次に、30ナノアンプの高いミリング電流を使用して、ROIの前に30マイクロメートルのトレンチを粉砕し、SEMビームのイメージング面を作成します。画像表面を平滑化した後、イメージングの実行を開始し、最初の50〜100セクションの間にプロセスの安定性を監視します。システムがスムーズに動作したら、部屋を出て、部屋の中にできるだけ少ない乱れがあることを確認してください。SBF-SEMからの画像は、細胞の空間的指向および細胞内接続に関する洞察を与える組織の概要を提供する。新しい領域での後続の FIB-SEM イメージングは、特定のセルおよび構造の高解像度の詳細を追加します。SBF-SEM データは、等方性ボクセル FIB-SEM データからの非等方性ボクセルの異なるレンダリングを示しています。SBF-SEMは、5ナノメートルのセクションを持つFIB-SEMデータがレンダリングがはるかに滑らかに表示され、個々のセクションが完全に表面に溶け込むようにしながら、表面に階段効果を提示します。このプロトコルは、1 つのサンプルで一意の領域のイメージングを記述し、ワークフローからの任意の偏差は、サンプルに損傷を与え、対象領域を再配置することが不可能になる可能性があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...