Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

Les auteurs remercient Tom Yohannan pour les conseils éditoriaux et M. Segura-Feliu pour l'assistance technique. Ces travaux ont été financés par le programme CERCA et par la Commission des universités et de la recherche du Département de l'innovation, des universités et de l'entreprise de la Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Ces travaux ont été financés par le Ministère espagnol de la recherche, de l'innovation et de l'université (MEICO) par l'intermédiaire de BFU2015-67777-R et RTI2018-099773-B-100, le Réseau Prion espagnol (Prionet Espagne AGL2017-90665-REDT), et l'Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Toutes les expériences animales ont été réalisées dans le cadre des lignes directrices et protocoles du Comité éthique pour l'expérimentation animale (CEEA) de l'Université de Barcelone, et le protocole pour l'utilisation des rongeurs dans cette étude a été examiné et approuvé par le CEEA de la l'Université de Barcelone (approbation de la CEEA #276/16 et 141/15).
1. Purification du collagène de queue de rat
<ol><li>Recueillir les queues de rat Sprague-Dawley adultes (8-9 sema...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+axon+guidance.">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring:+a+primer.">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).</li><li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules.">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li><li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li><li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients.">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li><li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+mechanisms:+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents.">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li><li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development.+The+decade+of+the+developing+brain.">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li><li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6.">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li><li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transmission+in+migrating+cells.">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Bornstein, M. 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R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrin+signaling+in+morphogenesis,+neural+development+and+plasticity.">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth.">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li><li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite-J:+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures.">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-hydroxyproline+(3Hyp)-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen.">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li><li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+(CD11c-CD18,+gp150-95).">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li><li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration.">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li><li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+gels+and+the+'Bornstein+legacy':+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration.">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li></ol>

La croissance des axones en développement est principalement invasive et comprend la dégradation et le remodelage de l'ECM. En utilisant la procédure présentée ici, les chercheurs peuvent obtenir une matrice 3D homogène formée par le collagène naturel de type I dans lequel les axones (ou cellules) peuvent répondre à un gradient chimique sécrété par des cellules génétiquement modifiées comme ils le font in vivo. Différentes réponses axonales aux gradients de repères attrayants ou inhibiteurs (protéines...

Les axones neuronaux, se terminant par des cônes de croissance axonale, migrent sur de longues distances à travers la matrice extracellulaire (ECM) de l'embryon sur des voies spécifiques pour atteindre leurs cibles appropriées. Le cône de croissance est la partie distale de l'axone et il est spécialisé pour détecter l'environnement physique et moléculaire de la cellule1,2. D'un point de vue moléculaire, les cônes de croissance sont guidés par au moins quatre mécanismes moléculaires différents : attraction de contact, chimioattraction, répulsion de contact, et chemorepulsion déclenchée par différents indices de guidage axonal3,4 , 5 Annonces , 6. Les processus négociés par contact peuvent être partiellement surveillés dans des cultures bidimensionnelles (2D) sur des substrats micro-modèles (p. ex., avec des rayures7,8 ou des taches9 contenant les molécules). Cependant, les axones peuvent naviguer vers leur cible d'une manière non-diffusive en sentant plusieurs molécules attrayantes et répulsives des cellules de guidage dans l'environnement4,5,10. Ici, nous décrivons une méthode facile de culture 3-D pour vérifier si une molécule sécrétée induit des effets chémorepulsifs ou chimioattractive sur le développement des axones.
Les premières études visaient à déterminer les effets des indices de guidage d'axone utilisés explant cultures dans des matrices tridimensionnelles (3-D) pour générer des gradients simulant des conditions in vivo11,12. Cette approche, ainsi que des expériences in vivo, a permis d'identifier quatre grandes familles de repères d'orientation: Netrins, Slits, Semaphorins, et Ephrins4,5,6. Ces indices moléculaires et d'autres facteurs13 sont intégrés par les axones en croissance, déclenchant la dynamique des complexes d'adhérence et transduisant les forces mécaniques via le cytosquelette14,15,16. Pour générer des gradients moléculaires dans les cultures 3D pour la navigation axonale, les chercheurs pionniers ont utilisé des substrats de caillots plasmatiques17, qui a également été utilisé pour les préparations de tranches organotypiques18. Cependant, en 1958, un nouveau protocole pour générer des hydrogels de collagène 3D a été rapporté pour l'étude avec les dispositifs de Maximow19, une plate-forme de culture, utilisée dans plusieurs études appropriées pour les observations microscopiques20. Une autre étude pionnière a rapporté le gel de collagène comme outil pour intégrer des fibroblastes humains pour étudier la différenciation des fibroblastes dans les myofibroblastes dans les processus de guérison des plaies21. En parallèle, Lumsden et Davies ont appliqué du collagène du derme bovin pour analyser l'effet putatif du facteur de croissance nerveuse (NGF) sur le guidage des fibres nerveuses sensorielles22. Avec le développement de nouvelles plateformes culturelles (p. ex., plaques multi-puits) par différentes entreprises et laboratoires, les cultures de collagène ont été adaptées à ces nouveaux dispositifs6,23,24,25 ,26. En parallèle, un extrait de matériel d'ECM dérivé de la lignée cellulaire de tumeur d'Engelbreth-Holm-Swarm a été rendu disponible commercialement pour étendre ces études27.
Récemment, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des gradients moléculaires avec des rôles putatifs dans le guidage des axones à l'aide d'hydrogels 3D (p. ex. collagène, fibrine, etc.) 28. Alternativement, la molécule candidate peut être immobilisée à une concentration différente dans une matrice poreuse (p. ex., NGF29) ou générée par la culture dans une petite région des agrégats de cellules hydrogel 3D sécrétant la molécule pour générer un rayonnement gradient4,23,24,25,26. La dernière possibilité sera expliquée dans ce protocole.
La procédure présentée ici est une méthode facile, rapide et hautement reproductible basée sur l'analyse de la croissance axonale dans les cultures d'hydrogel 3D du cerveau embryonnaire de souris. En comparaison avec d'autres méthodes, le protocole est bien adapté aux chercheurs non formés et peut être entièrement développé après une courte formation (1-2 semaines). Dans ce protocole, nous isolons d'abord le collagène des queues de rat adultes pour produire davantage de matrices 3D dans lesquelles les agrégats de cellules génétiquement modifiés sont cultivés devant le tissu neuronal embryonnaire. Ces agrégats cellulaires forment des gradients chimiques radiaux d'une molécule candidate qui provoque une réponse pour les axones en croissance. Enfin, l'évaluation des effets de la molécule sur les axones en croissance peut facilement être effectuée à l'aide d'une microscopie de contraste de phase ou, alternativement, de méthodes immunocytochimiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

Ce protocole utilise du collagène naturel de type I pour générer de l'hydrogel tridimensionnel (3-D) pour la surveillance et l'analyse de la croissance axonale. Le protocole est centré sur la culture de petits morceaux de cerveaux embryonnaires ou postnatals de rongeurs à l'intérieur d'un hydrogel 3D formé par le collagène de type I dérivé du tendon de queue de rat avec la porosité spécifique. Les morceaux de tissu sont cultivés à l'intérieur de l'hydrogel et confrontés à des fragments de cerveau spécifiques ou des agrégats de cellules génétiquement modifiés pour produire et sécrére des molécules appropriées pour créer un gradient à l'intérieur de la matrice poreuse. Les étapes de ce protocole sont simples et reproductibles, mais comprennent des étapes critiques à examiner attentivement au cours de son développement. En outre, le comportement des axones croissants peut être surveillé et analysé directement à l'aide d'un microscope de contraste de phase ou d'un microscope à fluorescence mono/multiphoton après fixation par des méthodes immunocytochimiques.

Ici, nous présentons une méthodologie largement accessible pour étudier la croissance axonale dans les cultures 3-D de collagène d'hydrogel du système nerveux embryonnaire de souris. À cette fin, nous avons isolé le collagène des queues de rat adultes pour produire des matrices 3D dans lesquelles nous avons cultivé des agrégats de cellules génétiquement modifiés exprimant Netrin-1 ou Sema3E confrontés au tissu neuronal embryonnaire (par exemple, région CA de l'hippocampe). Ces agrégats cellulaires ont for...

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Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Ici, nous fournissons une méthode pour analyser le comportement des axones en croissance dans les matrices 3D, imitant leur développement naturel.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Cette méthode est utile pour analyser le rôle de certaines molécules dans la guidage axonal et la migration neuronale pendant le développement du système neuro. Le principal avantage de cette technique est que l’analyse des résultats est rapide et simple et ne nécessite pas de logiciels complexes qui impliqueraient beaucoup de formation pour les chercheurs. Mirian Segura-Feliu, technicien de notre laboratoire et moi-même, démontrerons la procédure.Pour commencer la plaque 200.000 cellules COS-1 dans des boîtes de Petri de 35 millimètres et incuber avec un milieu de culture complète dans un incubateur de culture cellulaire afin de lire 70 à 80% de confluence pendant la nuit. Le lendemain, pour transfecter les cellules COS-1 avec l’ADN codant la molécule candidate à l’aide de la méthode de transfection à base de liposome. Mélanger d’abord 250 microlitres de milieu sans sérum et un à 2 microgrammes d’ADN dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Pour préparer un tube liposomal, ajouter 240 microlitres du milieu sans sérum et 10 microlitres de réagent transfection liposomique, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajouter le contenu du tube d’ADN au tube lipsomal. Mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.Remplacer le milieu sur les cellules de culture par 1,5 millilitres du milieu sans sérum. Ajouter le mélange de liposomes d’ADN lentement et laisser tomber sage aux cellules. Incuber dans l’incubateur de culture de cellules de dioxyde de carbone pendant trois heures.Après l’incubation terminée, remplacer le milieu par le milieu de culture complet et incuber pendant la nuit dans l’incubateur. Le lendemain, rincer les cellules avec 0,1 molaire PBS Dulbecco. Ajouter 800 microlitres trypsine EDTA par plat et incuber pendant cinq à 15 minutes dans l’incubateur de dioxyde de carbone.Recueillir les cellules détachées avec deux millilitres de milieu de culture complet dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajouter 10 millilitres du même milieu. Centrifuger les cellules à quatre degrés Celsius à 130 fois g pendant cinq minutes. Retirer le surnatant et conserver la pastille contenant des cellules COS-1 sur la glace.Après avoir préparé le mélange de travail de collagène, ajouter 100 à 150 microlitres du mélange de collagène à la pastille des cellules transfected et mélanger doucement en pipetting de haut en bas. Étendre 45 à 50 microlitres de mélange de granulés de cellules de collagène sur une boîte de Pétri de 35 millimètres pour former une bande uniforme de cellules de collagène, d’environ un à 1,5 centimètre de long. Placez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la gelation soit observée.Préparer une deuxième bande contenant des cellules de contrôle dans un deuxième plat de culture et le placer dans l’incubateur. Lorsque la gelation est terminée, ajouter de trois à quatre millilitres de 37 degrés Celsius réchauffé COS-1 milieu de culture complète à chaque plat contenant les bandes de cellules de collagène gélisé et les placer dans l’incubateur. Utilisez un scalpel fin ou un hachoir de tissu pour couper les bandes de cellules de collagène pour générer de petits morceaux carrés, de 400 à 500 micromètres de longueur.Transférez toutes les sections de la même condition de transfection à une boîte de Pétri contenant de trois à 3,5 millilitres de médias de culture neuronale. Vérifiez au microscope disséquant la qualité des pièces et placez la vaisselle dans l’incubateur. Utilisez des ciseaux pour couper les cornes embryonnaires le jour embryonnaire 16.5 de la cavité abdominale d’un rat femelle enceinte sacrifié et placez-les dans une grande boîte de Pétri contenant le tampon froid de HBSSg.Placez le plat dans le capot d’écoulement laminaire et utilisez des forceps droits pour extraire les embryons et les placer dans un nouveau plat contenant du HBBSg froid. Avec de petits forceps, enlever la peau, puis avec des forceps incurvés et droits, disséquer soigneusement le cerveau et placer dans un plat contenant du HBSSg froid. Sous un microscope disséquant, à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux fins, couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane pour séparer les deux hémisphères.Ensuite, retirez le diencéphalon et avec des forceps fins, retirez les méninges et les vaisseaux sanguins des morceaux du cerveau. Utilisez 100% d’éthanol pour nettoyer toutes les parties de l’hélico tissulaire, en particulier la plaque de coupe PTFE et la lame de rasoir et garder l’hachoir de tissu dans le capot de flux laminaire sous l’éclairage UV pendant 15 minutes. Transférer chaque morceau de tissu dans la plaque de coupe de l’hélico tissulaire.Après que le tissu a été haché, transférez les morceaux des plats petri de 35 millimètres remplis de trois à quatre millilitres de MR complet. À l’aide d’aiguilles de tungstène fines, terminer la dissection tissulaire dans le MR complet. Vérifiez la qualité des tranches obtenues au microscope à disséquer, en vous assurant que les couches sont clairement identifiables dans l’optique du champ sombre et disséquent la région d’intérêt avec des aiguilles de tungstène.Gardez les pièces de bonne qualité dans le milieu NCM complet dans l’incubateur de dioxyde de carbone. La démonstration visuelle est essentielle dans les étapes liées à la préparation des co-cultures qui facilitent les mots pour comprendre le processus. Placez plusieurs plaques stériles de culture de quatre puits dans le capot d’écoulement laminaire et préparez un mélange de travail de collagène comme précédemment.Ajouter 15 à 20 microlitres du mélange d’hydrogel dans le fond de chaque puits pour produire une base circulaire de collagène. Placer les plats dans l’incubateur jusqu’à ce qu’une gelation complète soit observée. Et vérifiez la qualité du collagène gélisé.À l’intérieur d’une pipette, transférer un petit morceau d’agrégat de cellules COS-1 sur la base hydrogel, puis utiliser une pipette pour placer un morceau de tissu sur la même base, près du morceau de cellules agrégées à une distance d’une taille d’explant. Après avoir préparé un nouveau mélange de collagène de travail sur la glace, pipette doucement 15 à 20 microlitres de ce nouveau mélange pour couvrir l’explant et l’agrégat cellulaire, faisant un sandwich comme la culture hydrogel. Utilisez une fine aiguille de tungstène pour réorienter l’explantation afin qu’elle soit confrontée à l’agrégat cellulaire à 500 à 600 micromètres.Retourner la plaque à l’incubateur jusqu’à ce que la gelation soit observée, puis ajouter 0,5 millilitres de MR complet complété par 2%B27 supplément et garder les cultures pendant 36 à 48 heures dans l’incubateur. Quand les axones hippocampal ont été confrontés à Netrin-1, ils se sont développés préférentiellement vers la source de Netrin-1, indiquant que Netrin-1 agit comme molécule attrayante de chimio pour ces axones. Dans l’état de contrôle, ou transfection simulée, tous les axones ont grandi radialement, sans aucune préférence directionnelle.Quand les axones hippocampal ont été confrontés aux cellules sécrétantes de Sema3E, la plupart d’entre eux ont grandi en face de l’agrégat cellulaire, indiquant que Sema3E agit comme une molécule chimio répulsive pour ces axones. Cette représentation schématique de la réponse axonale et de la méthode de quantification montre que dans des conditions de contrôle, les axones ont été également distribués dans les quadrants proximaux et distal, montrés avec la croissance radiale. Ceci a indiqué un rapport proximal de distal ou de d’un.Quand les explants ont montré le nombre accru d’axones dans le quadrant proximal par rapport au distal, indiquant l’attraction de chimio, le rapport de était plus grand qu’un. Lorsque le nombre d’axones était plus élevé dans le quadrant distal que dans le quadrant proximal, ce qui indique une répulsion chimio, le rapport était inférieur à un. Suivant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir des informations essentielles sur le rôle de certaines molécules lors du développement neuronal, ce qui nous permet d’établir un point de départ pour explorer davantage les fonctions.Bien que cette technique soit utile dans le développement neuronal tel qu’il est, elle pourrait également être appliquée dans le criblage pharmacologique, l’angiogenèse, et l’ingénierie tissulaire comme stratégies.

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