Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

Die Autoren danken Tom Yohannan für die redaktionelle Beratung und M. Segura-Feliu für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das CERCA-Programm und die Kommission für Universitäten und Forschung der Abteilung innovation, Universitäten und Unternehmen der Generalitat de Catalunya (SGR2017-648) finanziert. Diese Arbeit wurde vom spanischen Ministerium für Forschung, Innovation und Universität (MEICO) über BFU2015-67777-R und RTI2018-099773-B-100, das spanische Prion-Netzwerk (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT) und das Institut Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien und Protokollen des Ethikausschusses für Tierversuche (CEEA) der Universität Barcelona durchgeführt, und das Protokoll für die Verwendung von Nagetieren in dieser Studie wurde von der CEEA der Universität Barcelona (CEEA-Zulassung #276/16 und 141/15).
1. Reinigung von Rattenschwanz kollagen
<ol><li>Sammeln Sie erwachsene Sprague-Dawley Rattenschwänze (8-9 Wochen alt), nachdem sie das Tier nach ethischen Richtlinien geopfert und in 95% Ethan...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. 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Das Wachstum der Entwicklung von Axonen ist hauptsächlich invasiv und umfasst ECM-Abbau und Umbau. Mit dem hier vorgestellten Verfahren können die Forscher eine homogene 3D-Matrix erhalten, die durch das natürliche Kollagen Typ I gebildet wird, in dem Axone (oder Zellen) auf einen chemischen Gradienten reagieren können, der von genetisch veränderten Zellen abgesondert wird, wie sie es in vivo tun. Verschiedene axonale Reaktionen auf Gradienten attraktiver oder hemmender Cues (Protein, Lipide usw.) können leicht mit...

Neuronale Axone, die in axonalen Wachstumskegeln enden, wandern große Entfernungen durch die extrazelluläre Matrix (ECM) des Embryos über bestimmte Pfade, um ihre entsprechenden Ziele zu erreichen. Der Wachstumskegel ist der distale Teil des Axons und es ist spezialisiert, die physikalische und molekulare Umgebung der Zelle1,2zu spüren. Aus molekularer Sicht werden Wachstumskegel durch mindestens vier verschiedene molekulare Mechanismen geleitet: Kontaktanziehung, Chemoattraktion, Kontaktabstoßung und Chemorepulsion, ausgelöst durch verschiedene axonale Leitlinien3,4 , 5 , 6. Berührungsvermittelte Prozesse können teilweise in zweidimensionalen (2D) Kulturen auf mikrogemusterten Substraten überwacht werden (z.B. mit Streifen7,8 oder Flecken9, die die Moleküle enthalten). Axone können jedoch auf nicht-diffusive Weise zu ihrem Ziel navigieren, indem sie mehrere attraktive und abstoßende Moleküle aus Leitpfostenzellen in der Umgebungerfassen 4,5,10. Hier beschreiben wir eine einfache Methode der 3D-Kultur, um zu überprüfen, ob ein abgesondertes Molekül chemorepulsive oder chemoattraktive Effekte auf die Entwicklung von Axonen induziert.
Die frühesten Studien zielten darauf ab, die Auswirkungen von Axon-Leitlinien zu bestimmen, die Explantkulturen in dreidimensionalen (3-D) Matrizen verwendeten, um Gradienten zu erzeugen, die in vivo Bedingungen11,12simulierten. Dieser Ansatz ermöglichte zusammen mit In-vivo-Experimenten die Identifizierung von vier Hauptfamilien von Beratungsstellen: Netrins, Slits, Semaphorins und Ephrins4,5,6. Diese molekularen Hinweise und andere Faktoren13 werden durch die wachsenden Axone integriert, die die Dynamik von Haftkomplexen auslösen und mechanische Kräfte über das Zytoskelett14,15,16transduzieren. Um molekulare Gradienten in 3D-Kulturen für die axonale Navigation zu erzeugen, verwendeten Pionierforscher Plasmagerinnselsubstrate17, die auch für organotypische Scheibenpräparate18verwendet wurden. 1958 wurde jedoch ein neues Protokoll zur Erzeugung von 3D-Kollagenhydrogelen für das Studium mit Maximows Geräten19berichtet, einer Kulturplattform, die in mehreren Studien verwendet wurde, die für mikroskopische Beobachtungen geeignetsind 20. Eine weitere Pionierstudie berichtete kollagengel als Werkzeug zur Einbettung menschlicher Fibroblasten zur Untersuchung der Differenzierung von Fibroblasten in Myofibroblasten in Wundheilungsprozessen21. Parallel dazu setzten Lumsden und Davies Kollagen aus der Rinderdermis ein, um die vermeintliche Wirkung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) auf die leitenden Sensornervenfasern zu analysieren22. Mit der Entwicklung neuer Kulturplattformen (z.B. Multi-Well-Platten) durch verschiedene Firmen und Labore wurden Kollagenkulturen an diese neuen Geräte angepasst6,23,24,25 ,26. Parallel dazu wurde ein Extrakt aus ECM-Material aus der Engelbreth-Holm-Swarm-Tumorzelllinie kommerziell zur Verfügung gestellt, um diese Studien zu erweitern27.
Kürzlich wurden mehrere Protokolle entwickelt, um molekulare Gradienten mit vermeintlichen Rollen in der Axonführung mit 3-D-Hydrogelen (z. B. Kollagen, Fibrin usw.) zu erzeugen. 28. Alternativ kann das Kandidatenmolekül in unterschiedlicher Konzentration in einer porösen Matrix (z.B. NGF29) immobilisiert oder durch Kultivierung in einem kleinen Bereich der 3D-Hydrogelzellaggregate erzeugt werden, die das Molekül absondern, um eine radiale Gradient4,23,24,25,26. Die letzte Möglichkeit wird in diesem Protokoll erläutert.
Das hier vorgestellte Verfahren ist eine einfache, schnelle und hochreproduzierbare Methode, die auf der Analyse des axonalen Wachstums in 3-D-Hydrogelkulturen des embryonalen Maushirns basiert. Im Vergleich zu anderen Methoden eignet sich das Protokoll gut für nicht ausgebildete Forscher und kann nach einer kurzen Ausbildung (1-2 Wochen) voll entwickelt werden. In diesem Protokoll isolieren wir zunächst Kollagen aus erwachsenen Rattenschwänzen, um weitere 3D-Matrizen zu erzeugen, in denen genetisch veränderte Zellaggregate vor dem embryonalen neuronalen Gewebe kultiviert werden. Diese Zellaggregate bilden radiale chemische Gradienten eines Kandidatenmoleküls, was eine Reaktion auf die wachsenden Axone auslöst. Schließlich kann die Bewertung der Auswirkungen des Moleküls auf wachsende Axone leicht mit einer Phasenkontrastmikroskopie oder alternativ immunzytochemischen Methoden durchgeführt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

Dieses Protokoll verwendet natürliches Kollagen Typ I, um dreidimensionales (3-D) Hydrogel zur Überwachung und Analyse des axonalen Wachstums zu erzeugen. Das Protokoll konzentriert sich auf die Kultivierung kleiner Stücke embryonaler oder früher postnataler Nagetierhirne in einem 3-D-Hydrogel, das durch die von der Rattenschwanzsehne abgeleitete Art I Kollagen mit spezifischer Porosität gebildet wird. Gewebeteile werden im Hydrogel kultiviert und mit bestimmten Hirnfragmenten oder genetisch veränderten Zellaggregaten konfrontiert, um Moleküle zu erzeugen und abzusondern, die geeignet sind, einen Gradienten innerhalb der porösen Matrix zu erzeugen. Die Schritte dieses Protokolls sind einfach und reproduzierbar, enthalten jedoch kritische Schritte, die bei seiner Entwicklung sorgfältig zu berücksichtigen sind. Darüber hinaus kann das Verhalten wachsender Axone direkt mit einem Phasenkontrastmikroskop oder einem Mono-/Multiphotonenfluoreszenzmikroskop nach Fixierung mit immunzytochemischen Methoden überwacht und analysiert werden.

Hier stellen wir eine weithin zugängliche Methodik zur Untersuchung des axonalen Wachstums in 3-D-Hydrogel-Kollagenkulturen des embryonalen Mausnervensystems vor. Zu diesem Zweck isolierten wir Kollagen aus erwachsenen Rattenschwänzen, um 3D-Matrizen zu erzeugen, in denen wir genetisch veränderte Zellaggregate kultivierten, die Netrin-1 oder Sema3E mit embryonalem neuronalem Gewebe (z. B. CA-Region des Hippocampus) konfrontiert emittierten. Diese Zellaggregate bildeten einen radial verteilten Gradienten des Kandidaten...

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Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Diese Methode ist nützlich, um die Rolle einiger Moleküle in der axonalen Führung und neuronalen Migration während der Entwicklung des Neurosystems zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Analyse der Ergebnisse schnell und einfach ist und keine komplexe Software erfordert, die viel Training für Forscher implizieren würde. Demonstrieren mirian Segura-Feliu, ein Techniker aus unserem Labor und ich.Um 200, 000 COS-1-Zellen in 35 Millimeter Petrischalen zu starten und mit komplettem Kulturmedium in einem Zellkultur-Inkubator zu brüten, um 70 bis 80% Konfluenz über Nacht zu lesen. Am folgenden Tag, um COS-1-Zellen mit der DNA zu transfekieren, die das Kandidatenmolekül mit Liposomen-basierter Transfektionsmethode kodieren. Mischen Sie zunächst 250 Mikroliter Serumfreies Medium und ein bis 2 Mikrogramm DNA in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und brüten bei Raumtemperatur fünf Minuten lang.Um eine liposomale Röhre vorzubereiten, fügen Sie 240 Mikroliter des serumfreien Mediums und 10 Mikroliter liposomaler Transfektionsreagenz hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Fügen Sie nach der Inkubation den Inhalt der DNA-Röhre in die lipsomale Röhre ein. Sanft mischen und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren.Ersetzen Sie das Medium auf den kultivierten Zellen durch 1,5 Milliliter des serumfreien Mediums. Fügen Sie die DNA-Liposomen-Mischung langsam hinzu und fallen Sie weise auf die Zellen. Inkubieren Sie im Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator für drei Stunden.Nach der abgeschlossenen Inkubation das Medium durch das gesamte Kulturmedium ersetzen und über Nacht im Inkubator brüten. Am folgenden Tag spülen Sie die Zellen mit 0,1 molaren Dulbecco s PBS. Fügen Sie 800 Mikroliter Trypsin EDTA pro Gericht hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 15 Minuten im Kohlendioxid-Inkubator.Sammeln Sie getrennte Zellen mit zwei Millilitern des gesamten Kulturmediums in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr und fügen Sie 10 Milliliter des gleichen Mediums hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius bei 130 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das pellet enthaltende COS-1-Zellen auf Eis auf.Nach der Herstellung der Kollagen-Arbeitsmischung 100 bis 150 Mikroliter der Kollagenmischung in das Pellet der transfizierten Zellen geben und sanft mischen, indem sie nach oben und unten pfeifen. 45 bis 50 Mikroliter Kollagenzellpelletmischung auf eine 35 Millimeter Petrischale verteilen, um ein gleichmäßiges Band von Kollagenzellen zu bilden, die etwa ein bis 1,5 Zentimeter lang sind. Legen Sie die Schale in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Gelation beobachtet wird.Bereiten Sie einen zweiten Streifen mit Kontrollzellen in einer zweiten Kulturschale vor und legen Sie ihn in den Inkubator. Wenn die Gelation abgeschlossen ist, fügen Sie drei bis vier Milliliter 37 Grad Celsius erwärmtes COS-1 komplettes Kulturmedium zu jedem Gericht hinzu, das die gegelten Kollagenzellstreifen enthält, und legen Sie sie in den Inkubator. Verwenden Sie ein feines Skalpell oder einen Gewebechopper, um die Kollagenzellstreifen zu schneiden, um kleine quadratische Stücke zu erzeugen, 400 bis 500 Mikrometer lang.Übertragen Sie alle Abschnitte von der gleichen Transfektion summieren Sie auf eine Petrischale, die drei bis 3,5 Milliliter neuronaler Kulturmedien enthält. Überprüfen Sie unter einem Sezieren Mikroskop die Qualität der Stücke und legen Sie die Gerichte in den Inkubator. Verwenden Sie eine Schere, um Embryohörner am embryonalen Tag 16.5 aus der Bauchhöhle einer geopferten schwangeren weiblichen Ratte zu schneiden und legen Sie sie in eine große Petrischale mit kaltem HBSSg-Puffer.Legen Sie die Schale in die laminare Fließhaube und verwenden Sie gerade Zangen, um die Embryonen zu extrahieren und legen Sie sie in eine neue Schale mit kaltem HBBSg. Mit kleinen Zangen, entfernen Sie die Haut, und dann mit gekrümmten und geraden Zangen, sorgfältig sezieren Sie das Gehirn und legen Sie in eine Schüssel mit kalten HBSSg. Unter einem Sezieren Mikroskop, mit einem Skalpell oder einer feinen Schere, schneiden Sie das Gehirn in der Mitte entlang der Mittellinie, um beide Hemisphären zu trennen.Dann entfernen Sie diencephalon und mit feinen Zangen, entfernen Meninges und Blutgefäße aus den Hirnstücken. Verwenden Sie 100% Ethanol, um alle Teile des Gewebe-Choppers zu reinigen, insbesondere PTFE-Schneidplatte und die Rasierklinge und halten Sie den Gewebe-Chopper in der laminaren Flusshaube unter UV-Beleuchtung für 15 Minuten. Übertragen Sie jedes Gewebestück auf die Schneidplatte des Gewebehäckslers.Nachdem das Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Stücke aus den 35 Millimeter Petrischalen, gefüllt mit drei bis vier Millilitern kompletten NCM. Mit feinen Wolframnadeln, beenden Sie die Gewebesektion in vollständiger NCM. Überprüfen Sie die Qualität der erhaltenen Scheiben unter dem Sezieren Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Schichten in der Dunklen Feldoptik klar identifizierbar sind und sezieren Sie den Bereich von Interesse mit Wolframnadeln.Bewahren Sie die hochwertigen Stücke in komplettem NCM-Medium im Kohlendioxid-Inkubator auf. Visuelle Demonstration ist entscheidend in den Schritten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Ko-Kulturen, die die Wörter erleichtert, um den Prozess zu verstehen. Legen Sie mehrere sterile vier Brunnenkulturplatten in die laminare Strömungshaube und bereiten Sie wie bisher eine Kollagen-Arbeitsmischung zu.Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter der Hydrogelmischung in den Boden jedes Brunnens, um eine kreisförmige Kollagenbasis zu produzieren. Legen Sie die Gerichte in den Inkubator, bis eine vollständige Gelation beobachtet ist. Und überprüfen Sie die Qualität des gegelten Kollagens.Mit einer Pipette ein kleines Stück COS-1-Zellaggregat auf die Hydrogelbasis übertragen und dann mit einer Pipette ein Gewebestück auf derselben Basis in der Nähe des Zellstücks in einem Abstand von einer Explantationsgröße platzieren. Nach der Vorbereitung einer neuen Arbeiten Kollagen-Mischung auf Eis, sanft Pipette 15 bis 20 Mikroliter dieser neuen Mischung, um das Explant und das Zellaggregat zu decken, so dass ein Sandwich wie Hydrogel-Kultur. Verwenden Sie eine feine Wolframnadel, um die Explantation neu zu orientieren, so dass sie dem Zellaggregat bei 500 bis 600 Mikrometern gegenübersteht.Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, bis die Gelation beobachtet wird, und fügen Sie dann 0,5 Milliliter vollständiger NCM mit 2%B27 Ergänzung ergänzt und halten Kulturen für 36 bis 48 Stunden im Inkubator. Als Hippocampus-Axone mit Netrin-1 konfrontiert wurden, wuchsen sie bevorzugt in Richtung der Quelle von Netrin-1, was darauf hindeutet, dass Netrin-1 als Chemo-attraktives Molekül für diese Axone wirkt. In der Kontrollbedingung, oder Mock-Transfektion, wuchsen alle Axone radial, ohne jegliche Richtungspräferenz.Als Hippocampus-Axone mit Sema3E-Sekretionszellen konfrontiert wurden, wuchsen die meisten von ihnen gegenüber dem Zellaggregat, was darauf hindeutet, dass Sema3E als chemoabstoßendes Molekül für diese Axone wirkt. Diese schematische Darstellung der axonalen Reaktions- und Quantifizierungsmethode zeigt, dass die Axone unter Kontrollbedingungen gleichmäßig in proximalen und distalen Quadranten verteilt waren, die mit radialem Auswuchs dargestellt wurden. Dies deutete auf ein proximales Distal- oder PD-Verhältnis von einem hin.Wenn Explanten eine erhöhte Anzahl von Axonen im proximalen Quadranten im Vergleich zum distalen zeigten, was auf eine Chemoanziehung hindeutet, war das PD-Verhältnis größer als eins. Wenn die Anzahl der Axone im distalen Quadranten höher war als im proximalen, was auf Chemoabstoßung hindeutet, war das PD-Verhältnis geringer als eins. Nach dieser Methode können Forscher wichtige Informationen über die Rolle einiger Moleküle während der neuronalen Entwicklung erhalten, was es uns ermöglicht, einen Ausgangspunkt zu schaffen, um die Funktionen weiter zu erforschen.Obwohl diese Technik in der neuronalen Entwicklung nützlich ist, wie dies ist, Könnte es auch in pharmakologischen Screening, Angiogenese, und Gewebe-Engineering als Strategien angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Forschung

Neurowissenschaften

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Mechanische Manipulation von Neuronen zu Axonal Entwicklungssteuerung

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

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Entwerfen und Implementieren von Nervous System Simulationen auf LEGO Roboter

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