Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

המחברים מודים לטום יוחנן על עצת המערכת ומסיה סגורה-פליקס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו ממומנת על ידי תוכנית CERCA ועל ידי הנציבות עבור אוניברסיטאות ומחקר של המחלקה לחדשנות, אוניברסיטאות, וארגון של הגנרל לטאת דה קטלוניה (SGR2017-648). עבודה זו מומן על ידי משרד הספרדית של מחקר, חדשנות ואוניברסיטת (MEICO) דרך BFU2015-67777-R ו RTI2018-099773-B-100, הספרדי Prion הרשת (Prion ספרד AGL2017-90665-REDT), ואת המכון קרלוס השלישי, CIBERNED ( חטט-2018-2).

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו תחת ההנחיות והפרוטוקולים של הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים (CEEA) של אוניברסיטת ברצלונה, ואת הפרוטוקול לשימוש מכרסמים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי CEEA של אוניברסיטת ברצלונה (אישור CEEA276/16 ו 141/15).
1. טיהור זנב של עכברוש קולגן
<ol><li>לאסוף מבוגר ג ' ספרא?...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+axon+guidance.">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring:+a+primer.">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).</li><li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules.">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li><li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li><li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients.">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li><li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+mechanisms:+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents.">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li><li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development.+The+decade+of+the+developing+brain.">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li><li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6.">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li><li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transmission+in+migrating+cells.">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes.">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).</li><li>Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+examining+organotypic+CNS+cultures+with+Nomarski+optics.">A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics.</a> In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earliest+sensory+nerve+fibres+are+guided+to+peripheral+targets+by+attractants+other+than+nerve+growth+factor.">Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor.</a> Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).</li><li>Chedotal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorins+III+and+IV+repel+hippocampal+axons+via+two+distinct+receptors.">Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors.</a> Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrin+signaling+in+morphogenesis,+neural+development+and+plasticity.">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth.">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li><li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite-J:+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures.">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-hydroxyproline+(3Hyp)-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen.">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li><li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+(CD11c-CD18,+gp150-95).">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li><li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration.">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li><li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+gels+and+the+'Bornstein+legacy':+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration.">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li></ol>

צמיחת האקסונים המתפתחים היא פולשנית בעיקר וכוללת השפלה ושיפוץ ECM. באמצעות ההליך המוצג כאן, החוקרים יכולים להשיג מטריקס תלת-ממד הומוגנית שנוצר על ידי סוג טבעי אני קולגן שבו אקסונים (או תאים) יכול להגיב מעבר הדרגתי כימי מופרש על ידי תאים גנטית שונה כפי שהם עושים ב vivo. תגובות סיבי שונות מעברי צ...

האקסון העצבי, המסתיים אצטרובלים הצמיחה axons, להעביר מרחקים ארוכים דרך מטריצה החילוץ (ECM) של העובר על מסלולים ספציפיים כדי להגיע למטרות המתאימות שלהם. חרוט הצמיחה הוא החלק המרוחק של אקסון והוא מתמחה לחוש את הסביבה הפיזית והמולקולרית של התא1,2. מבחינה מולקולרית, אצטרובלים הצמיחה מונחים על-ידי לפחות ארבעה מנגנונים מולקולריים שונים: האטרקציה קשר, כימומשיכה, קשר דחייה, ו chemorepulsion מופעל על ידי רמזים שונים הדרכה סיבי3,4 , מיכל 5 , 6. ניתן לעקוב אחר תהליכים בתיווך באופן חלקי בתרבויות דו ממדיות (2d) על גבי מיקרו-מצעים (לדוגמה, עם פסים7,8 או כתמים9 המכילים את המולקולות). עם זאת, אקסונים יכולים לנווט אל היעד שלהם באופן לא מושפע על ידי חישת מספר מולקולות אטרקטיבי ודוחה מתוך הנחיה התאים בסביבה4,5,10. כאן, אנו מתארים שיטה קלה של תרבות תלת-ממדית כדי לבדוק אם המולקולה המופרש גורמת להשפעות של השפעות מושכות או כימוחלות על מפתח אקסונים.
המחקרים המוקדמים ביותר שנועדו לקבוע את ההשפעות של הרמזים אקסון הדרכה השתמשו בתרבויות המחקר תלת מימדי (3-D) מטריצות כדי ליצור מעברי צבע הדמיית בתנאים vivo11,12. גישה זו, יחד עם ניסויים vivo, מותר לזהות ארבע משפחות מרכזיות של רמזים ההנחיה: netrins, חריצים, סמבורנים, והאורגים4,5,6. אלה סימנים מולקולריים וגורמים אחרים13 משולבים על ידי axons גדל, מפעילה את הדינמיקה של מכלולי הדבקה והתמרה כוחות מכניים דרך שלד ציטומה14,15,16. כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים בתרבויות תלת-ממד עבור ניווט סיבי, חוקרים חלוצי השתמשו קריש פלזמה מצעים17, אשר שימש גם עבור ההכנות פרוסה otypic18. עם זאת, בשנת 1958, פרוטוקול חדש להפקת הידרוג'ל קולגן תלת-ממדי דווח ללימוד עם מכשירים ́s מיאטו19, פלטפורמת תרבות, בשימוש במספר מחקרים המתאימים לתצפיות מיקרוסקופיים20. עוד מחקר חלוץ דיווחו על ג'ל קולגן ככלי להטביע את הגידולים האנושיים לחקר הבידול של פיברובמות לתוך מיופיברופיצוצים בתהליך ריפוי הפצע21. במקביל, Lumsden ו דיוויס להחיל קולגן מפני השור הפרה כדי לנתח את ההשפעה הפוטיבית של גורם הגדילה העצבי (NGF) על המנחה סיבי העצב החושי22. עם פיתוח פלטפורמות תרבות חדשות (g., צלחות מרובות) על ידי חברות ומעבדות שונות, תרביות קולגן הותאמו אלה מכשירים חדשים6,23,24,25 ,26. במקביל, תמצית של חומר ECM הנגזר מתוך קו הגידול של הולם-ההולם-נחיל של מהפך להיות זמין מסחרית כדי להרחיב את המחקרים27.
לאחרונה, מספר פרוטוקולים פותחו כדי ליצור מעברי צבע מולקולריים עם תפקידים בשיטת אקסון הדרכה באמצעות הידרוג תלת-ממדי (למשל, קולגן, פיברוב, וכו ') 28. לחילופין, מולקולת המועמד יכול להיות מנופף בריכוז שונה במטריצה נקבובי (g., ngf29) או שנוצר על ידי culturing באזור קטן של אגרגטים תלת-ממד תא הידרוג'ל הפרשת המולקולה כדי ליצור רדיאלי מעבר צבע4,23,24,25,26. האפשרות האחרונה תהיה מוסברת בפרוטוקול זה.
ההליך המוצג כאן הוא שיטה קלה, מהירה ומאוד מבחינה מעשית המבוססת על ניתוח של צמיחה סיבי בתרבויות תלת-ממד הידרוג'ל של מוח העכבר העובריים. בהשוואה לשיטות אחרות, הפרוטוקול מתאים היטב לחוקרים שאינם מאומנים וניתן לפיתוח מלא לאחר אימון קצר (1-2 שבועות). בפרוטוקול זה, אנחנו הראשון לבודד קולגן מזנבות עכברוש מבוגר כדי ליצור עוד מטריצות תלת-ממד שבו אגרגטים תאים מהונדסים גנטית הם מתורבתים מול רקמת עצבי עובריים. אלה אגרגטים תאים טופס מעברי צבע כימיים רדיאלי של מולקולה מועמד אשר מעורר את התגובה של axons גדל. לבסוף, ניתן לבצע בקלות את הערכת ההשפעות של המולקולה על האקטונים הגדלים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או, לחילופין, שיטות אימונוציטוטוקכימיקלים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

פרוטוקול זה משתמש טבעי סוג אני קולגן לייצר תלת מימדי (3-D) הידרוג'ל לניטור וניתוח של הצמיחה סיבי. הפרוטוקול ממורכז על פיסות קטנות של המוח העובריים או מוקדם לידלנטאל מכרסמים בתוך 3-D הידרוג'ל שנוצר על ידי גיד הזנב חולדה-נגזר סוג שאני קולגן עם מפרט ספציפי. חתיכות רקמה הם מתורבתים בתוך ההידרוג'ל והתעמת עם שברי מוח ספציפיים או מהונדסים גנטית אגרגטים לייצר ולהפריש מולקולות מתאים ליצירת מעבר הדרגתי בתוך המטריצה הנקבובי. השלבים של פרוטוקול זה הם פשוטים ומיותחים אך כוללים צעדים קריטיים שייחשבו בקפידה במהלך התפתחותו. יתר על כן, התנהגות של אקסונים גדל ניתן לפקח ולנתח ישירות באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות או מונו/מיקרוסקופ רב-משתמשים במיקרוסקופ פלואורסצנטית לאחר קיבעון על ידי שיטות אימונוטוקוכימיקלים.

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה נגישה נרחב לחקר הצמיחה סיבי בתרבויות קולגן הידרוג'ל תלת ממדי של מערכת העצבים עכבר עובריים. למטרה זו, אנו מבודדים קולגן מזנבות עכברוש למבוגרים כדי ליצור מטריצות תלת-ממד שבו אנו מתורבתים מהונדסים גנטית אגרגטים תאים המבטא Netrin-1 או Sema3E התעמת עם רקמת עצבי עובריים (למש?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

כאן, אנו מספקים שיטה לניתוח התנהגות של האקטונים הגדלים בתוך מטריצות תלת-ממד, מחקה את התפתחותם הטבעית.

דור של 3-D הידרוג'לים קולגן מבוססי לנתח צמיחה Axonal התנהגות במהלך פיתוח מערכת העצבים

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

שיטה זו שימושית כדי לנתח את התפקיד של מולקולות מסוימות בהדרכה אקסונאלית הגירה עצבית במהלך פיתוח מערכת נוירו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתוח התוצאות הוא מהיר ופשוט ולא דורש תוכנה מורכבת אשר מרמזת על הכשרה רבה לחוקרים. הדגימה של ההליך תהיה מיריאן סאגורה-פליו, טכנאית מהמעבדה שלנו וממיתי.כדי להתחיל צלחת 200, 000 COS-1 תאים לתוך 35 מילימטר מנות פטרי דגירה עם מדיום תרבות מלאה באינקובטור תרבות התא כדי לקרוא 70 עד 80% confluency לילה. ביום שלמחרת, כדי לשנות את תאי COS-1 עם DNA קידוד המולקולה המועמדת באמצעות שיטת transfection מבוסס ליפוזום. ראשית לערבב 250 microliters של מדיום ללא סרום ואחד עד 2 מיקרוגרם DNA בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.להכנת צינור ליפוזומלי, הוסיפו 240 מיקרוליטרים של המדיום החופשי בסרום ו-10 מיקרוליטרים של רגנט ליפוזומלי, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, מוסיפים את התוכן של צינור ה- DNA לצינור השפתיים. מערבבים בעדינות ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.החלף את המדיום בתאים מתורבתים עם 1.5 מיליליטר של המדיום ללא סרום. מוסיפים את תערובת ליפוזומים DNA לאט טיפה חכם לתאים. דגירה באינקובטור תרבות תא דו תחמוצת הפחמן במשך שלוש שעות.לאחר החממה הושלמה, להחליף את המדיום עם מדיום תרבות מלאה דגירה לילה באינקובטור. למחרת, לשטוף את התאים עם 0.1 PBS של Dulbecco טוחן. מוסיפים 800 מיקרוליטרים טריפסין EDTA לכל מנה וחנקובה במשך חמש עד 15 דקות באינקובטור פחמן דו חמצני.לאסוף תאים מנותקים עם שני מיליליטר של מדיום תרבות מלאה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולהוסיף 10 מיליליטר של אותו מדיום. צנטריפוגה התאים בארבע מעלות צלזיוס ב 130 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את supernatant ולשמר את גלולה המכילה תאי COS-1 על קרח.לאחר הכנת תערובת העבודה של הקולגן, מוסיפים 100 עד 150 מיקרוליטרים של תערובת הקולגן לכדור התאים המרובים ומערבבים בעדינות על ידי צינורות למעלה ולמטה. מורחים 45 עד 50 מיקרוליטרים של תערובת גלולות של תאי קולגן על צלחת פטרי 35 מ"מ כדי ליצור תחבושת אחידה של תאי קולגן, באורך של כ-1 עד 1.5 ס"מ. מניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני עד gelation הוא ציין.מכינים רצועה שנייה המכילה תאי בקרה בצלחת תרבות שנייה ומ מניחים אותה באינקובטור. כאשר gelation הושלם, להוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מחומם COS-1 מדיום תרבות מלאה לכל מנה המכילה את רצועות תא קולגן מסוננים למקם אותם באינקובטור. השתמש אזמל דק או מסוק רקמות לחתוך את רצועות תא קולגן כדי ליצור חתיכות מרובעות קטנות, 400 עד 500 מיקרומטר אורך.מעבירים את כל החלקים מאותו מצב transfection לצלחת פטרי המכילה שלושה עד 3.5 מיליליטר של תקשורת תרבות עצבית. בדוק תחת מיקרוסקופ ניתוח את איכות החלקים והצב את הכלים באינקובטור. השתמש במספריים כדי לחתוך קרני עובר ביום עוברי 16.5 מן חלל הבטן של חולדה נקבה בהריון הקריב למקם אותם לתוך צלחת פטרי גדולה המכילה חיץ HBSSg קר.מניחים את המנה במכסה המנוע לזרימת למינאר ולהשתמש מדפים ישרים כדי לחלץ את העוברים ומניחים אותם לתוך צלחת חדשה המכילה HBBSg קר. עם מטלפים קטנים, להסיר את העור, ולאחר מכן עם מדפים מעוגלים וישרים, בזהירות לנתח את המוח ואת המקום לתוך צלחת המכילה HBSSg קר. תחת מיקרוסקופ מנתח, באמצעות אזמל או מספריים עדין, לחתוך את המוח לשניים לאורך קו האמצע כדי להפריד בין שתי ההמיספרות.לאחר מכן, להסיר את diencephalon ועם מ forceps בסדר, להסיר קרום המוח וכלי הדם מן חלקי המוח. השתמש 100% אתנול כדי לנקות את כל החלקים של מסוק הרקמות, במיוחד צלחת חיתוך PTFE ואת סכין הגילוח ולשמור את מסוק הרקמה במכסה המנוע שטף למינאר תחת תאורת UV במשך 15 דקות. מעבירים כל חתיכת רקמה לצלחת החיתוך של מסוק הרקמות.לאחר הרקמה כבר קצוץ, להעביר את החלקים מן 35 מילימטר צלחות פטרי מלא שלושה עד ארבעה מיליליטר של NCM מלא. באמצעות מחטי טונגסטן בסדר, לסיים את ניתוח הרקמה NCM מלא. בדוק את איכות הפרוסות המתקבלות תחת המיקרוסקופ המ לנתח, לוודא כי השכבות ניתנות לזיהוי בבירור באופטיקה השדה הכהה לנתח את האזור של עניין עם מחטי טונגסטן.שמור על חתיכות באיכות טובה במדיום NCM שלם באינקובטור פחמן דו חמצני. הדגמה חזותית היא קריטית בצעדים הקשורים להכנת התרבויות המקלות על המילים להבין את התהליך. מניחים כמה צלחות תרבות סטריליות ארבע היטב במכסה המנוע לזרימת למינאר ולהכין תערובת קולגן עובד כמו קודם לכן.מוסיפים 15 עד 20 מיקרוליטרים של תערובת ההידרוגל לתחתית כל באר כדי לייצר בסיס קולגן עגול. מניחים את הכלים באינקובטור עד ג'לציה מלאה נצפתה. ותבדוק את האיכות של הקולגן עם הג'ל.עם פיפטה, להעביר חתיכה קטנה של COS-1 תא צבירה על בסיס הידרוג'ל, ולאחר מכן להשתמש פיפטה למקם חתיכת רקמה על אותו בסיס, קרוב לחתיכת התאים לצבור במרחק של גודל explant אחד. לאחר הכנת תערובת קולגן עובדת חדשה על קרח, בעדינות pipette 15 כדי 20 microliters של תערובת חדשה זו כדי לכסות את explant ואת הצבירה התא, מה שהופך כריך כמו תרבות הידרוג'ל. השתמש מחט טונגסטן בסדר לכוון מחדש את explant כך שהוא פונה הצבירה התא ב 500 כדי 600 מיקרומטר.מחזירים את הצלחת לאנקובטור עד שהג'לציה נצפית ולאחר מכן מוסיפים 0.5 מיליליטר של NCM שלם בתוספת 2%B27 תוספת ולשמור תרבויות במשך 36 עד 48 שעות באינקובטור. כאשר האקסונים ההיפוקמפוסיים התעמתו עם Netrin-1, הם גדלו באופן מועדף כלפי המקור של Netrin-1, המציין כי Netrin-1 פועל כמו מולקולה אטרקטיבית כימותרפיה עבור אקסונים אלה. במצב הבקרה, או transfection מדומה, כל האקסונים גדלו באופן רדיסטי, ללא כל העדפה כיוונית.כאשר אקסונים ההיפוקמפוס התעמתו עם תאי הפרשת Sema3E, רובם גדלו מול צבירת התא, המציין כי Sema3E פועל כמו מולקולה דוחה כימותרפיה עבור אקסונים אלה. ייצוג סכמטי זה של שיטת התגובה והכימות האקסונאלית מראה כי בתנאי בקרה, האקסונים חולקו באופן שווה הן ברביעים הפרוקסימליים והן ברבעים הדיסטליים, המוצגים עם תרביות רדיאליות. זה הצביע על יחס דיסטלי או PD פרוקסימלי של אחד.כאשר explants הראו מספר גדל של אקסונים ברביע הפרוקסימלי בהשוואה דיסטלי, המציין משיכה כימותרפיה, יחס PD היה גדול יותר מאחד. כאשר מספר האקסונים היה גבוה יותר ברביע הדיסטלי מאשר ברביע הפרוקסימלי, מה שמצביע על דחייה בכימותרפיה, יחס ה- PD היה נמוך מאחד. בעקבות שיטה זו, חוקרים יכולים להשיג מידע חיוני על התפקיד של מולקולות מסוימות במהלך התפתחות עצבית, אשר מאפשר לנו להקים נקודת התחלה כדי לחקור עוד יותר את הפונקציות.למרות טכניקה זו שימושית בהתפתחות עצבית כמו זה, זה יכול להיות מיושם גם הקרנה תרופתית, אנגיוגנזה, הנדסת רקמות כמו אסטרטגיות.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Scalable Fluidic Injector מערכים עבור ויראלי הכוונת של 3-D מעגלים פגוע המוח

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

תכנון ויישום מערכת עצבים בסימולציות לגו רובוטים

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

הדמיה של axonal תחבורה של Quantum בזמן אמת Dot-כותרת BDNF בנוירונים העיקרי

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

הדמיה 3-D וניתוח של נוירונים נגועים<em&gt; In vivo</em&gt; עם<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...