Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए संपादकीय सलाह और एम सेगुरा-Feliu के लिए टॉम Yohannan धन्यवाद. इस कार्य को CERCA कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था और विश्वविद्यालयों और नवाचार विभाग, विश्वविद्यालयों, और जनरलिट डे Catalunya (SGR2017-648) के उद्यम के अनुसंधान के लिए आयोग द्वारा. इस काम को स्पेन के अनुसंधान, नवाचार और विश्वविद्यालय (MEICO) द्वारा BFU2015-67777-R और RTI2018-099773-B-100, स्पेनिश Prion नेटवर्क (Prionet स्पेन AGL2017-90665-REDT) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, और कार्लोस संस्थान कार्लोस III, CIED () PRY-2018-2).

सभी पशु प्रयोगों के दिशा निर्देशों और बार्सिलोना विश्वविद्यालय के पशु प्रयोग (CEA) के लिए नैतिक समिति के प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया, और इस अध्ययन में कृन्तकों के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल की समीक्ष?...

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	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. 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Axons के विकास मुख्य रूप से आक्रामक है और ECM गिरावट और remodeling भी शामिल है. यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने एक समरूप 3-डी मैट्रिक्स प्राप्त कर सकते हैं जो प्राकृतिक प्रकार मैं कोलेजन द्व?...

न्यूरोनल एक्सॉन्स, एक्सॉनल विकास शंकु में समाप्त होने वाले, अपने उपयुक्त लक्ष्यों तक पहुंचने के लिए विशिष्ट रास्ते पर भ्रूण के एक्स्ट्राकोल्यूलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से लंबी दूरी की दूरी तय करते हैं। वृद्धि शंकु एक्सॉन का दूरस्थ भाग होता है और कोशिका1,2के भौतिक और आण्विक वातावरण को समझना विशेष होता है . एक आणविक दृष्टिकोण से, विकास शंकु कम से कम चार अलग-अलग आणविक तंत्र द्वारा निर्देशित कर रहे हैं: संपर्क आकर्षण, chemoattraction, संपर्क प्रतिकर्षण, और chemorepulsion विभिन्न axonal मार्गदर्शन संकेतों3,4 द्वारा ट्रिगर , 5 , 6.संपर्क-मध्यस्थ प्रक्रियाओं को सूक्ष्म-पैटर्न वाले सबस्टरेटपर (जैसे, धारियोंकेसाथ 7,8 या धब्बे9 में अणुओं से युक्त) पर द्वि-आयामी (2D) संस्कृतियों में आंशिक रूप से निगरानी की जा सकती है। तथापि, पर्यावरण में गाइडपोस्ट कोशिकाओं से कई आकर्षक और प्रतिकर्षण अणुओं को संवेदनित करके एक्सॉन अपने लक्ष्य को गैर-विपरीत तरीके से प्राप्त कर सकते हैं4,5,10. यहाँ, हम 3-डी संस्कृति की एक आसान विधि का वर्णन करने के लिए जाँच करें कि क्या एक स्रावित अणु axons के विकास पर chemorepulsive या chemoattractive प्रभाव लाती है.
प्रारंभिक अध्ययन का उद्देश्य एक्सॉन मार्गदर्शन संकेतों के प्रभाव को निर्धारित करना था जो त्रि-आयामी (3-डी) मैट्रिक में एक्सप्लांट संस्कृतियों का उपयोग करते थे ताकि विवो स्थितियोंमेंअनुकरण करते हुए स्नातक उत्पन्न किया जा सके। इस दृष्टिकोण, एक साथ vivo प्रयोगों में, मार्गदर्शन संकेतों के चार प्रमुख परिवारों की पहचान के लिए अनुमति दी: Netrins, Slits, Semaphorins, और Ephrins4,5,6. इन आण्विक संकेतों और अन्य कारकों13 बढ़ते एक्सॉन द्वारा एकीकृत होते हैं , जिससे आसंजन परिसरों की गतिशीलता को ट्रिगर किया जाता है और साइटोस्केलेटन14,15,16के माध्यम से यांत्रिक बलों का रूपांतरण होता है . एक्सोनल नेविगेशन के लिए 3-डी संस्कृतियों में आणविक प्रवणता उत्पन्नकरने के लिए, अग्रणी शोधकर्ताओं ने प्लाज्मा थक्का 17 का उपयोग किया, जिसका उपयोग ऑर्गनॉटिपिक स्लाइस तैयारियों के लिए भी किया गया था 18 . तथापि, 1958 में, 3-डी कोलेजन हाइड्रोगेल्स उत्पन्न करने के लिए एक नए प्रोटोकॉल की सूचना मैक्सिमो के उपकरणोंकेसाथ अध्ययन करने के लिए की गई थी, जो एक संस्कृति मंच है, जिसका उपयोग सूक्ष्म प्रेक्षणों20के लिए उपयुक्त कई अध्ययनों में किया जाता है। एक अन्य अग्रणी अध्ययन ने घाव भरने की प्रक्रिया21में फाइब्रोब्लास्ट्स के मायओफाइब्रोब्लास्ट्स में फाइब्रोब्लास्ट के भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मानव फाइब्रोब्लास्ट्स को एम्बेड करने के लिए एक उपकरण के रूप में कोलेजन जेल की सूचना दी . समानांतर में, Lumsden और Davies संवेदी तंत्रिका फाइबर22के मार्गदर्शन पर तंत्रिका विकास कारक (NGF) के putative प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए गोजातीय dermis से कोलेजन लागू किया. विभिन्न कंपनियों और प्रयोगशालाओं द्वारा नई संस्कृति प्लेटफार्मों (जैसे, बहु अच्छी प्लेटें) के विकास के साथ, कोलेजन संस्कृतियों इन नए उपकरणोंकेलिए अनुकूलित किया गया 6 ,23,24,25 ,26. समानांतर में, Engelbreth-Holm-Swarm ट्यूमर सेल लाइन से व्युत्पन्न ECM सामग्री का एक उद्धरण व्यावसायिक रूप से इन अध्ययनों का विस्तार करने के लिए उपलब्ध कराया गया था27.
हाल ही में, 3-डी हाइड्रोगेल्स (उदा., कोलेजन, फाइब्रिन, आदि) का उपयोग करके एक्सॉन मार्गदर्शन में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ आणविक प्रवणता उत्पन्न करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। 28. वैकल्पिक रूप से, उम्मीदवार अणु को छिद्रयुक्त मैट्रिक्स (उदा., NGF29) में विभिन्न सांद्रता में स्थिर किया जा सकता है या 3-डी हाइड्रोजेल सेल के एक छोटे से क्षेत्र में एक त्रिज्या उत्पन्न करने के लिए अणु को स्रावित करके उत्पन्न किया जा सकता है ढाल4,23,24,25,26. अंतिम संभावना इस प्रोटोकॉल में समझाया जाएगा.
यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया भ्रूण माउस मस्तिष्क के 3-डी hydrogel संस्कृतियों में axonal विकास के विश्लेषण के आधार पर एक आसान, तेज और अत्यधिक reproduible विधि है. अन्य तरीकों के साथ तुलना में, प्रोटोकॉल अच्छी तरह से गैर प्रशिक्षित शोधकर्ताओं के लिए अनुकूल है और पूरी तरह से एक छोटी प्रशिक्षण के बाद विकसित किया जा सकता है (1-2 सप्ताह). इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वयस्क चूहे पूंछ से कोलेजन को अलग करने के लिए आगे उत्पन्न 3-डी matrices जिसमें आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल समुच्चय भ्रूण न्यूरॉन ऊतक के सामने सुसंस्कृत कर रहे हैं. ये कोशिका समुच्चय किसी उम्मीदवार अणु की रेडियल रासायनिक प्रवणता का निर्माण करती हैं जो बढ़ते अक्षों के लिए अनुक्रिया प्राप्त करती है। अंत में, बढ़ते एक्सॉन पर अणु के प्रभाव का मूल्यांकन आसानी से एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी या, वैकल्पिक रूप से, इम्यूनोसाइटोकेमिकल तरीकों का उपयोग करके किया जा सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

इस प्रोटोकॉल की निगरानी और axonal विकास का विश्लेषण करने के लिए तीन आयामी (3-डी) hydrogel उत्पन्न करने के लिए प्राकृतिक प्रकार मैं कोलेजन का उपयोग करता है. प्रोटोकॉल एक 3-डी हाइड्रोजेल के अंदर भ्रूण या जल्दी प्रसवोत्तर कृंतक दिमाग के छोटे टुकड़े culturing पर केंद्रित है चूहे पूंछ कण्डरा व्युत्पन्न प्रकार मैं विशिष्ट porosity के साथ कोलेजन द्वारा गठित. ऊतक के टुकड़े hydrogel के अंदर सुसंस्कृत कर रहे हैं और विशिष्ट मस्तिष्क टुकड़े या आनुवंशिक रूप से संशोधित सेल समुच्चय का सामना करने के लिए उत्पादन और छिद्रमैट्रिक्स के अंदर एक ढाल बनाने के लिए उपयुक्त अणुओं स्रावित. इस प्रोटोकॉल के कदम सरल और reproduible हैं, लेकिन इसके विकास के दौरान ध्यान से विचार किया जा करने के लिए महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं. इसके अलावा, बढ़ते एक्सॉन ्स्सकेशन के व्यवहार पर नजर रखी जा सकती है और प्रतिरक्षा-विक्षिप्त विधियों द्वारा निर्धारण के बाद एक चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप या मोनो/मल्टीफोटोन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीधे विश्लेषण किया जा सकता है।

यहाँ, हम भ्रूण माउस तंत्रिका तंत्र के 3-डी हाइड्रोजेल कोलेजन संस्कृतियों में axonal विकास का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ पद्धति प्रस्तुत करते हैं। यह अंत करने के लिए, हम वयस्क चूहे पूंछ से कोलेज?...

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Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

यहाँ, हम 3 डी matrices में बढ़ तेवरों के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं, उनके प्राकृतिक विकास की नकल करते हैं।

3-डी कोलेजन आधारित hydrogels की पीढ़ी तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान Axonal विकास और व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

न्यूरो सिस्टम विकास के दौरान अक्षीय मार्गदर्शन और न्यूरोनल माइग्रेशन में कुछ अणुओं की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए यह विधि उपयोगी है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि परिणामों का विश्लेषण त्वरित और सरल है और जटिल सॉफ्टवेयर की आवश्यकता नहीं है जो शोधकर्ताओं के लिए बहुत सारे प्रशिक्षण का मतलब होगा। प्रक्रिया का प्रदर्शन मिरियन सेगुरा-फेलियू, हमारी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन और खुद होगा।प्लेट 200 शुरू करने के लिए, 000 COS-1 कोशिकाओं को 35 मिलीमीटर पेट्री व्यंजन में और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में पूर्ण संस्कृति माध्यम के साथ इनक्यूबेट करने के लिए 70 से 80% पूर्णता रातोंरात पढ़ने के लिए। अगले दिन, लिपोसोम आधारित ट्रांसफैक्शन विधि का उपयोग करके उम्मीदवार अणु को एन्कोडिंग डीएनए के साथ COS-1 कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए। सबसे पहले सीरम फ्री मीडियम के 250 माइक्रोलीटर और 1.5 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में एक से 2 माइक्रोग्राम डीएनए मिलाएं और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।एक लिपोसोमल ट्यूब तैयार करने के लिए, सीरम मुक्त माध्यम के 240 माइक्रोलीटर और लिपोसोमल ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, डीएनए ट्यूब की सामग्री को लिपसोमल ट्यूब में जोड़ें। धीरे-धीरे 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिलाएं और इनक्यूबेट करें।सुसंस्कृत कोशिकाओं पर माध्यम को सीरम मुक्त माध्यम के 1.5 मिलीलीटर से बदलें। डीएनए लिपोसोम्स मिश्रण को धीरे-धीरे जोड़ें और कोशिकाओं में बुद्धिमान छोड़ दें। कार्बन डाइऑक्साइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में तीन घंटे तक इनक्यूबेट।इनक्यूबेशन पूरी होने के बाद मीडियम को कंप्लीट कल्चर मीडियम से बदलें और इनक्यूबेटर में रातोंरात इनक्यूबेट करें । अगले दिन, 0.1 मोलर डल्बेको के पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कुल्ला करें। प्रत्येक डिश के अनुसार 800 माइक्रोलीटर ट्राइप्सिन एडटा जोड़ें और कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में पांच से 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में पूर्ण संस्कृति माध्यम के दो मिलीलीटर के साथ अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करें और एक ही माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें। पांच मिनट के लिए 130 गुना ग्राम पर कोशिकाओं को चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट निकालें और बर्फ पर COS-1 कोशिकाओं युक्त गोली को संरक्षित करें।कोलेजन वर्किंग मिश्रण तैयार करने के बाद, कोलेजन मिश्रण के 100 से 150 माइक्रोलीटर को संक्रमित कोशिकाओं के गोली में जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। कोलेजन कोशिकाओं का एक समान बैंड बनाने के लिए 35 मिलीमीटर पेट्री डिश पर कोलेजन सेल पैलेट मिश्रण के 45 से 50 माइक्रोलीटर फैलाएं, लगभग एक से 1.5 सेंटीमीटर लंबा। जब तक जेलेशन मनाया जाता है तब तक इनक्यूबेटर में डिश को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड में रखें।एक दूसरी संस्कृति पकवान में नियंत्रण कोशिकाओं युक्त एक दूसरी पट्टी तैयार करें और इसे इनक्यूबेटर में रखें। जब जेलेशन पूरा हो जाता है, तो 37 डिग्री सेल्सियस के तीन से चार मिलीलीटर गर्म COS-1 पूर्ण संस्कृति माध्यम को प्रत्येक डिश में जोड़ें जिसमें गेलेड कोलेजन सेल स्ट्रिप्स होते हैं और उन्हें इनक्यूबेटर में रखें। छोटे वर्ग टुकड़े, लंबाई में 400 से 500 माइक्रोमीटर उत्पन्न करने के लिए कोलेजन सेल स्ट्रिप्स को काटने के लिए एक ठीक स्केलपेल या ऊतक हेलिकॉप्टर का उपयोग करें।एक ही ट्रांसफेक्शन स्थिति से सभी वर्गों को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें न्यूरोनल कल्चर मीडिया के तीन से 3.5 मिलीलीटर होते हैं। टुकड़ों की गुणवत्ता को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जांचें और व्यंजनों को इनक्यूबेटर में रखें। एक बलिदान गर्भवती महिला चूहे के पेट गुहा से भ्रूण दिवस १६.५ पर भ्रूण सींग काटने के लिए कैंची का प्रयोग करें और उन्हें एक बड़े पेट्री डिश में रखें जिसमें ठंडा HBSSg बफर होता है ।लैमिनार फ्लो हुड में डिश रखें और भ्रूण निकालने के लिए सीधे संदंश का उपयोग करें और उन्हें ठंडे एचबीबीएसजी युक्त एक नए पकवान में रखें। छोटे संदंश के साथ, त्वचा को हटा दें, और फिर घुमावदार और सीधे संदंश के साथ, ध्यान से मस्तिष्क को विच्छेदन करें और ठंडे एचबीएसएसजी वाले पकवान में रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक स्केलपेल या ठीक कैंची का उपयोग करके, दोनों गोलार्द्धों को अलग करने के लिए मस्तिष्क को मिडलाइन के साथ आधे में काट दिया।फिर, डाइएंसेफेलन को हटा दें और ठीक संदंश के साथ, मस्तिष्क के टुकड़ों से मेनिंग्स और रक्त वाहिकाओं को हटा दें। ऊतक हेलिकॉप्टर के सभी भागों को साफ करने के लिए 100% इथेनॉल का उपयोग करें, विशेष रूप से पीएफई कटिंग प्लेट और रेजर ब्लेड और ऊतक हेलिकॉप्टर को यूवी रोशनी के तहत लेमिनार फ्लक्स हुड में 15 मिनट तक रखें। ऊतक हेलिकॉप्टर की काटने की थाली में प्रत्येक ऊतक टुकड़ा स्थानांतरित करें।टिश्यू कटा होने के बाद तीन से चार मिलीलीटर पूर्ण एनसीएम से भरे 35 मिलीमीटर पेट्री व्यंजनों से टुकड़ों को स्थानांतरित करें। ठीक टंगस्टन सुइयों का उपयोग करके, ऊतक विच्छेदन को पूर्ण एनसीएम में समाप्त करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त स्लाइस की गुणवत्ता की जांच करें, यह सुनिश्चित करें कि परतें अंधेरे क्षेत्र प्रकाशिकी में स्पष्ट रूप से पहचाने जा सकते हैं और टंगस्टन सुइयों के साथ ब्याज के क्षेत्र को विच्छेदन करते हैं।अच्छी गुणवत्ता वाले टुकड़ों को कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में पूरा एनसीएम माध्यम में रखें। दृश्य प्रदर्शन सह संस्कृतियों की तैयारी से संबंधित चरणों में महत्वपूर्ण है जो शब्दों को प्रक्रिया को समझने की सुविधा प्रदान करता है । लैमिनार फ्लो हुड में कई बाँझ चार अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें रखें और पहले की तरह एक कोलेजन काम मिश्रण तैयार करें।एक परिपत्र कोलेजन आधार का उत्पादन करने के लिए प्रत्येक कुएं के नीचे हाइड्रोगेल मिश्रण के 15 से 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। जब तक पूर्ण जेलेशन मनाया जाता है तब तक व्यंजनों को इनक्यूबेटर में रखें। और गेलेड कोलेजन की गुणवत्ता की जांच करें।एक पिपेट के साथ, हाइड्रोजेल बेस पर कुल COS-1 सेल का एक छोटा सा टुकड़ा स्थानांतरित करें, फिर एक ही आधार पर ऊतक टुकड़ा रखने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, एक एक्सप्लांट आकार की दूरी पर कुल कोशिकाओं के टुकड़े के करीब। बर्फ पर एक नया काम कोलेजन मिश्रण तैयार करने के बाद, धीरे से इस नए मिश्रण के 15 से 20 माइक्रोलीटर पिपेट करने के लिए explant और सेल कुल कवर, हाइड्रोजेल संस्कृति की तरह एक सैंडविच बना । एक्सप्लांट को फिर से उन्मुख करने के लिए एक ठीक टंगस्टन सुई का उपयोग करें ताकि यह 500 से 600 माइक्रोमीटर पर कुल सेल का सामना करे।जब तक जेलेशन मनाया जाता है तब तक प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें और फिर 2% B27 पूरक के साथ पूरक पूर्ण एनसीएम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और इनक्यूबेटर में 36 से 48 घंटे के लिए संस्कृतियों को रखें। जब हिप्पोकैम्पल एक्सॉन का सामना नेट्रिन-1 से हुआ, तो वे नेट्रिन-1 के स्रोत की ओर अधिमानतः बढ़े, यह दर्शाता है कि नेटरिन-1 इन एक्सॉन के लिए एक कीमो आकर्षक अणु के रूप में कार्य करता है। नियंत्रण स्थिति, या नकली ट्रांसफैक्शन में, सभी अक्षों में किसी भी दिशात्मक वरीयता के बिना, मूल रूप से वृद्धि हुई।जब हिप्पोकैम्पस एक्सोन Sema3E स्राव कोशिकाओं के साथ सामना किया गया, उनमें से ज्यादातर सेल कुल के विपरीत बढ़ी, यह दर्शाता है कि Sema3E इन अक्षों के लिए एक कीमो प्रतिकारक अणु के रूप में कार्य करता है । अक्षीय प्रतिक्रिया और मात्राकरण विधि के इस योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है कि नियंत्रण स्थितियों में, अक्षों को रेडियल आउटग्रोथ के साथ दिखाए गए समीपस्थ और डिस्टल क्वाड्रंट दोनों में समान रूप से वितरित किया गया था। यह एक समीपस्थ डिस्टल या पीडी अनुपात एक का संकेत दिया।जब एक्सप्लांट्स ने डिस्टल की तुलना में समीपस्थ चतुर्भुज में एक्सोन की संख्या में वृद्धि दिखाई, तो कीमो आकर्षण का संकेत मिलता है, पीडी अनुपात एक से अधिक था। जब एक्सॉन की संख्या समीपस्थ एक की तुलना में डिस्टल क्वाड्रेंट में अधिक थी, जो कीमो प्रतिकर्षण का संकेत देती है, तो पीडी अनुपात एक से कम था। इस विधि के बाद, शोधकर्ताओं ने न्यूरोनल विकास के दौरान कुछ अणुओं की भूमिका के बारे में आवश्यक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, जो हमें आगे कार्यों का पता लगाने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु स्थापित करने के लिए अनुमति देता है ।यद्यपि यह तकनीक न्यूरोनल विकास में उपयोगी है, लेकिन इसे रणनीतियों के रूप में औषधीय स्क्रीनिंग, एंजियोजेनेसिस और ऊतक इंजीनियरिंग में भी लागू किया जा सकता है।

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Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

कृंतक केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए ड्रग्स का प्रत्यक्ष intraventricular डिलिवरी

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

लेगो रोबोट पर तंत्रिका तंत्र सिमुलेशन डिजाइन और कार्यान्वयन

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

कृंतक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विवो optogenetic उत्तेजना में

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

क्वांटम के Axonal परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग प्राथमिक न्यूरॉन्स में BDNF डॉट लेबल

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

एक मॉडल के रूप घ्राण प्रणाली axonal विकास पैटर्न और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए<em&gt; Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

न्यूरॉन्स की 3 डी इमेजिंग और विश्लेषण संक्रमित<em&gt; Vivo</em&gt; साथ<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

रैखिक Agarose चैनलों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; लारवल रेंगने व्यवहार

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...