Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

著者は、編集上のアドバイスのためのトム・ヨハンナンと技術的な援助のためのM.セグラ・フェリウに感謝します。この研究は、CERCAプログラムとイノベーション学科、大学、およびカタルーニャ総局の企業の大学と研究委員会(SGR2017-648)によって資金提供されました。この研究は、BFU2015-67777-RとRTI2018-099773-B-100、スペインプリオンネットワーク(プリオネットスペインAGL2017-90665-REDT)、および研究所カルロIII(CIBERN)を通じてスペインの研究イノベーション大学(MEICO)によって資金提供されました。PRY-2018-2)。

すべての動物実験は、バルセロナ大学の動物実験倫理委員会(CEEA)のガイドラインとプロトコルの下で行われ、この研究でげっ歯類を使用するためのプロトコルは、CEEAによってレビューされ、承認されました。バルセロナ大学(CEEAの承認#276/16と141/15)。
ラットテールコラーゲンの精製
<ol><li>倫理的なガイドラインに従って動物を犠牲にした後、成虫スプラーグドーリーラ?...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. 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R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrin+signaling+in+morphogenesis,+neural+development+and+plasticity.">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth.">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li><li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite-J:+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures.">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-hydroxyproline+(3Hyp)-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen.">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li><li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+(CD11c-CD18,+gp150-95).">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li><li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration.">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li><li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+gels+and+the+'Bornstein+legacy':+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration.">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li></ol>

アクソンの開発の成長は主に侵襲的であり、ECMの劣化および改造を含む。ここで提示される手順を使用して、研究者は、軸質(または細胞)が生体内で行うように遺伝子組み換え細胞によって分泌される化学勾配に応答することができる天然タイプIコラーゲンによって形成された均質な3Dマトリックスを得ることができます。魅力的または阻害性の手がかり(タンパク質、脂質など)の勾配に対す...

軸次成長コーンで終わる神経軸子は、適切な標的に到達するために、特定の経路上の胚の細胞外マトリックス(ECM)を通して長い距離を移動する。成長コーンは軸の遠位部分であり、細胞1、2の物理的および分子環境を感知することに特化している。分子の観点から、成長コーンは少なくとも4つの異なる分子メカニズムによって導かれる:接触引力、化学的魅力、接触反発、および異なる軸方向ガイダンスキュー3、4によって引き起こされる化学脈動,5,6.接触媒介プロセスは、マイクロパターン基板上の2次元(2D)培養物(例えば、分子を含むストライプ7、8またはスポット9)で部分的に監視することができる。しかし、軸ゴンは、環境4、5、10のガイドポスト細胞からいくつかの魅力的で反発性の分子を感知することによって、非拡散的な方法で標的にナビゲートすることができます。ここでは、分泌分子が軸子の発達に化学的または化学的な効果を誘導するかどうかを確認するための3-D培養の簡単な方法について説明する。
軸次誘導キューの効果を決定することを目的とした最も初期の研究は、生体内条件11,12でシミュレートする勾配を生成するために3次元(3-D)行列に植生培養物を使用した。このアプローチは、生体内実験と共に、ネトリン、スリット、セマフォリン、およびエフリン4、5、6の4つの主要な家族の同定を可能にした。これらの分子キューおよび他の因子13は、成長する軸ソンによって統合され、接着複合体のダイナミクスを引き起こし、細胞骨格14、15、16を介して機械的力を伝達する。軸次ナビゲーションのための3D培養物中の分子勾配を生成するために、先駆的な研究者は、プラズマ血栓基板17を使用し、これはまた、組織性スライス製剤18に使用された。しかし、1958年に、3-Dコラーゲンヒドロゲルを生成する新しいプロトコルは、マキシモ・イズ・デバイス19、培養プラットフォーム、顕微鏡観察20に適したいくつかの研究で使用される研究のために報告された。別の先駆的研究は、創傷治癒プロセス21における筋線維芽細胞の分化を研究するためのヒト線維芽細胞を埋め込むためのツールとしてコラーゲンゲルを報告した。並行して、ラムズデンとデイヴィスはウシ真皮からコラーゲンを適用し、感覚神経線維22の誘導に対する神経成長因子(NGF)のプテプティブ効果を解析した。異なる企業や研究室による新しい培養プラットフォーム(例えば、マルチウェルプレート)の開発に伴い、コラーゲン培養はこれらの新しいデバイス6、23、24、25に適応しました。 、26.並行して、エンゲルブレス-ホルム-スウォーム腫瘍細胞株に由来するECM材料の抽出物は、これらの研究27を拡大するために市販された。
最近では、3Dヒドロゲル(例えば、コラーゲン、フィブリンなど)を用いた軸次ガイダンスにおいて、置き方の役割を有する分子勾配を生成するいくつかのプロトコルが開発されている。28.あるいは、候補分子は、多孔質マトリックス中の異なる濃度(例えば、NGF29)で固定化するか、分子を分泌する3-Dヒドロゲル細胞凝集体の小さな領域で培養することによって生成され、放射状を生成することができる。グラデーション4,23,24,25,26.最後の可能性は、このプロトコルで説明されます。
ここで提示される手順は、胚マウス脳の3-ヒドロゲル培養における軸生成長の分析に基づく、簡単で迅速かつ高い再現性の方法である。他の方法と比較して、プロトコルは、非訓練を受けた研究者に適しており、短いトレーニング(1-2週間)後に完全に開発することができます。このプロトコルでは、まず成ラットの尾からコラーゲンを分離し、遺伝子改変された細胞凝集体が胚性神経組織の前で培養される3Dマトリックスをさらに生成する。これらの細胞凝集体は、成長する軸子に対する応答を引き出す候補分子の放射状化学勾配を形成する。最後に、成長軸石に対する分子の効果の評価は、相コントラスト顕微鏡または、あるいは、あるいは、免疫細胞化学的方法を用いて容易に行うことができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

このプロトコルは、自然なタイプIコラーゲンを使用して、軸生成長を監視および分析するための3次元(3D)ヒドロゲルを生成します。このプロトコルは、ラット尾腱由来I型コラーゲンによって形成された3Dヒドロゲル内の胚または早期産後げっ歯類の脳の小片を特定の多孔性を持つ培養に集中する。組織片はヒドロゲル内で培養され、特定の脳断片または遺伝子組み換え細胞凝集体に直面して、多孔質マトリックス内の勾配を作成するのに適した分子を生成し、分泌する。このプロトコルの手順はシンプルで再現可能ですが、開発中に慎重に検討する重要な手順が含まれています。さらに、成長軸子の挙動は、免疫細胞化学的方法による固定後の位相コントラスト顕微鏡またはモノ/マルチフォトン蛍光顕微鏡を使用して直接監視および分析することができる。

ここでは、胚性マウス神経系の3Dヒドロゲルコラーゲン培養における軸上成長を研究するために広くアクセス可能な方法論を提示する。この目的のために、成体ラットの尾からコラーゲンを単離し、ネトリン-1またはSema3Eを発現する遺伝子組み換え細胞凝集体を培養した3Dマトリックスを生成し、胚性神経組織(例えば、海馬のCA領域)と対峙した。これらの細胞凝集体は、コラーゲンマトリック...

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Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

この方法は、神経系の発達中に軸索誘導および神経移動におけるいくつかの分子の役割を分析するために有用である。この手法の主な利点は、結果の分析が迅速かつ簡単であり、研究者のための多くのトレーニングを意味する複雑なソフトウェアを必要としないということです。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室と私の技術者であるミリアン・セグラ=フェリウです。プレート200、000 COS-1細胞を35ミリメートルのペトリ皿に開始し、一晩70〜80%のコンフルエンスを読み取るために細胞培養インキュベーターで完全な培養培地でインキュベートする。翌日、リポソームベーストランスフェクション法を用いて候補分子をコードするDNAを用いてCOS-1細胞をトランスフェクトする。まず、250マイクロリットルの無血清培地と1~2マイクログラムのDNAを1.5ミリリットル遠心管に混合し、室温で5分間インキュベートします。リポソームチューブを調製するには、240マイクロリットルの無血清培地と10マイクロリットルのリポソームトランスフェクション試薬を加え、室温で5分間インキュベートする。インキュベーション後、DNAチューブの含有量をリプソームチューブに加えます。室温で15分間静かに混ぜ合わせてインキュベートします。培養した細胞上の培地を1.5ミリリットルの無血清培地に交換します。DNAリポソーム混合物をゆっくりと加え、細胞に賢明に落とします。炭酸ガス細胞培養インキュベーター中で3時間インキュベートする。インキュベーションが完了した後、培地を完全な培養培地に交換し、インキュベーターで一晩インキュベートする。翌日、0.1モルのダルベッコのPBSで細胞をすすいだ。各皿ごとに800マイクロリットルのトリプシンEDTAを加え、二酸化炭素インキュベーターで5〜15分間インキュベートします。完全な培養培地の2ミリリットルを含む剥離細胞を15ミリリットル遠心管に集め、同じ培地の10ミリリットルを加える。細胞を摂氏4度で130倍gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、氷上にCOS-1細胞を含むペレットを保存します。コラーゲンの作業混合物を調製した後、トランスフェクション細胞のペレットにコラーゲン混合物の100〜150マイクロリットルを加え、上下にピペットを入れて穏やかに混合します。45~50マイクロリットルのコラーゲン細胞ペレット混合物を35ミリメートルのペトリ皿に広げ、長さ約1〜1.5センチメートルの均一なバンドを形成します。培養物に37°C、炭酸ガス5%で、ゲル化が観察されるまで皿を置きます。第2培養皿にコントロール細胞を含む第2のストリップを準備し、インキュベーターに入れます。ゲル化が完了したら、37°Cの3〜4ミリリットルを加えて、ゲル化したコラーゲン細胞ストリップを含む各皿にCOS-1完全な培養培地を加え、インキュベーターに入れます。細かいメスまたはティッシュチョッパーを使用してコラーゲン細胞ストリップを切断し、長さ400〜500マイクロメートルの小さな正方形の部分を生成します。同じトランスフェクション条件から、3~3.5ミリリットルの神経培養培地を含むペトリ皿にすべてのセクションを移します。解剖顕微鏡でピースの品質を確認し、調理器に皿を置きます。はさみを使用して、犠牲にされた妊娠中の雌ラットの腹腔から胚の角を16.5日目に切断し、冷たいHBSSgバッファーを含む大きなペトリ皿に入れます。皿を層流フードに入れ、まっすぐな鉗子を使って胚を抽出し、冷たいHBBSgを含む新しい皿に入れます。小さな鉗子で、皮膚を取り除き、湾曲したまっすぐな鉗子で、脳を慎重に解剖し、冷たいHBSSgを含む皿に入れる。解剖顕微鏡の下で、メスまたは細かいはさみを使用して、両方の半球を分離するために正中線に沿って半分に脳を切断します。次に、脳の中から、細かい鉗子で、脳の部分から髄膜や血管を取り除きます。100%エタノールを使用して、組織チョッパー、特にPTFE切断板とカミソリブレードのすべての部分を洗浄し、15分間UV照明下の層フラックスフードに組織チョッパーを保管してください。各組織片を組織チョッパーの切断板に移す。組織が切り刻まれた後、完全なNCMの3〜4ミリリットルで満たされた35ミリメートルペトリ皿から作品を転送します。細かいタングステン針を使用して、完全なNCMで組織解剖を終了します。解剖顕微鏡で得られたスライスの品質を確認し、層が暗視野光学で明確に識別可能であることを確認し、タングステン針で関心領域を解剖します。二酸化炭素インキュベーターで完全なNCM培地に良質の部分を保管してください。視覚的なデモンストレーションは、プロセスを理解するために単語を容易にする共文化の準備に関連する手順で重要です。いくつかの滅菌4ウェル培養プレートを層流フードに入れ、以前のようにコラーゲン作業混合物を調製する。各ウェルの底にヒドロゲル混合物の15〜20マイクロリットルを加え、円形のコラーゲンベースを作り出します。完全なゲル化が観察されるまで、食器をインキュベーターに入れる。そして、ゲル化したコラーゲンの品質を確認してください。ピペットを使用して、COS-1細胞凝集体の小片をヒドロゲルベースに移し、ピペットを使用して組織片を同じベースに配置し、1つの外植体サイズの距離で凝集した細胞片の近くに置きます。氷の上に新しい働くコラーゲン混合物を準備した後、外植および細胞凝集体をカバーするために、この新しい混合物の15〜20マイクロリットルを穏やかにピペットし、ヒドロゲル培養のようなサンドイッチを作る。500~600マイクロメートルで細胞の凝集体に向かうために、細かいタングステン針を使用して外植体の向きを変えます。ゲル化が観察されるまでプレートをインキュベーターに戻し、2%B27サプリメントで完全なNCMを0.5ミリリットル加え、培養器で36〜48時間培養します。海馬軸索がNetrin-1に直面したとき、彼らはNetrin-1の供給源に向かって優先的に成長し、Netrin-1がこれらの軸索のケモ魅力的な分子として機能することを示した。制御条件、または模擬トランスフェクションでは、すべての軸索は方向の好みなしに放射状に成長した。海馬軸索がSema3E分泌細胞に直面したとき、それらのほとんどは細胞凝集体の反対に成長し、Sema3Eがこれらの軸索の化学反発分子として機能することを示した。軸索応答および定量法のこの模式的表現は、制御条件において、軸索が近位および遠位象限の両方で均等に分布していたことを示し、放射状の成長で示した。これは、近位遠位またはPD比が1の近位遠位またはPD比を示した。外植木が近位象限で近位象限の軸索の増加を示した場合、近位の軸索は、近位の引力を示し、その後、PD比は1より大きかった。軸索の数が近位の軸分よりも遠位象限で高かった場合、化学反発を示し、PD比は1未満であった。この方法に従って、研究者は神経細胞の発達中に一部の分子の役割に関する重要な情報を得ることができ、機能をさらに探求するための出発点を確立することができます。この技術は、このように神経細胞の発達に有用であるが、それはまた、戦略として薬理学的スクリーニング、血管新生、および組織工学に適用することができる。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

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Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

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In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

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齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

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