Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

저자는 편집 조언과 기술 지원에 대한 M. 세구라 펠리우에 대한 톰 요한난 에게 감사드립니다. 이 작품은 CERCA 프로그램과 혁신의 학과의 대학 및 연구위원회에 의해 투자되었다, 대학, 일반 카탈루냐의 기업 (SGR2017-648). 이 작품은 연구의 스페인 정부에 의해 투자되었다, 혁신과 대학 (MEICO) BFU2015-67777-R 및 RTI2018-099773-B-100, 스페인 프리온 네트워크 (프리오네트 스페인 AGL2017-90665-REDT), 그리고 연구소 카를로스 III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

모든 동물 실험은 바르셀로나 대학의 동물 실험 윤리위원회 (CEEA)의 지침과 프로토콜에 따라 수행되었으며,이 연구에서 설치류의 사용을위한 프로토콜은 CEEA에 의해 검토되고 승인되었습니다. 바르셀로나 대학 (CEEA 승인 #276/16 과 141/15).
1. 쥐 꼬리 콜라겐의 정화
<ol><li>윤리적 지침에 따라 동물을 희생한 후 성인 스프라그-Dawley 쥐 꼬리(8-9주)를 수집하고 95% 에탄올로 헹구십시...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules.">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li><li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li><li>von Philipsborn, A. 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A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Bornstein, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth.">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li><li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite-J:+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures.">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-hydroxyproline+(3Hyp)-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen.">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li><li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+(CD11c-CD18,+gp150-95).">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li><li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration.">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li><li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+gels+and+the+'Bornstein+legacy':+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration.">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li></ol>

개발 축색의 성장은 주로 침략적이며 ECM 분해 및 리모델링을 포함합니다. 여기에 제시된 절차를 사용하여, 연구원은 축세포 (또는 세포)가 생체 내에서와 같이 유전자 변형 세포에 의해 분비되는 화학 구배에 반응할 수 있는 천연 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 균질한 3-D 매트릭스를 얻을 수 있다. 매력적이거나 억제 큐(단백질, 지질 등)의 구배에 대한 상이한 축삭 반응은 특정 대조군(모의 형질감?...

축축액으로 끝나는 뉴런 축은 배아의 세포외 매트릭스(ECM)를 통해 장거리를 이동하여 특정 경로를 통해 적절한 목표에 도달합니다. 상기 성장원뿔은 축속액의 원위부분이며 세포1,2의물리적 및 분자환경을 감지하는 데 특화되어 있다. 분자 관점에서, 성장 콘은 적어도 네 개의 다른 분자 메커니즘에 의해 유도된다: 접촉 매력, 화학 매력, 접촉 반발, 및 다른 축색 유도 큐에 의해 트리거 된 chemorepulsion3,4 , 5개 , 6.접촉 매개 공정은 마이크로 패턴 기판에서 2차원(2D) 배양으로 부분적으로 모니터링할 수 있습니다(예: 줄무늬 7,8 또는 분자를 포함하는 스폿 9). 그러나, 축세포는 환경 4,5,10에서가이드포스트 세포로부터 여러 매력적이고 반발성 분자를 감지함으로써 비확산 방식으로 그들의 표적을 탐색할 수 있다. 여기에서, 우리는 분비된 분자가 축산 개발에 chemorepulsive 또는 chemo매력적인 효력을 유도하는지 검사하는 3-D 문화의 쉬운 방법을 기술합니다.
초기 연구는 3차원(3-D) 행렬에서 배양 배양을 이용한 축삭 유도 큐의 효과를 확인하기 위한 것으로, 생체 조건에서 시뮬레이션하는 그라데이션을 생성하기 위해11,12. 이 접근법은 생체 내 실험과 함께, 네가지 주요 가족인 네 가지 주요 가족인 네트린, 슬릿, 세마포린스 및 에프린4,5,6의식별을 허용하였다. 이러한 분자 큐 및 기타 인자(13)는 성장하는 축색에 의해 통합되어, 접착 복합체의 역학을 유발하고 세포골격14,15,16을통해 기계적 힘을 변환한다. 축삭 항법용 3-D 배양물에서 분자 그라데이션을 생성하기 위해, 선구적인 연구자들은 플라즈마 혈전 기판17을사용했으며, 이는 또한 organotypic 슬라이스 제제18에사용되었다. 그러나, 1958년, 3-D 콜라겐 하이드로겔을 생성하는 새로운 프로토콜은 Maximow의 장치19,배양 플랫폼으로 연구를 위해 보고되었으며, 현미경 관찰에 적합한 여러 연구에서 20. 또 다른 개척자 연구는 상처 치유 과정에서 섬유아세포의 분화를 연구하기 위한 인간 섬유아세포를 삽입하는 도구로서 콜라겐 겔을 보고했다21. 병행하여, Lumsden과 데이비스는 소 진피로부터 콜라겐을 적용하여 감각 신경 섬유22의유도에 대한 신경 성장 인자(NGF)의 가증효과를 분석하였다. 다른 회사 및 실험실에 의한 새로운 배양 플랫폼(예: 다중 웰 플레이트)의 개발로, 콜라겐배양은 이러한 새로운 장치 6,23,24,25에 적용되었다. ,26. 병행하여, 엥겔브레스-홀름-스웜 종양 세포주에서 유래된 ECM 물질의 추출물이 이들 연구를 확장하기 위해 시판되었다27.
최근에는 3D 하이드로겔(예: 콜라겐, 피브린 등)을 사용하여 축세포 유도에 가제적 역할을 하는 분자 구배를 생성하기 위한 여러 프로토콜이 개발되었습니다. 28.대안적으로, 후보 분자는 다공성 매트릭스(예를 들어, NGF29)에서상이한 농도로 고정화될 수 있거나 또는 3-D 하이드로겔 세포 응집체의 작은 영역에서 배양하여 생성된 분자를 분비하여 방사형을 생성할 수 있다. 그라데이션 4,23,24,25,26. 마지막 가능성은 이 프로토콜에 설명됩니다.
여기에 제시된 절차는 배아 마우스 뇌의 3-D 하이드로겔 배양에서 축색 성장의 분석을 기반으로 쉽고 빠르며 매우 재현 가능한 방법입니다. 다른 방법과 비교하여, 프로토콜은 훈련되지 않은 연구자에게 적합하며 짧은 훈련 (1-2 주) 후에 완전히 개발 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 먼저 유전자 변형 세포 응집체가 배아 신경 조직 의 앞에 배양되는 3-D 행렬을 생성하기 위하여 성숙한 쥐 꼬리에서 교원을 격리합니다. 이 세포 응집체는 성장하는 축색에 대한 반응을 유도하는 후보 분자의 방사형 화학 구배를 형성합니다. 마지막으로, 성장하는 축색에 대한 분자의 효과에 대한 평가는 상 대비 현미경 또는 대안적으로 면역 세포화학적 방법을 사용하여 쉽게 수행될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

이 프로토콜은 자연타입 I 콜라겐을 사용하여 축산 성장을 모니터링하고 분석하기 위한 3차원(3-D) 하이드로겔을 생성합니다. 프로토콜은 쥐 꼬리 힘줄 유래 유형 I 콜라겐에 의해 형성된 3-D 하이드로겔 내부에 배아 또는 초기 산후 설치류 뇌의 작은 조각을 배양하는 데 중점을 두고 있다. 조직 조각은 하이드로겔 내부에서 배양되고 다공성 매트릭스 내부의 그라데이션을 생성하고 분자를 분비하기 위해 특정 뇌 단편 또는 유전자 변형 세포 응집체에 직면한다. 이 프로토콜의 단계는 간단하고 재현 가능하지만 개발 중에 신중하게 고려해야 할 중요한 단계를 포함합니다. 더욱이, 성장하는 축세포의 거동은 면역세포화학적 방법에 의한 고정 후 상 대비 현미경 또는 모노/다광자 형광 현미경을 사용하여 직접 모니터링하고 분석할 수 있다.

여기에서, 우리는 배아 마우스 신경계의 3-D 하이드로겔 콜라겐 배양에서 축색 성장을 연구하기 위하여 널리 접근가능한 방법론을 제시합니다. 이를 위해, 우리는 괴수의 쥐 꼬리로부터 콜라겐을 분리하여 배아 뉴런 조직(예를 들어, 해마의 CA 영역)과 대면한 Netrin-1 또는 Sema3E를 발현하는 유전자 변형 세포 응집체를 배양하는 3-D 매트릭스를 생성하였다. 이들 세포 응집체는 콜라겐 매트릭스 내부에...

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Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

여기서는 3D 매트릭스에서 축산이 자라는 동작을 분석하여 자연 발달을 모방하는 방법을 제공합니다.

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

이 방법은 신경 시스템 개발 중 축 상 안내 및 신경 이동에서 일부 분자의 역할을 분석 하기 위해 유용. 이 기술의 주요 장점은 결과의 분석이 빠르고 간단하며 연구원을위한 많은 교육을 암시하는 복잡한 소프트웨어가 필요하지 않다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실과 나 자신에서 기술자 인 Mirian Segura-Feliu가 될 것입니다.플레이트(200)를 시작하기 위해, 000 COS-1 세포는 35mm 페트리 접시로 배양하고 세포 배양 인큐베이터에서 완전한 배양 배지를 배양하여 하룻밤 사이에 70~80%의 인플루언스를 판독한다. 다음 날, 지방성 기반 형질 전환 방법을 사용하여 후보 분자를 코딩하는 DNA를 가진 COS-1 세포를 횡단한다. 먼저 혈청 프리 배지 250 마이크로리터와 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 1~2마이크로그램 DNA를 혼합하고 실온에서 5분간 배양합니다.리포소말 튜브를 준비하려면 혈청 프리 배지 240 마이크로리터와 10 마이크로리터의 리포소말 트랜스펙트 시약을 추가하고 실온에서 5분간 배양합니다. 잠복 후, 입술 관에 DNA 튜브의 함량을 추가합니다. 실온에서 15분간 부드럽게 혼합하고 배양합니다.배양된 세포의 배지를 혈청 프리 배지의 1.5 밀리리터로 교체한다. DNA 리포솜 혼합물을 천천히 추가하고 세포에 현명하게 떨어뜨립니다. 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 3시간 동안 배양한다.인큐베이션을 완료한 후 배지를 완전한 배양 매체로 교체하고 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 0.1 어금니 덜벡코의 PBS로 세포를 헹구는 다. 각 접시당 800개의 마이크로리터 트립신 EDTA를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에 5~15분 동안 배양합니다.완전한 배양 배지의 2밀리리터를 가진 분리된 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 수집하고 동일한 배지의 10밀리리터를 추가합니다. 원심 분리는 5 분 동안 130 배 g에서 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 얼음에 COS-1 세포를 포함하는 펠릿을 보존합니다.콜라겐 작동 혼합물을 준비한 후, 콜라겐 혼합물의 100~150마이크로리터를 트랜스감염된 세포의 펠릿에 넣고 위아래로 배관하여 부드럽게 섞는다. 콜라겐 세포 펠릿 혼합물의 45 내지 50 마이크로리터를 35mm 페트리 접시에 퍼뜨리면 약 1 내지 1.5센티미터 길이의 콜라겐 세포의 균일한 밴드를 형성한다. 젤레이션이 관찰될 때까지 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다.제2 배양 접시에 제어 세포를 포함하는 두 번째 스트립을 준비하고 인큐베이터에 놓습니다. 겔화가 완료되면, 겔화 콜라겐 세포 스트립을 포함하는 각 접시에 3-4 밀리리터를 37섭씨 37도 의 완전한 COS-1 완전한 배양 배지를 추가하고 인큐베이터에 놓습니다. 미세 한 메스 또는 조직 헬기를 사용하여 콜라겐 세포 스트립을 잘라 작은 사각형 조각, 길이 400 ~ 500 마이크로 미터를 생성합니다.동일한 경질 상태에서 모든 섹션을 뉴런 배양 배지의 3~3.5밀리리터를 함유한 페트리 접시로 옮는다. 해부 현미경으로 조각의 품질을 확인하고 인큐베이터에 요리를 배치하십시오. 가위를 사용하여 배아 날에 배아 뿔을 절단 16.5 희생 임신 한 여성 쥐의 복강에서 그들을 차가운 HBSSg 버퍼를 포함하는 큰 페트리 접시에 배치.라미나르 플로우 후드에 접시를 놓고 직선 집게를 사용하여 배아를 추출하고 차가운 HBBSg가 함유 된 새로운 접시에 넣습니다. 작은 집게로 피부를 제거한 다음 곡선과 직선 집게로 조심스럽게 뇌를 해부하고 차가운 HBSSg가 함유 된 접시에 넣습니다. 해부 현미경에서, 메스 또는 미세 가위를 사용하여, 두 반구를 분리하는 중간 라인을 따라 반으로 뇌를 잘라.그런 다음, 디엔셀론과 미세 한 집게로 제거, 뇌 조각에서 수막과 혈관을 제거. 100% 에탄올을 사용하여 티슈 헬기의 모든 부분, 특히 PTFE 절단 플레이트와 면도날의 모든 부분을 청소하고 15 분 동안 UV 조명 아래 라미나르 플럭스 후드에 조직 헬기를 유지합니다. 각 티슈 조각을 티슈 헬기의 절단 판으로 옮기다.조직을 다진 후, 완전한 NCM의 3 ~ 4 밀리리터로 가득 35 밀리미터 페트리 접시에서 조각을 전송합니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 완전한 NCM에서 조직 해부를 완료하십시오. 해부 현미경하에서 얻은 조각의 품질을 확인하여, 층이 어두운 필드 광학에서 명확하게 식별 할 수 있는지 확인하고 텅스텐 바늘로 관심 영역을 해부하십시오.이산화탄소 인큐베이터에서 완전한 NCM 배지에 좋은 품질의 조각을 보관하십시오. 시각적 데모는 단어를 용이하게 하는 공동 문화권 준비와 관련된 단계에서 중요합니다. 여러 멸균 4 개의 잘 배양 플레이트를 라미나르 흐름 후드에 넣고 이전과 같이 콜라겐 작동 혼합물을 준비합니다.하이드로겔 혼합물15~20마이크로리터를 각 웰의 바닥에 첨가하여 원형 콜라겐 베이스를 생성합니다. 완전한 젤레이션이 관찰 될 때까지 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 그리고 겔화 콜라겐의 품질을 확인합니다.파이펫을 사용하면 하이드로겔 베이스에 COS-1 셀 골재의 작은 조각을 옮은 다음 파이펫을 사용하여 동일한 베이스에 조직 조각을 배치하고, 하나의 절제 된 크기의 거리에서 집계되는 세포의 조각에 가깝습니다. 얼음에 새로운 작업 콜라겐 혼합물을 준비 한 후, 부드럽게 이 새로운 혼합물의 15 ~ 20 마이크로 리터를 피펫하여 엑사플랜트와 세포 골재를 덮어 하이드로겔 배양과 같은 샌드위치를 만듭니다. 미세 텅스텐 바늘을 사용하여 500 ~ 600 마이크로 미터의 세포 골재에 직면하도록 식소를 재배치하십시오.젤레이션이 관찰될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 반환한 다음 2%B27 보충제로 보충된 완전한 NCM의 0.5 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에서 36~48시간 동안 배양을 유지합니다. 해마 축축이 Netrin-1에 직면했을 때 Netrin-1의 근원을 선호하게 성장시켰으며, 이는 Netrin-1이 이 축축을 위한 화학 요법 매력적인 분자역할을 한다는 것을 나타냅니다. 제어 조건 또는 모의 형질전환에서 모든 축축은 방향 적 선호없이 빛날 정도로 증가했습니다.해마 축축이 세마3E 분비 세포와 마주쳤을 때, 그들 대부분은 세포 골재의 반대로 성장하여 Sema3E가 이 축종을 위한 화학 요법 분자로 작용한다는 것을 나타냅니다. 축 축 반응 및 정량화 방법의 이러한 회로도 표현은 제어 조건에서 축축이 방사형 아웃성장과 함께 표시된 근위 및 단발 사분면 모두에서 균등하게 분포되었다는 것을 보여줍니다. 이것은 하나의 근위 실산 또는 PD 비율을 나타냈다.이출시 약탈에 비해 근해 사분면에서 축삭의 수가 증가하여 화학요법을 나타내는 경우, PD 비율이 하나 이상이었다. 축축물의 수가 근면에서보다 탈구 사분면에서 높았을 때, 화학요법을 나타내는 PD 비율은 1개보다 낮았다. 이 방법에 따라, 연구원은 우리가 기능을 더 탐구하는 출발점을 확립 할 수 있도록 신경 발달 중 일부 분자의 역할에 대한 필수 정보를 얻을 수 있습니다.이 기술은 이기와 같이 신경 발달에 유용하더라도, 그것은 또한 전략으로 약리학 검열, 혈관 신생 및 조직 공학에 적용될 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

연구

신경과학

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

고도의 연결을 강화 문화의 생성을위한 두피 조직 블록의 Cryopreservation

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계에 약물을 직접 심실 배달

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Designing and Implementing Nervous System Simulations on LEGO Robots

LEGO 로봇에 신경 시스템 시뮬레이션을 설계 및 구현

We present a method to use the commercially available LEGO Mindstorms NXT robotics platform to test systems level neuroscience hypotheses. The first step ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

양자의 축삭 교통 수단의 실시간 이미징 차 뉴런에서 BDNF를 도트 표지

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

선형 아가로 오스 채널을 사용하여 공부하기<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 크롤링 동작

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...