Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af pilot finansiering fra University of Arizona Office of Research and Discovery og National Institutes of Health (R01 DE023534) til Kirsten Limesand. Den kræft biologi uddannelse Grant, T32CA009213, forudsat stipendium støtte til Wen Yu Wong. Forfatterne vil gerne takke M. Rice for hans værdifulde tekniske bidrag.

1. fremstilling af vibratome
<ol><li>Spray aftagelige komponenter af vibratome herunder buffer bakken, klinge fastgørelse, agopstået blok skimmel, og laboratorie film med 70% ethanol, derefter UV-sterilisere i mindst 30 min.</li>
	<li>Placer og fastgør et ekstra ark laboratorie film over buffer bakken for at forhindre is i at falde i.</li>
	<li>Fyld iskammeret med knust is, Fjern laboratorie filmen fra buffer bakken, og fyld buffer bakken med 100 mL iskold 1x fosfat bufferet saltopløsning (PBS), suppleret med 1% pe...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer.">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li><li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer.">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li><li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+(chemo)radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy.">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznan&#769; and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li><li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation:+from+animal+models+to+therapies.">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li><li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands.">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing.">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis.">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li><li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding.">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death &amp; Disease. 1, (2010).</li><li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands.">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li><li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland.">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands:+the+slice+culture+model.">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li><li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome.">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

Salivary kirtel forskning har udnyttet en række kultur modeller, herunder udødeliggjort 2-d kulturer, primære 2-d kulturer, 3-d salisphere kulturer, og 3-d organ kulturer fra embryonale eksplanteret væv at fastslå spørgsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har givet indsigtsfulde oplysninger på tværs af en bred vifte af forskningsspørgsmål og vil fortsat være vigtige værktøjer i spyt forskning. Begrænsningerne af disse kultur modeller omfatter graduering af P53 aktivitet under i...

Korrekt spytkirtel funktion er afgørende for oral sundhed og er ændret efter hoved-og hals kræftbehandling med strålebehandling1. I 2017 blev der rapporteret næsten 50.000 nye tilfælde af hoved-og hals kræft i USA2. På grund af de vævsskade lige og ofte uoprettelige virkninger af strålebehandling på omgivende normale væv såsom spytkirtler, patienter er ofte tilbage med alvorlige bivirkninger og forringet livskvalitet2,3, 4. for at Almindelige komplikationer forårsaget af strålingsskader manifesterer sig i symptomer som xerostomi (den subjektive følelse af mundtørhed), tand karies, nedsat evne til at tygge og sluge, taleforstyrrelser og kompromitterede orale mikrobiomer2, 3 af , 4. disse symptomer kollektivt kan føre til underernæring og nedsat overlevelse hos berørte personer5. Mens spytkirtel dysfunktion i denne population har været veldokumenteret, er de underliggende mekanismer for skader på acinic celler blevet anfægtet, og der er ringe integration mellem forskellige dyremodeller6,7.
De nuværende metoder til at studere spytkirtel funktion og stråling-induceret skader omfatter brugen af in vivo modeller, udødeliggjort cellelinjer, to-dimensionelle (2-D) primære cellekulturer og tredimensionale (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Traditionelt, cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2-D kulturer involverer enkeltlags celler dyrket på flade overflader og er værdifulde for hurtige, nemme og omkostningseffektive eksperimenter. Men, kunstige cellekultur betingelser kan ændre differentierings status og fysiologiske reaktioner af celler udsat for forskellige betingelser, og resultaterne ofte undlader at oversætte til hele organismen modeller14,15. Hertil kommer, udødeliggjort cellekulturer kræver graduering af P53 aktivitet, som er afgørende for spytkirtel respons på DNA-skade16,17.
3-D salisphere kulturer er beriget for Stam-og progenitorceller på tidlige tidspunkter i kultur og har været nyttige for forståelsen af radio følsomhed af denne delmængde af spytkirtel celler9,18. En kritisk begrænsning af alle disse kultur modeller er de ineffektive i at visualisere 3-D struktur af spytkirtel, herunder den ekstracellulære matrix (ECM) og celle-celle interaktioner over forskellige lag, som er afgørende i modulende spyt sekretion15. Behovet for en metode, der omfatter opførsel af vævet som helhed, men kan også manipuleres under laboratoriebetingelser for at studere virkningerne af behandlingen er nødvendig for yderligere at opdage de underliggende mekanismer af stråling-induceret spytkirtel Dysfunktion.
Levende vævs skæring og kultur er blevet dokumenteret tidligere19,20 og bruges ofte til at studere hjernens-vævs interaktioner21. I tidligere studier blev parotideale (par) spytkirtel vævet fra mus opdelt på ca. 50 μm og kultiveret i op til 48 h, og analyse af levedygtighed, celledød og funktion blev udført derefter19. Su et al. (2016) udvidet på denne metode ved dyrkning af humane submandibulære kirtler (Smg'er) opdelt på 35 μm eller 50 μm i 14 dage20. Den foreslåede metode er en avancement i, at det omfatter både parotitis og submandibulære spytkirtler sekeret på 50 μm og 90 μm og evaluering af kulturerne i 30 dage. Evnen til at skære en række vævs tykkelse er vigtig i vurderingen celle-celle-og celle-ECM interaktioner, der er relevante for cellulære processer, herunder apical-basolaterale polaritet og innervation for sekretion. Desuden blev de spytkirtel skiver bestrålet mens i kulturen for at bestemme gennemførligheden af denne kulturmodel til at studere stråling-induceret spytkirtel skader.
Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. For at bestemme den maksimale tid sektioner, der er levedygtige efter dissektion, trypan blå farvning, levende celle farvning, og immunhistokemiske farvning for celledød blev udført. Confokal mikroskopi og immuno fluorescens farvning blev udnyttet til at evaluere specifikke cellepopulationer, morfologiske strukturer og niveauer af spredning. Væv sektion kulturer blev også udsat for ioniserende stråling til at bestemme virkningerne af stråling på forskellige markører i denne 3-D model. Induktion af celledød, cytoskeletale forstyrrelser, tab af differentierings markører og kompenserende proliferation i bestrålede ex vivo-kulturer blev sammenlignet med tidligere undersøgelser af in vivo-modeller. Denne metode giver et middel til at undersøge den rolle, som celle celle interaktioner efter strålingsskader og giver en eksperimentel model til effektivt at vurdere effekten af terapeutiske interventioner (genmanipulationer eller farmakologiske agenser ), som kan være mindre velegnet til in vivo-modeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Hyposalivation og xerostomi skaber kroniske orale komplikationer, der mindsker livskvaliteten hos patienter med hoved-og hals kræft, som behandles med strålebehandling. Eksperimentelle tilgange til forståelse mekanismer af spytkirtel dysfunktion og restaurering har fokuseret på in vivo modeller, som er handicappet af en manglende evne til systematisk at screene terapeutiske kandidater og effektivitetsgevinster i transfektering evne til at manipulere specifikke gener. Formålet med denne spytkirtel organotypiske kultur protokol er at evaluere maksimal tid for kulturens levedygtighed og karakterisere cellulære ændringer efter ex vivo strålebehandling. Vi udnyttede immuno fluorescens farvning og confokal mikroskopi til at bestemme, hvornår specifikke cellepopulationer og markører er til stede i løbet af en 30-dages kultur periode. Desuden evalueres celle markører, der tidligere er indberettet i in vivo-strålings modeller, i kulturer, der er bestrålet ex vivo. Bevæger sig fremad, denne metode er en attraktiv platform for hurtig ex vivo vurdering af murine og humane spytkirtel væv svar til terapeutiske midler, der forbedrer spyt funktion.

Primær 2-D kulturer dyrkes i føtale kvægserum (FBS) suppleret medier mens primær 3-D salisphere kultur er typisk dyrkes i serum-fri betingelser10,11. Desuden har de to tidligere undersøgelser, der udnytter vibratome kulturer fra spytkirtler, dyrket deres sektioner i 0% eller 10% FBS suppleret Media19,20. Mus submandibulære skiver blev opdelt i en tykkelse på 50 μm ...

Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Ved hjælp af tre-dimensionelle organotypiske kulturer til at visualisere morfologi og funktionelle markører for spytkirtler kan give nye indblik i mekanismerne for vævsskade efter stråling. Beskrevet her er en protokol til sektion, kultur, irradiat, bejdsen, og billede 50 – 90 μm tykke spytkirtel sektioner før og efter udsættelse for ioniserende stråling.

Strålebehandling af Organotypiske kulturer fra Submandibulær og Parotid spytkirtler modeller Key in vivo egenskaber

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Denne protokol gør det muligt at evaluere celle til celle interaktioner mellem forskellige celletyper i et væv, og ex vivo molekylære og farmakologiske manipulationer, der ville være mindre muligt in vivo. Den største fordel ved denne teknik er den forlængede periode, hvor disse vævsafsnit kan opretholdes i kulturen, så de kan evalueres på et senere tidspunkt. Denne teknik vil gøre det muligt for en hurtigere screening af terapeutiske forbindelser til at korrigere spytkirtel skader og vil sandsynligvis reducere antallet af mus, der anvendes til disse undersøgelser.Vi planlægger at bruge denne teknik til at forstå spytkirtel respons på strålebehandling på mellemliggende tidspunkt punkter og at tænde og slukke gener med bestemte intervaller. Det sværeste aspekt af denne procedure er vævssektion og forebyggelse af tab af vævssektioner under kultur- og farvningstrinnene. Før proceduren desinficeres de aftagelige vibratome komponenter med 70% ethanol, efterfulgt af UV sterilisation i mindst 30 minutter.Fastgør et ekstra ark laboratoriefilm over bufferbakken for at forhindre is i at falde i, og fyld iskammeret med knust is. Fjern laboratoriefilmen fra bufferbakken, og fyld bufferbakken med 100 milliliter iskold PBS suppleret med 1%penicillin streptomycin ampicillin eller PSA. Placer derefter et barberblad i rustfrit stål i klingeholderen, og brug en skruetrækker for at lette justeringen af klingevinklen.Efter isolering af spytkirtlerne, placere det høstede væv i en steril 30 millimeter kultur parabol indeholder to milliliter iskold PBS suppleret med 1% PSA. Brug autoclaved spån, overføre kirtler til bunden af indlejring skimmel og dække væv med flydende 3% lavt smeltepunkt agarose. Ved hjælp af snæv, justere vævet til midten af blokken i det relevante plan, og placere agarose blok på is i 10 minutter.Når agarose har hærdet, omhyggeligt køre et barberblad omkring den ydre kant af formen og lad blokken glide ud på UV-steriliserede laboratorium film. Brug barberbladet til at skære en agaroseboks med spytkirtlen ud, idet du skal passe på, at sektionens plan er lige og parallelt med den modsatte side af blokken. Brug superlim til at fastgøre blokken til skærefladen og få 50 eller 90 mikrometer tykke sektioner på vibratomen med en 0,075 millimeter pr. sekund hastighed ved en 100 hertz frekvens.Brug derefter en autoklaver naturligt hårkryste til at overføre sektionerne til individuelle brønde i en 24 brøndvævskulturskål, der indeholder en milliliter iskold PBS pr. Når alle sektioner er erhvervet, brug og autoklaveret mikro spatel til at overføre sektioner i individuelle 0,4 mikrometer hæld størrelse membran skær i hver brønd af en 24 godt væv kultur plade, der indeholder 300 mikroliter af vibratome kultur medium per brønd. Derefter placere pladen i en 37 grader Celsius og 5% kuldioxid inkubator med fugtighed, forfriskende mediet i bunden af hver brønd, og tilføje 40 mikroliter af medium til membranen indsætter hver anden dag efter behov for op til 30 dage.At bestråle vævene overføres til bestrålingsanlægget i en overdækket styrofoambeholder for at undgå temperaturudsving og behandle sektionerne med en enkelt dosis stråling på fem grader. Derefter returnere kulturerne til en stråling sikkert væv kultur inkubator. Ved antistoffarvning af vævssektionerne vaskes prøverne med mindst to fem minutters vask i steril PBS, og sektionerne fastgøres i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius natten over.Den næste morgen vaske sektioner tre gange med PBS suppleret med 1% kvæg serum albumin og 0,1% Triton X-100, eller PBT, før permeabilizing væv med 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter. Sektionerne vaskes tre gange i PBT som påvist, før der blokeres for uspecifikke bindinger med blokerende agens suppleret med 1 % normalt gedeserum i en time. Derefter inkuberes sektionerne natten over i det relevante primære antistof af interesse.Bright felt mikroskop billeder af primære 2D spytkirtel sektion kulturer afslører tilstedeværelsen af levedygtige væv i op til 30 dages kultur under alle koncentrationer af serum tilskud testet. Den proliferative kapacitet af disse repræsentative dyrkede skiver blev vurderet af Ki-67 immunostaining og denne markør blev observeret på alle tidspunkter evalueret. Et lavt niveau af Cleaved Caspase-3 positive celler blev også observeret på alle tidspunkter med en lille stigning opdaget på dag 30.E-cadherin farvning blev observeret i både submandibulære og parotideale kirtel skiver i hele 30 dages kultur periode. Glatte muskel actin-positive celler og cytoskeletal organisation blev opdaget på samme niveau i hele kulturperioden. Tilsvarende, funktionelle proteiner såsom amylase og aquaporin-5 blev også opdaget, omend på dag 14 farvning syntes at være mere granuleret.I modsætning hertil blev CD31 og TUBB3 ikke konsekvent udtrykt i hele kulturperioden i begge kirtler, hvilket tyder på, at der er en mangfoldighed af vævsbestanddele, der opretholdes i forskellige perioder i hele 30 dages kulturperioden. Bestrålede skiver i begge kirtler efterlignede lignende proliferative apoptotiske og cytoskeletale ændringer observeret in vivo. Vær forsigtig, når du flytter sektionerne fra PBS-badet i vibratomen til kulturpladen og under farvningsprocedurerne, da sektionerne er små og sarte.Sektionskulturerne kan behandles med de fleste cellelinjekulturmetoder med den ekstra fordel, at de er under forhold, der er tættere forbundet med in vivo. Vi forventer, at dette vil være en stærk teknik for andre forskere til at indarbejde i deres eksperimenter. Klingen på vibren er skarp og kan være svær at indsætte, så vær træt under håndteringen.Også trypan blå farvestof er giftigt og kræftfremkaldende, så følg alle PP retningslinjer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal Submandibularis Gland Instillation og Lokaliseret Fraktioneret Bestråling i en rotte model af spyt hypofunktion

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generation af Microtumors Brug 3D Menneskelig Biogel Kultur System og Patient-afledte glioblastomaceller for Kinomic Profilering and Drug respons Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Udtømning af Mouse Celler fra Humane tumorxenoplantater Markant Forbedrer Downstream Analyse af Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Stråling planlægning assistent - en strømlinet, fuldautomatisk strålebehandling behandling planlægning System

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Murine spyt funktionel vurdering via pilocarpin Stimulation følgende fraktioneret stråling

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Målrettet og selektiv behandling af pluripotente stamceller-afledt Teratomer ved hjælp af ekstern strålebehandling i et lille dyr Model

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...