Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Ce travail a été appuyé en partie par le financement pilote fourni par l’Université de l’Arizona Bureau de la recherche et de la découverte et instituts nationaux de la santé (R01 DE023534) à Kirsten Limesand. La bourse de formation en biologie du cancer, T32CA009213, a fourni un soutien à l’allocation pour Wen Yu Wong. Les auteurs aimeraient remercier M. Rice pour sa précieuse contribution technique.

1. préparation du vibratome
<ol><li>Vaporisez des composants détachables du vibratome, y compris le plateau tampon, l’attachement de la lame, le moule de bloc d’d’agarose, et le film de laboratoire avec 70% d’éthanol, puis stériliser UV pendant au moins 30 min.</li>
	<li>Placez et fixez une feuille supplémentaire de film de laboratoire sur le plateau de tampon pour empêcher la glace de tomber dedans.</li>
	<li>Remplissez la chambre de glace avec de la glace pilée, enlevez le film de laboratoire du platea...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. 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W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

La recherche sur les glandes salivaires a utilisé un certain nombre de modèles de culture, y compris des cultures 2-D immortalisées, des cultures 2-D primaires, des cultures de salisphères 3-d et des cultures d’organes 3-D issues d’explants embryonnaires pour déterminer les questions sur la biologie et la physiologie sous-jacentes. Ces modèles de culture ont donné des informations perspicaces dans un éventail varié de questions de recherche et continueront d’être des outils importants dans la recherche sa...

La fonction de glande salivaire appropriée est essentielle à la santé bucco-dentaire et est altérée après le traitement du cancer de la tête et du cou avec la radiothérapie1. En 2017, près de 50 000 nouveaux cas de cancer de la tête et du cou ont été signalés aux États-Unis2. En raison des effets nocifs tissulaires et souvent irréversibles de la radiothérapie sur les tissus normaux environnants tels que les glandes salivaires, les patients sont souvent laissés avec des effets secondaires sévères et une qualité de vie diminuée2,3, 4. les autres. Les complications courantes causées par les radiations se manifestent par des symptômes tels que la xérostomie (le sentiment subjectif de la bouche sèche), les caries dentaires, la capacité altérée de mâcher et d’avaler, les troubles de la parole et les microbiomes oraux infectés2, 3 les trois , 4. ces symptômes collectivement peuvent conduire à la malnutrition et à la survie altérée chez les personnes touchées5. Alors que le dysfonctionnement de la glande salivaire dans cette population a été bien documenté, les mécanismes sous-jacents de dommages aux cellules acineuses ont été contestés, et il y a peu d’intégration parmi les différents modèles animaux6,7.
Les méthodes actuelles d’étude de la fonction des glandes salivaires et des dommages induits par les radiations comprennent l’utilisation de modèles in vivo, de lignées cellulaires immortalisées, de cultures de cellules primaires bidimensionnelles (2d) et de cultures tridimensionnelles (3-D) de salisphères8, 9,10,11,12. Traditionnellement, les modèles de culture cellulaire des lignées cellulaires immortalisées et des cultures 2D impliquent des cellules monocouches cultivées sur des surfaces planes et sont précieuses pour une expérimentation rapide, facile et rentable. Cependant, les conditions de culture de cellules artificielles peuvent altérer l’état de différenciation et les réponses physiologiques des cellules exposées à diverses conditions, et les résultats ne parviennent souvent pas à se traduire en modèles d’organismes entiers14,15. En outre, les cultures cellulaires immortalisées nécessitent une modulation de l’activité de la culture, ce qui est essentiel pour la réponse de la glande salivaire aux dégâts de l’ADN16,17.
les cultures de salisphères 3-D sont enrichies pour les cellules souches et progénitrices aux premiers moments de la culture et ont été utiles pour comprendre la radiosensibilité de ce sous-ensemble de cellules de glandes salivaires9,18. Une limitation critique de tous ces modèles de culture est qu’ils sont inefficaces dans la visualisation de la structure 3D de la glande salivaire, y compris la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule sur diverses couches, qui sont cruciales dans la modulation salivaire la sécrétion15. La nécessité d’une méthode qui englobe le comportement du tissu dans son ensemble, mais peut également être manipulé dans des conditions de laboratoire pour étudier les effets du traitement est nécessaire pour découvrir plus loin les mécanismes sous-jacents de la glande salivaire induite par rayonnement dysfonction.
La culture et la sectionnement des tissus vivants ont été documentées antérieurement19,20 et sont souvent utilisées pour étudier les interactions cerveau-tissu21. Dans des études antérieures, le tissu de la glande salivaire parotide (PAR) des souris a été sectionné à environ 50 μM et cultivé jusqu’à 48 h, et l’analyse de la viabilité, de la mort cellulaire et de la fonction a été effectuée par la suite19. Su et coll. (2016) a élargi cette méthodologie en cultivant les glandes sous-mandibulaires humaines (SMGs) sectionnées à 35 μm ou 50 μM pendant 14 jours20. La méthode proposée est une avancée en ce qu’elle comprend à la fois les glandes salivaires parotidiques et sous-mandibulaires sectionnées à 50 μM et 90 μm et l’évaluation des cultures pendant 30 jours. La capacité de couper une gamme d’épaisseur tissulaire est importante dans l’évaluation des interactions cellule-cellule et cellules-ECM qui sont pertinentes pour les processus cellulaires, y compris la polarité apical-basolatérale et l’innervation pour la sécrétion. En outre, les tranches de glandes salivaires ont été irradiées alors qu’elles étaient en culture pour déterminer la faisabilité de ce modèle de culture pour étudier les dommages causés par la glande salivaire induite par le rayonnement.
Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Pour déterminer les sections de temps maximales qui sont viables post-dissection, coloration bleu trypan, coloration des cellules vivantes, et la coloration immunohistochimique pour la mort cellulaire ont été effectuées. La microscopie confocale et la coloration immunofluorescente ont été utilisées pour évaluer les populations cellulaires spécifiques, les structures morphologiques et les niveaux de prolifération. Les cultures des sections tissulaires ont également été exposées à des rayonnements ionisants pour déterminer les effets du rayonnement sur divers marqueurs dans ce modèle 3D. L’induction de la mort cellulaire, la perturbation du cytosquelette, la perte de marqueurs de différenciation et la prolifération compensatoire dans les cultures ex vivo irradiées ont été comparées à des études antérieures de modèles in vivo. Cette méthodologie fournit un moyen d’étudier le rôle des interactions cellulaires-cellules suite aux dommages causés par les radiations et fournit un modèle expérimental pour évaluer efficacement l’efficacité des interventions thérapeutiques (manipulations géniques ou agents pharmacologiques ) qui peuvent être moins adaptés aux modèles in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

L’hyposalivation et la xérostomie créent des complications orales chroniques qui diminuent la qualité de vie chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou qui sont traités par radiothérapie. Les approches expérimentales de la compréhension des mécanismes du dysfonctionnement et de la restauration des glandes salivaires se sont concentrées sur des modèles in vivo, qui sont handicapés par l’incapacité de dépistage systématique des candidats thérapeutiques et d’efficacité dans la transfection capacité à manipuler des gènes spécifiques. Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Nous avons utilisé la coloration immunofluorescente et la microscopie confocale pour déterminer quand des populations de cellules et des marqueurs spécifiques sont présents au cours d’une période de culture de 30 jours. En outre, les marqueurs cellulaires précédemment rapportés dans les modèles de rayonnement in vivo sont évalués dans les cultures qui sont irradiées ex vivo. Pour aller de l’avant, cette méthode est une plate-forme attrayante pour l’évaluation ex vivo rapide des réponses tissulaires de la glande salivaire et humaine aux agents thérapeutiques qui améliorent la fonction salivaire.

Les cultures primaires 2D sont cultivées dans des milieux additionnés de sérum bovin (FBS), tandis que la culture des salisphères 3-D primaires est généralement cultivée dans des conditions exemptes de sérum10,11. En outre, les deux études antérieures utilisant des cultures de vibratome des glandes salivaires ont cultivé leurs sections dans 0% ou 10% FBS additionnés de medias19,<sup c...

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Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

L’utilisation de cultures organotypiques tridimensionnelles pour visualiser la morphologie et les marqueurs fonctionnels des glandes salivaires peut donner de nouvelles perspectives sur les mécanismes des lésions des tissus après rayonnement. Décrit ici est un protocole à la section, culture, irradier, tache, et l’image des sections de glande salivaire d’épaisseur 50 – 90 μM avant et après l’exposition aux rayonnements ionisants.

Traitement par rayonnement des cultures organotypiques de modèles de glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides clés caractéristiques in vivo

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Ce protocole permet l’évaluation des interactions cellule à cellule entre divers types de cellules dans un tissu, et des manipulations moléculaires et pharmacologiques ex vivo qui seraient moins faisables in vivo. Le principal avantage de cette technique est la période prolongée pendant que ces sections tissulaires pourraient être maintenues dans la culture permettant leur évaluation à des moments ultérieurs. Cette technique permettra un dépistage plus rapide des composés thérapeutiques pour corriger les dommages causés par les glandes salivaires et réduira probablement le nombre de souris utilisées pour ces études.Nous prévoyons d’utiliser cette technique pour comprendre la réponse des glandes salivaires à la radiothérapie à des moments intermédiaires et pour activer et désactiver les gènes à intervalles spécifiques. L’aspect le plus difficile de cette procédure est la sectionnement des tissus et la prévention de la perte de sections tissulaires pendant la culture et les étapes de coloration. Avant de commencer la procédure désinfecter les composants vibratomes détachables avec 70% d’éthanol, suivie d’une stérilisation UV pendant au moins 30 minutes.Fixez une feuille supplémentaire de film de laboratoire au-dessus du plateau tampon pour empêcher la glace de tomber et remplissez la chambre de glace de glace concassée. Retirez le film de laboratoire du plateau tampon et remplissez le plateau tampon de 100 millilitres de PBS glacé complété par de l’ampicilline de streptomycine à 1 %, ou PSA. Placez ensuite une lame de rasoir en acier inoxydable dans le porte-lames et utilisez un tournevis pour faciliter l’ajustement de l’angle de la lame.Après avoir isolé les glandes salivaires, placez le tissu récolté dans un plat stérile de culture de 30 millimètres contenant deux millilitres de PBS glacé complété par 1% de PSA. À l’aide de forceps autoclavés, transférer les glandes au fond de la moisissure d’intégration et couvrir le tissu avec liquide 3% faible point de fusion agarose. À l’aide de forceps, réglez le tissu au milieu du bloc dans le plan approprié et placez le bloc d’agarose sur la glace pendant 10 minutes.Lorsque l’agarose s’est durcie, faites glisser soigneusement une lame de rasoir autour du bord extérieur du moule et laissez le bloc glisser sur le film de laboratoire stérilisé aux UV. Utilisez la lame de rasoir pour découper une boîte d’agarose contenant la glande salivaire, en prenant soin que le plan de la section est droit et parallèle au côté opposé du bloc. Utilisez le superglue pour fixer le bloc à la surface de coupe et obtenir 50 ou 90 sections micrométriques d’épaisseur sur le vibratome à une vitesse de 0,075 millimètre par seconde à une fréquence de 100 hertz.Ensuite, utilisez un pinceau autoclavé cheveux naturels pour transférer les sections dans les puits individuels d’un plat de culture de tissu de 24 puits contenant un millilitre de PBS glacé par ainsi qu’ils sont obtenus. Lorsque toutes les sections ont été acquises, utilisez et autoclaved micro spatule pour transférer les sections en inserts individuels de membrane de taille de coulée de 0,4 micromètre dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits contenant 300 microlitres de milieu de culture vibratome par puits. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité, rafraîchissez le milieu au fond de chaque puits et ajoutez 40 microlitres d’inserts moyens à la membrane tous les deux jours au besoin pendant une température jusqu’à 30 jours.Pour irradier les tissus, transférez les sections à l’installation de l’irradiateur dans un contenant recouvert de polystyrène afin d’éviter les fluctuations de température et de traiter les sections avec une seule dose de rayonnement de cinq grades. Retournez ensuite les cultures dans un incubateur de culture tissulaire sans rayonnement. Pour la coloration des tissus par anticorps, lavez les échantillons avec au moins deux lavages de cinq minutes dans le PBS stérile et fixez les sections en paraformaldéhyde de 4 % à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin laver les sections trois fois avec PBS complété avec 1% albumine sérique bovine et 0,1%Triton X-100, ou PBT, avant de perméabiliser les tissus avec 0,3%Triton X-100 en PBS pendant 30 minutes. Lavez les sections trois fois dans PBT comme démontré avant de bloquer n’importe quelle liaison non spécifique avec l’agent de blocage complété avec le sérum normal de chèvre de 1% pendant une heure. Puis incuber les sections pendant la nuit dans l’anticorps primaire approprié d’intérêt.Les images lumineuses de microscope de champ lumineux des cultures primaires de section salivaire de glande 2D révèlent la présence des tissus viables pendant jusqu’à 30 jours de culture sous toutes les concentrations de supplémentation de sérum examinées. La capacité proliférative de ces tranches de culture représentatives a été évaluée par immunostaining de Ki-67 et ce marqueur a été observé à tous les points de temps évalués. Un faible niveau de cellules positives Cleaved Caspase-3 a également été observé à tous les points de temps avec une petite augmentation détectée au jour 30.La coloration d’E-cadherin a été observée dans les tranches submandibulaires et parotides de glande tout au long de la période de culture de 30 jours. Les cellules actin-positives lisses de muscle et l’organisation cytosquelettique ont été détectées aux niveaux semblables tout au long de la période de culture. De même, des protéines fonctionnelles telles que l’amylase et l’aquaporine-5 ont également été détectées, bien qu’au jour 14 la coloration ait semblé être plus granulaire.En revanche, CD31 et TUBB3 n’ont pas été systématiquement exprimés tout au long de la période de culture dans les deux glandes, ce qui suggère qu’il existe une diversité de constituants tissulaires maintenus pendant différentes périodes de temps tout au long de la période de culture de 30 jours. Les tranches irradiées dans les deux glandes ont imité les changements apoptotiques et cytosquelettiques proliférants semblables observés in vivo. Soyez prudent lorsque vous déplacez les sections du bain PBS dans le vibratome à la plaque de culture et pendant les procédures de coloration car les sections sont petites et délicates.Les cultures de section peuvent être traitées avec la plupart des méthodes de culture de lignée cellulaire avec l’avantage supplémentaire d’être dans des conditions qui sont plus étroitement liées à in vivo. Nous prévoyons qu’il s’agit d’une technique puissante que d’autres chercheurs pourraient intégrer à leurs expériences. La lame sur le vibratome est forte et peut être difficile à insérer afin d’être fatigué lors de la manipulation.Aussi trypan colorant bleu est toxique et cancérigène alors suivez toutes les directives PP.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Canulation de la glande salivaire sous-maxillaire de la souris via le conduit de Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Recherche

Médecine

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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Dans l&#39;imagerie de bioluminescence in vivo de la tumeur Dynamics hypoxie des métastases cérébrales du cancer du sein dans un modèle murin

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Collecte de salive et de mesure du cortisol salivaire et l&#39;alpha-amylase dans Frail communautaires résidant personnes âgées par les aidants familiaux

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Etudier le cancer du pancréas Stem Cell Caractéristiques pour le développement de nouvelles stratégies de traitement

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal Submandibulaire Gland instillation et Localized Fractionnée Irradiation dans un modèle de rat de salivaire Hyposécrétion

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

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Appauvrissement des cellules de souris de xénogreffes de tumeurs humaines améliore de manière significative l&#39;analyse en aval des cellules cibles

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Murine salivaire évaluation fonctionnelle par l’intermédiaire de Pilocarpine Stimulation suit fractionnés rayonnement

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Traitement ciblé et sélectif des tératomes de dérivé de cellules souches pluripotentes à l’aide de radiothérapie externe dans un modèle de petits animaux

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...