Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unter anderem durch die Pilotförderung unterstützt, die das Office of Research and Discovery and National Institutes of Health (R01 DE023534) an Kirsten Limesand zur Verfügung stellte. Der Cancer Biology Training Grant, T32CA009213, hat Wen Yu Wong unterstützt. Die Autoren danken M. Rice für seinen wertvollen technischen Beitrag.

1. Zubereitung von Vibrationen
<ol><li>Sprühbare, abnehmbare Bauteile des Vibratoms inklusive Puffertablett, Messerbefestigung, Acharo-Blockform und Laborfolie mit 70% Ethanol, dann UV-Sterilize für mindestens 30 min.</li>
	<li>Legen und sichern Sie ein zusätzliches Blatt Laborfolie über das Puffertablett, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt.</li>
	<li>Füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis, entfernen Sie die Laborfolie aus dem Puffertablett und füllen Sie das Puffertablett mit 100 ml eiskalter 1x Pho...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

Die Speicheldrüsenforschung hat eine Reihe von Kulturmodellen genutzt, darunter verewigte 2-D-Kulturen, primäre 2-D-Kulturen, 3-D-Salisphere-Kulturen und 3-D-Organkulturen von embryonalen Explanten, um Fragen zur zugrunde liegenden Biologie und Physiologie zu klären. Diese Kulturmodelle haben in einer Vielzahl von Forschungsfragen aufschlussreiche Informationen geliefert und werden auch in Zukunft wichtige Werkzeuge in der Speichelforschung sein. Zu den Grenzen dieser Kulturmodelle gehören die Modulation der p53-Akti...

Die richtige Speicheldrüsenfunktion ist für die Mundgesundheit von entscheidender Bedeutung und wird nach der Kopf-und Nackenkrebsbehandlung mit der Strahlentherapie1 verändert. 2017 wurden in den USA 2 knapp 50.000 neue Fälle von Kopf-und Nackenkrebsgemeldet. Aufgrund der gewebeschädigenden und häufig irreversiblen Auswirkungen der Strahlentherapie auf umgebende normale Gewebe wie Speicheldrüsen sind die Patienten oft mit schweren Nebenwirkungen und verminderter Lebensqualität2,3, 4. Platz Häufige Komplikationen, die durch Strahlenschäden verursacht werden, manifestieren sich in Symptomen wie Xerostomie (das subjektive Gefühl des trockenen Mundes), Zahnkaries, Beeinträchtigung der Fähigkeit zu kauen und zu schlucken,Sprachbeeinträchtigungen und kompromittierten Mundmikrobiomes 2, 3 , 4. Diese Symptome können kollektiv zu Unterernährung und Beeinträchtigung des Überlebens bei betroffenen Personen führen 5. Während die Speicheldrüsenfunktionsstörungen in dieser Population gut dokumentiert sind, wurden die zugrundeliegenden Mechanismen der Schädigung von Akinarzellen bestritten, und es gibt kaum Integration zwischen den verschiedenen Tiermodellen6,7.
Die aktuellen Methoden zur Untersuchung der Speicheldrüsenfunktion und der strahlenbedingten Schädigung umfassen die Verwendung von In-vivo-Modellen, verewigten Zelllinien, zweidimensionalen (2-D) Primärzellkulturen und dreidimensionalen (3-D) Salisphere-Kulturen8, 9,10,11,12. Traditionell sind Zellkulturmodelle aus verewigten Zelllinien und 2-D-Kulturen einschichtige Zellen, die auf flachen Oberflächen kultiviert werden und für schnelles, einfaches und kostengünstiges Experimentieren wertvoll sind. Künstliche Zellkultur-Bedingungen können jedoch den Differenzierungsstatus und die physiologischen Reaktionen von Zellen verändern, die verschiedenen Bedingungen ausgesetzt sind, und die Ergebnisse können oft nicht auf ganze Organorganismus-Modelle14,15übersetzen. Darüber hinaus benötigen verewigte Zellkulturen eine Modulation der p53-Aktivität, was für die Reaktion der Speicheldrüse auf DNA-Schäden16,17entscheidendist.
3-D Salisphere Kulturen sind für Stamm-und Vorläuferzellen in der frühen Zeit Punkte in der Kultur angereichert und waren nützlich, um die Radiosensibilität dieser Untergruppe von Speicheldrüsenzellen9,18zuverstehen. Eine kritische Einschränkung all dieser Kulturmodelle ist, dass sie bei der Visualisierung der 3-D-Struktur der Speicheldrüse, einschließlich der extrazellulären Matrix (ECM) und Zellzellinteraktionen über verschiedene Schichten, die bei der Modulation von Speichelvarianten entscheidend sind, wirkungslos sind. Sekretion15. Die Notwendigkeit einer Methode, die das Verhalten des Gewebes als Ganzes umfasst, aber auch unter Laborbedingungen manipuliert werden kann, um die Auswirkungen der Behandlung zu untersuchen, ist notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen der strahleninduzierten Speicheldrüse weiter zu entdecken. fehlfunktion.
Die Lebendgeweb-Sektionierung und-kultur wurde bereits19,20 dokumentiertund wird häufig zur Untersuchung von Gehirngewebeinteraktionen21verwendet. In früheren Studien wurde Parotid (PAR) Speicheldrüsengewebe von Mäusen auf etwa 50 μm abgetrennt und für bis zu 48 Stunden kultiviert, und die Analyse der Lebensfähigkeit, des Zelltodes und der Funktion wurde danach19durchgeführt. Su et al. (2016) erweiterte diese Methodik durch die Kultivierung der menschlichen submandibulären Drüsen (SMGs), die für 14 Tage auf 35 μm oder50 μm verteilt sind. 20 Tage lang wurden sie mit 35 μm oder 50 μm abgetrennt. Die vorgeschlagene Methode ist insofern ein Fortschritt, als sie sowohl parotide als auch submandibuläre Speicheldrüsen umfasst, die mit 50 μm und 90 μm abgetrennt sind und die Kulturen 30 Tage lang auswerten. Die Fähigkeit, einen Bereich der Gewebedicke zu schneiden, ist wichtig bei der Bewertung von Zellzell-und Zell-ECM-Interaktionen, die für zelluläre Prozesse relevant sind, einschließlich apical-Basolateralpolarität und Innervation für die Sekretion. Darüber hinaus wurden die Speicheldrüsenscheiben bestrahlt, während sie in der Kultur die Machbarkeit dieses Kulturmodells zur Untersuchung von strahlenbedingten Speicheldrüsenschäden feststellen konnten.
Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Um die maximalen Zeitabschnitte zu bestimmen, die nach der Trennung lebensfähig sind, wurden trypan-Blau-Färbung, lebende Zellfärbung und immunhistochemische Färbung für den Zelltod durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie und die immunfluoreszierende Färbung wurden eingesetzt, um bestimmte Zellpopulationen, morphologische Strukturen und Proliferationsniveaus zu bewerten. Auch die Gewebeschnittkulturen waren ionisierender Strahlung ausgesetzt, um die Auswirkungen der Strahlung auf verschiedene Marker in diesem 3-D-Modell zu bestimmen. Die Induktion des Zelltodes, die Zytoskelettstörung, der Verlust von Differenzierungsmarkern und die Kompensationsvermehrung in bestrahlten Ex-vivo-Kulturen wurden mit früheren Studien von in vivo-Modellen verglichen. Diese Methodik bietet ein Mittel, um die Rolle von Zellzellinteraktionen nach Strahlenschäden zu untersuchen und stellt ein experimentelles Modell zur Verfügung, um die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen (Genmanipulationen oder pharmakologische Wirkstoffe) effizient zu bewerten. ), die für in vivo Modellen weniger geeignet sein können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Hyposalivation und Xerostomia erzeugen chronische orale Komplikationen, die die Lebensqualität bei Kopf-und Nackenkrebspatienten, die mit Strahlentherapie behandelt werden, verringern. Experimentelle Ansätze zum Verständnis von Mechanismen der Speicheldrüsenfunktionsstörungen und Restaurationen haben sich auf in vivo-Modellen konzentriert, die durch die Unfähigkeit, therapeutische Kandidaten und Effizienz in der Transfektion systematisch zu untersuchen behindert werden, behindert werden. Fähigkeit, bestimmte Gene zu manipulieren. Der Zweck dieses Speicheldrüsen-organotypischen Kulturprotokolls ist es, die maximale Zeit der Kulturlebensfähigkeit zu bewerten und zelluläre Veränderungen nach der Behandlung ex vivo zu charakterisieren. Wir haben die immunfluoreszierende Färbung und die konfokale Mikroskopie eingesetzt, um festzustellen, wann bestimmte Zellpopulationen und Marker während einer 30-tägigen Kulturperiode vorhanden sind. Darüber hinaus werden in vivo Strahlungsmodelle in Kulturen ausgewertet, die ex vivo bestrahlt werden. Diese Methode, die sich vorwärts bewegt, ist eine attraktive Plattform für die schnelle Ex-vivo-Bewertung von Murin-und menschlichen Speichelgewebe Reaktionen auf therapeutische Wirkstoffe, die Speichelfunktion verbessern.

Primär werden 2-D-Kulturen in fetalem Rinderserum (FBS) angebaut, die Medien ergänzen,währenddie primäre 3-D-Salisphere-Kultur typischerweise unter serumfreien Bedingungen10,11kultiviert wird. Darüber hinaus haben die beiden vorhergehenden Studien, die Vibratomkulturen aus Speicheldrüsen verwendeten, ihre Abschnitte in 0% oder 10% FBS kultiviert,dieMedien19,20ergänzt</sup...

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Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Durch die Verwendung dreidimensionaler organotypischer Kulturen zur Visualisierung der Morphologie und funktionellen Marker von Speicheldrüsen können neue Einblicke in die Mechanismen von Gewebeschäden nach Strahlung gegeben werden. Hier wird ein Protokoll zu den Abschnitten, Kultur, Bestrahlung, Fleck und Bild 50 – 90 μm dicken Speicheldrüsenabschnitten vor und nach der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung beschrieben.

Strahlenbehandlung von organischen Kulturen aus Submandibulären und Parotid-Salivarienmodels Schlüssel in Vivo-Leiten

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Auswertung von Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes und ex vivo molekularen und pharmakologischen Manipulationen, die in vivo weniger möglich wären. Der Hauptvorteil dieser Technik ist der längere Zeitraum, in dem diese Gewebeabschnitte in der Kultur beibehalten werden könnten, so dass ihre Bewertung zu späteren Zeitpunkten möglich ist. Diese Technik wird ein schnelleres Screening von therapeutischen Verbindungen ermöglichen, um Speicheldrüsenschäden zu korrigieren und wird wahrscheinlich die Anzahl der Mäuse reduzieren, die für diese Studien verwendet werden.Wir planen, diese Technik zu verwenden, um die Speicheldrüsenreaktion auf Diebstrahlung zu Zwischenzeitpunkten zu verstehen und Gene in bestimmten Intervallen ein- und auszuschalten. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Gewebesektion und verhindert den Verlust von Gewebeabschnitten während der Kultur- und Färbeschritte. Vor Beginn des Verfahrens desinfizieren Sie die abnehmbaren Vibram-Komponenten mit 70% Ethanol, gefolgt von einer UV-Sterilisation für mindestens 30 Minuten.Sichern Sie eine zusätzliche Platte Laborfolie über der Pufferschale, um zu verhindern, dass Eis hereinfällt, und füllen Sie die Eiskammer mit zerkleinertem Eis. Entfernen Sie die Laborfolie aus der Pufferschale und füllen Sie die Pufferschale mit 100 Millilitereiskaltem PBS, ergänzt mit 1%Penicillin Streptomycin Ampicillin oder PSA. Legen Sie dann eine Rasierklinge aus Edelstahl in den Klingenhalter und verwenden Sie einen Schraubendreher, um die Einstellung des Winkels der Klinge zu erleichtern.Nach der Isolierung der Speicheldrüsen, legen Sie das geerntete Gewebe in eine sterile 30-Millimeter-Kulturschale mit zwei Millilitereis-kalte PBS mit 1%PSA ergänzt. Mit autoklavierten Zangen, übertragen Sie die Drüsen auf den Boden der Einbettform und bedecken Sie das Gewebe mit flüssigen 3%niedriger Schmelzpunkt Agarose. Mit Zangen, stellen Sie das Gewebe auf die Mitte des Blocks in der entsprechenden Ebene, und legen Sie den Agarose-Block auf Eis für 10 Minuten.Wenn die Agarose gehärtet ist, führen Sie vorsichtig eine Rasierklinge um den äußeren Rand der Form und lassen Sie den Block auf den UV-sterilisierten Laborfilm gleiten. Verwenden Sie die Rasierklinge, um eine Agarose-Box mit der Speicheldrüse auszuschneiden, wobei darauf geachtet wird, dass die Ebene des Abschnitts gerade und parallel zur gegenüberliegenden Seite des Blocks ist. Verwenden Sie Superkleber, um den Block an der Schnittfläche zu befestigen und 50 oder 90 Mikrometer dicke Abschnitte am Vibratom mit einer Geschwindigkeit von 0,075 Millimetern pro Sekunde bei einer 100-Hertz-Frequenz zu erhalten.Dann verwenden Sie einen autoklavierten natürlichen Haarpinsel, um die Abschnitte in einzelne Brunnen einer 24 Brunnen-Gewebekulturschale zu übertragen, die einen Milliliter eiskalte Se-PBS pro Brunnen enthält, wie sie erhalten werden. Wenn alle Abschnitte erworben wurden, verwenden und autoklavierten Mikrospachtel, um die Abschnitte in einzelne 0,4 Mikrometer Gießgröße Membraneinsätze in jedem Brunnen einer 24 Brunnengewebe kulturplatte mit 300 Mikroliter Vibratome Kulturmedium pro Brunnen zu übertragen. Dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator mit Feuchtigkeit, erfrischen Sie das Medium in der Unterseite jedes Brunnens, und fügen Sie 40 Mikroliter Medium auf die Membran Einsätze jeden zweiten Tag, wie für bis zu 30 Tage benötigt.Um das Gewebe zu bestrahlen, übertragen Sie die Abschnitte in einem abgedeckten Styroporbehälter zur Bestrahlung der Strahlenanlage, um Temperaturschwankungen zu vermeiden und die Abschnitte mit einer einzigen fünfstufigen Strahlendosis zu behandeln. Dann kehren Sie die Kulturen zu einem strahlungssicheren Gewebekultur-Inkubator zurück. Für die Antikörperfärbung der Gewebeabschnitte die Proben mit mindestens zwei fünfminütigen Waschungen in sterilem PBS waschen und die Abschnitte in 4% Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius über Nacht fixieren.Am nächsten Morgen waschen Sie die Abschnitte dreimal mit PBS ergänzt mit 1%rinder Serumalbumin und 0.1%Triton X-100, oder PBT, bevor die Gewebe mit 0.3%Triton X-100 in PBS für 30 Minuten permeabilisieren. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBT, wie gezeigt, bevor Sie jede unspezifische Bindung mit Blockiermittel blockieren, die mit 1% normalem Ziegenserum für eine Stunde ergänzt werden. Dann inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in den entsprechenden primären Antikörper von Interesse.Helle Feldmikroskopbilder von primären 2D Speicheldrüsenabschnittskulturen zeigen das Vorhandensein von lebensfähigen Geweben für bis zu 30 Tage Kultur unter allen Konzentrationen der getesteten Serumergänzung. Die proliferative Kapazität dieser repräsentativ kultivierten Scheiben wurde durch Ki-67-Immunostainierung bewertet und dieser Marker wurde zu allen Zeitpunkten beobachtet. Ein niedriger Gehalt an Cleaved Caspase-3-positiven Zellen wurde auch zu allen Zeitpunkten beobachtet, wobei ein kleiner Anstieg an Tag 30 festgestellt wurde.E-Cadherin Färbung wurde sowohl in der submandibulären und Ohrspeicheldrüsenscheiben während der 30-Tage-Kulturperiode beobachtet. Glatte Muskel-Actin-positive Zellen und zytoskelettale Organisation wurden auf ähnlichen Ebenen während der gesamten Kulturperiode nachgewiesen. In ähnlicher Weise wurden auch funktionelle Proteine wie Amylase und Aquaporin-5 nachgewiesen, obwohl am 14. Tag die Färbung granularer zu sein schien.Im Gegensatz dazu wurden CD31 und TUBB3 während der gesamten Kulturperiode in beiden Drüsen nicht einheitlich ausgedrückt, was darauf hindeutet, dass es eine Vielfalt von Gewebebestandteilen gibt, die während des 30-tägigen Kulturzeitraums für unterschiedliche Zeiträume gepflegt werden. Bestrahlte Scheiben in beiden Drüsen imitierten ähnliche proliferative apoptotische und zytoskelettale Veränderungen, die in vivo beobachtet wurden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Abschnitte vom PBS-Bad im Vibratome auf die Kulturplatte und während der Färbungsverfahren bewegen, da die Abschnitte klein und empfindlich sind.Die Schnittkulturen können mit den meisten Zelllinienkulturmethoden behandelt werden, mit dem zusätzlichen Vorteil, unter Bedingungen zu sein, die enger mit in vivo verwandt sind. Wir gehen davon aus, dass dies eine leistungsstarke Technik für andere Forscher sein wird, um sie in ihre Experimente zu integrieren. Die Klinge auf dem Vibratom ist scharf und kann schwierig sein, so müde bei der Handhabung zu setzen.Auch Trypan-Blaufarbstoff ist giftig und krebserregend, also folgen Sie allen PP-Richtlinien.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Kanülierung der Maus Submandibular Speicheldrüsen über die Wharton-Gang

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Forschung

Medizin

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal Submandibulardrüse Einträufeln und Lokalisierte fraktionierten Bestrahlung in einem Rattenmodell von Speichel- Unterfunktion

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Voll automatisierter Strahlung Assistant - eine optimierte Planung Strahlentherapie Planungssystem

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Murine Speichel funktionale Bewertung über Pilocarpin Stimulation folgenden fraktioniert Bestrahlung

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...