Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מימון פיילוט שסופקו על ידי אוניברסיטת אריזונה המשרד של מחקר וגילוי והמכון הלאומי לבריאות (R01 DE023534) כדי קירסטן לימסנד. מלגת ההכשרה לביולוגיה של סרטן, T32CA009213, סיפקה תמיכה של הקצבה ון יו וונג. המחברים רוצים להודות מ ' רייס על התרומה הטכנית היקר שלו.

1. הכנת הרטט
<ol><li>ספריי להסרה רכיבים של הרטט כולל מגש המאגר, מצורף להב, כייר בלוק agarose, וסרט מעבדה עם 70% אתנול, ולאחר מכן UV-לחטא לפחות 30 דקות.</li>
	<li>מקום ולאבטח גיליון נוסף של סרט מעבדה על מגש המאגר כדי למנוע את הקרח מליפול.</li>
	<li>למלא את תא קרח עם קרח כתוש, להסיר את הסרט מעבדה ממגש המאגר, ולמלא את ...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer.">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li><li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer.">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li><li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+(chemo)radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy.">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznan&#769; and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li><li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation:+from+animal+models+to+therapies.">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li><li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands.">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing.">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis.">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li><li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding.">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death &amp; Disease. 1, (2010).</li><li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands.">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li><li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland.">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands:+the+slice+culture+model.">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li><li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome.">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

מחקר בלוטת הרוק השתמשו במספר דגמי תרבות, כולל תרבויות דו-ממד מונצח, תרבויות דו-מימד ראשיות, תרבויות תלת-מימד, ותרבויות תלת-מימד מפני מתקנים עובריים כדי לברר שאלות על הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה. המודלים התרבותיים הללו הניבו מידע תובנה על פני מגוון מגוון של שאלות מחקר וימשיכו להיות כלים...

תפקוד תקין בלוטת הרוק חיוני לבריאות הפה והוא שונה לאחר הטיפול בראש ובצוואר הסרטן עם הקרנות1. ב 2017, כמעט 50,000 מקרים חדשים של סרטן הראש והצוואר דווחו בארצות הברית2. בשל השפעות מזיקות לעתים קרובות בלתי הפיך של טיפול בקרינה על רקמות הסביבה הרגילה כגון בלוטות הרוק, חולים הם לעתים קרובות עזבו עם תופעות לוואי חמורות ואיכות מופחתת של חיים2,3, ד. סיבוכים נפוצים נגרמת על ידי נזק הקרינה מתבטא בתסמינים כגון xerostomia (התחושה הסובייקטיבית של הפה היבש), עששת, היכולת הלקוי ללעוס ולבלוע, דיבור ליקויים, ו מיקרובימי אוראלי פרוצים2, מיכל שלוש , 4. הסימפטומים הללו באופן קולקטיבי יכול להוביל תזונה ולקויה הישרדות אנשים מושפעים5. בעוד תפקוד בלוטת הרוק באוכלוסייה זו היתה מתועדת היטב, המנגנונים הבסיסיים של נזק לתאים acinar היו שנויות במחלוקת, ויש שילוב קטן בין דגמי בעלי חיים שונים6,7.
השיטות הנוכחיות של לימוד תפקוד בלוטת הרוק ונזק המושרה הקרינה כוללים את השימוש במודלים vivo, שורות תאים מונצח, דו מימדי (2-D) מתרבויות התא הראשי, ו תלת מימדי (3-D) התרבות הערבה8, . תשע,עשר,11,12 באופן מסורתי, מודלים של תרבות התא מקווי תאים מונצח ותרבויות דו-ממדיות כרוכות בתאים בעלי שכבות יחיד המתורבת על משטחים שטוחים והם יקרי ערך עבור ניסויים מהירים, קלים וחסכוניים. עם זאת, התנאים של תרבות התא המלאכותי יכולים לשנות את סטטוס הבידול ואת התגובות הפיסיולוגיים של תאים חשופים לתנאים שונים, והתוצאות לעתים קרובות אינן מצליחות לתרגם את כל האורגניזם מודלים14,15. בנוסף, תרביות תאים מונצח דורשים אפנון של פעילות p53, אשר קריטי עבור תגובת בלוטת הרוק נזק DNA16,17.
תרביות תלת-מימד מועשר בתאי גזע ומחולל בזמן מוקדם בתרבות ושימושיים להבנת הרגישות הרדיושל קבוצת משנה זו של תאי בלוטת הרוק9,18. מגבלה קריטית של כל המודלים האלה של התרבות היא שהם לא יעילים בהמחיש את המבנה התלת-ממדי של בלוטת הרוק, כולל מטריצה החילוץ (ECM) ואינטראקציה תא תא על פני שכבות שונות, אשר חיוניים הרוק מודלטינג הפרשה15. הצורך בשיטה המקיף את ההתנהגות של הרקמה כמכלול, אבל יכול להיות גם מניפולציות תחת תנאי מעבדה כדי ללמוד את ההשפעות של הטיפול הוא הכרחי כדי לגלות עוד את המנגנונים הבסיסיים של בלוטת הרוק המושרה קרינה תפקוד.
שימוש ברקמה חיה ותרבות כבר תועד בעבר19,20 והוא משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות רקמות המוח21. במחקרים קודמים, פרוטיד (PAR) רקמת בלוטת הרוק מפני עכברים היה מנות ב כ 50 יקרומטר ו תרבותי עבור עד 48 h, ניתוח של הכדאיות, מוות תאים, ותפקוד בוצע לאחר מכן19. . סו ואח ' (2016) הורחב במתודולוגיה זו על ידי בלוטות הלסת האנושית של culturing (smgs) בשעה 35 יקרומטר או 50 יקרומטר עבור 14 ימים20. השיטה המוצעת היא התקדמות בכך שהוא כולל בלוטות הרוק השני והלסת התחתונה מנות ב 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר והערכה של התרבויות עבור 30 ימים. היכולת לחתוך מגוון רחב של רקמות חשוב בהערכת תאים סלולריים ואינטראקציות תאים-ECM הרלוונטיות לתהליכים סלולריים, כולל קוטביות-באסולתית ושימור הפרשה. יתר על כן, פרוסות בלוטת הרוק הוקרן לקרינה בעוד בתרבות כדי לקבוע את הכדאיות של מודל זה תרבות כדי ללמוד המושרה קרינה נזק בלוטת הרוק.
המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע את מקטעי הזמן המרביים הקיימים לאחר הניתוח, הכדורית כחול, מכתים תאים חיים וכתמים אימונוהיסטוכימיה עבור מוות תאים בוצעו. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתמים מוחיסוניות מנוצלים להערכת אוכלוסיות תאים מסוימות, מבנים מורפולוגיים ורמות התפשטות. תרביות מקטע רקמות נחשפו גם לקרינה מייננת כדי לקבוע את ההשפעות של קרינה על סמנים שונים במודל זה 3-D. אינדוקציה של מוות התא, הפרעה ציטושלד, הפסד של סמנים בידול, והתפשטות הפצה בתרבויות הvivo לשעבר הקרינה היו לעומת מחקרים קודמים של במודלים vivo. מתודולוגיה זו מספקת אמצעים לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא תא בעקבות נזקי קרינה ומספק מודל ניסיוני כדי להעריך ביעילות את היעילות של התערבויות טיפוליות (מניפולציות גנים או סוכני תרופתי ) שעשוי להיות מתאים פחות למודלים vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

היפרליבציה ו xerostomia ליצור סיבוכים אוראלי כרונית הפחתת איכות החיים בראש ובחולי סרטן הצוואר אשר מטופלים עם הקרנות. הגישות הנסיוניות להבנת מנגנונים של תפקוד בלוטת הרוק ושיקום התמקדו במודלים vivo, אשר מוגבלים על ידי חוסר יכולת למסך בשיטתיות מועמדים טיפוליים ויעילות בניתוח יכולת לתמרן גנים ספציפיים. המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע מתי אוכלוסיית תאים וסמנים ספציפיים נמצאים בתקופת תרבות של 30 יום. בנוסף, סמנים סלולריים דיווחו בעבר ב vivo מודלים קרינה מוערכים בתרבויות כי הם לשעבר לקרינה vivo. מעבר קדימה, שיטה זו היא פלטפורמה אטרקטיבית עבור הערכה מהירה לשעבר vivo של murine והאדם בלוטת הרוק התגובות התגובה לסוכנים הטיפוליים לשפר את תפקוד הרוק.

התרבויות הראשיות דו-ממדיות מגודלים בסרום של שור עוברי (FBS) שיושלם מדיה בזמן שהתרבות הראשית תלת-ממדית של סליספירה מתרבות בדרך כלל בתנאים ללא נסיוב10,11. בנוסף, שני המחקרים הקודמים ניצול תרבויות הרטט מבלוטות מתוך בלוטות הרוק שלהם סעיפים 0% או 10% ...

Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.

הטיפול בקרינה של תרבויות אורגנוטימית מתוך הלסת התחתונה ובלוטות הרוק פרודה מודלים מפתח Vivo מאפיינים

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

פרוטוקול זה מאפשר הערכה של אינטראקציות בין תאים לתאים בין סוגי תאים מגוונים בתוך רקמה, ומניפולציות מולקולריות ופרמקולוגיות אקס ויוו שיהיו פחות ריאליות ב- vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרק הזמן הממושך קטעי רקמות אלה יכולים להישמר בתרבות המאפשרת את הערכתם בנקודות זמן מאוחרות יותר. טכניקה זו תאפשר סינון מהיר יותר של תרכובות טיפוליות כדי לתקן נזק בלוטת הרוק צפוי להפחית את מספר העכברים המשמשים למחקרים אלה.אנו מתכננים להשתמש בטכניקה זו כדי להבין את תגובת בלוטת הרוק להקרנות בנקודות זמן ביניים ולהדליק ולכבות גנים במרווחים ספציפיים. ההיבט הקשה ביותר של הליך זה הוא חתך הרקמה ומניעת אובדן מקטעי רקמות במהלך צעדי התרבות והכתמת. לפני תחילת ההליך לחטא את רכיבי רטט להסרה עם 70%אתנול, ואחריו עיקור UV לפחות 30 דקות.אבטחו יריעה נוספת של סרט מעבדה מעל מגש החיץ כדי למנוע מקרח ליפול פנימה, ומלאו את תא הקרח בקרח כתוש. הסירו את סרט המעבדה ממגש החיץ ומלאו את מגש החיץ ב-100 מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת 1%פניצילין סטרפטומיצין אמפיצילין, או PSA. לאחר מכן הנח סכין גילוח מפלדת אל-חלד לתוך מחזיק הלהב ולהשתמש במברג כדי להקל על התאמת זווית הלהב.לאחר בידוד בלוטות הרוק, מניחים את הרקמה שנקטפו לתוך צלחת תרבות סטרילית 30 מילימטר המכיל שני מיליליטר של PBS קר כקרח בתוספת 1%PSA. באמצעות מלקחיים autoclaved, להעביר את הבלוטות לתחתית עובש הטבעה לכסות את הרקמה עם נוזלי 3% נקודת התכה נמוכה התעוררה. באמצעות מדפים, להתאים את הרקמה לאמצע הבלוק במישור המתאים, ול מניחים את גוש אגרוז על קרח במשך 10 דקות.כאשר agarose התקשה, בזהירות להפעיל סכין גילוח סביב הקצה החיצוני של התבנית ולתת את הבלוק להחליק החוצה על סרט מעבדה מעוקר UV. השתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך תיבת אגרוז המכילה את בלוטת הרוק, דואג כי המישור של החלק הוא ישר ומקביל לצד הנגדי של הבלוק. השתמש בדבק-על כדי לחבר את הבלוק למשטח החיתוך ולקבל חלקים בעובי 50 או 90 מיקרומטר על הרטט במהירות של 0.075 מילימטר לשנייה בתדר של 100 הרץ.לאחר מכן השתמשו במברשת שיער טבעית אוטוקלאבת כדי להעביר את החלקים לתוך בארות בודדות של 24 תבשיל תרבות רקמות היטב המכיל מיליליטר אחד של PBS קר כקרח לכל כפי שהם מתקבלים. כאשר כל החלקים נרכשו, להשתמש ומרית מיקרו autoclaved להעביר את החלקים לתוך בודדים 0.4 מיקרומטר לשפוך ממברנה בגודל מוסיף בכל באר של צלחת תרבות רקמה 24 היטב המכיל 300 microliters של תרבות רטט בינוני לגם. לאחר מכן מניחים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס וחממת פחמן דו-חמצני עם לחות, מרעננים את המדיום בתחתית כל באר ומוסיפים 40 מיקרוליטרים של מדיום לממברנה מדי יומיים לפי הצורך עד 30 יום.כדי להקרין את הרקמות, להעביר את החלקים למתקן הקרנה במיכל קלקר מכוסה, כדי למנוע תנודות בטמפרטורה ולטפל בסעיפים עם מנה אחת של חמש כיתה של קרינה. ואז להחזיר את התרבויות לאיבה תרבות רקמה בטוחה קרינה. עבור כתמי נוגדנים של חלקי הרקמה, לשטוף את הדגימות עם לפחות שתי חמש דקות שטיפות PBS סטרילי לתקן את החלקים ב 4% paraformaldehyde בארבע מעלות צלזיוס לילה.למחרת בבוקר לשטוף את הקטעים שלוש פעמים עם PBS בתוספת אלבומין סרום 1%bovine ו 0.1% טריטון X-100, או PBT, לפני permeabilizing את הרקמות עם 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 30 דקות. שטפו את החלקים שלוש פעמים ב- PBT כפי שהוכח לפני חסימת כל כריכה לא ספציפית עם סוכן חסימה בתוספת 1% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת. ואז לה הדגירה את החלקים לילה בנוגדן העיקרי המתאים של עניין.תמונות מיקרוסקופ שדה בהיר של תרבויות ראשיות של בלוטת הרוק 2D לחשוף את נוכחותם של רקמות קיימא עד 30 ימים של תרבות תחת כל הריכוזים של תוספת סרום נבדק. היכולת המשגשגת של פרוסות מתורבתות מייצגות אלה הוערכה על ידי Ki-67 immunostaining וסמן זה נצפה בכל נקודות הזמן שהוערכו. רמה נמוכה של תאים חיוביים Cleaved Caspase-3 נצפתה גם בכל נקודות הזמן עם עלייה קטנה זוהה ביום 30.כתמי E-cadherin נצפו הן פרוסות בלוטת תת-מנדביאר ו parotid לאורך כל תקופת התרבות 30 יום. תאים חלקים וחיוביים לאקטין שרירים וארגון ציטוסקלטל זוהו ברמות דומות לאורך כל תקופת התרבות. באופן דומה, חלבונים פונקציונליים כגון עמילאז ואקוופורין-5 זוהו גם הם, אם כי ביום 14 הכתמים נראו גרגיריים יותר.לעומת זאת, CD31 ו- TUBB3 לא באו לידי ביטוי באופן עקבי לאורך כל תקופת התרבות בשתי הבלוטות, דבר המצביע על כך שיש מגוון של מרכיבי רקמות המתוחזקים לפרקי זמן שונים לאורך כל תקופת התרבות של 30 יום. פרוסות מוקרנות בשתי הבלוטות חיקו שינויים אפופטיים וציטוסקלים דומים שנצפו ב-vivo. היזהר בעת הזזת החלקים מהאמבטיה PBS ברטט לצלחת התרבות ובמהלך הליכי הכתם כמו החלקים קטנים ועדינים.תרבויות סעיף ניתן לטפל עם רוב שיטות תרבות קו התא עם היתרון הנוסף של להיות בתנאים הקשורים יותר in vivo. אנו צופים כי זו תהיה טכניקה רבת עוצמה עבור חוקרים אחרים לשלב בניסויים שלהם. הלהב על הרטט הוא חד והוא יכול להיות קשה להכניס כדי להיות קשה בעת הטיפול.גם לצבוע כחול trypan הוא רעיל ומסרטן אז בצע את כל ההנחיות PP.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Cannulation של בלוטת הרוק באמצעות עכבר Submandibular Duct של וורטון

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal submandibular בלוטת החדרה ונקודות מופרדות הקרנה במודל עכברים של הרוק hypofunction

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

קרינה תכנון העוזרת - מפושטת, אוטומטי לחלוטין טיפול הקרנות תכנון המערכת

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

מאתר הערכה תפקודית הרוק באמצעות בעקבות גירוי פילוקרפין Fractionated קרינה

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

טיפול ממוקד, סלקטיבי של Teratomas נגזר תאי גזע Pluripotent באמצעות קרינה חיצוני קרן במודל של חיית-קטן

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...