Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento pilota fornito dall'ufficio di ricerca e scoperta dell'Università dell'Arizona e dagli istituti nazionali di sanità (R01 DE023534) a Kirsten Limesand. La borsa di formazione per la biologia del cancro, T32CA009213, ha fornito supporto allo stipendio per Wen Yu Wong. Gli autori vorrebbero ringraziare M. Rice per il suo prezioso contributo tecnico.

1. preparazione del VIBRATOME
<ol><li>Spruzzare componenti staccabili del VIBRATOME compreso il vassoio tampone, attacco della lama, muffa blocco di agarosio, e pellicola di laboratorio con 70% etanolo, poi UV-sterilizzare per almeno 30 min.</li>
	<li>Posizionare e fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada.</li>
	<li>Riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio schiacciato, rimuovere la pellicola di laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio ...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

La ricerca sulla ghiandola salivare ha utilizzato una serie di modelli di cultura, tra cui culture 2-D immortalate, colture primarie 2-D, culture salisphere 3-D e colture di organi 3-D da espianti embrionali per accertare le domande sulla biologia e la fisiologia sottostanti. Questi modelli di cultura hanno prodotto informazioni approfondite su una vasta gamma di domande di ricerca e continueranno ad essere strumenti importanti nella ricerca salivare. I limiti di questi modelli di coltura includono la modulazione dell'at...

La corretta funzione della ghiandola salivare è essenziale per la salute orale e viene alterata dopo il trattamento del cancro della testa e del collo con la radioterapia1. In 2017, quasi 50.000 nuovi casi di cancro alla testa e al collo sono stati segnalati negli Stati Uniti2. A causa degli effetti dannosi del tessuto e spesso irreversibili della radioterapia sui tessuti normali circostanti come le ghiandole salivari, i pazienti sono spesso lasciati con gravi effetti collaterali e diminuita qualità della vita2,3, 4. per la Complicazioni comuni causate da danni da radiazioni si manifestano in sintomi come xerostomia (la sensazione soggettiva di secchezza della bocca), carie dentali, alterata capacità di masticare e deglutire, disturbi del linguaggio, e microbiomi orali compromessi2, 3 il , 4. questi sintomi collettivamente possono portare alla malnutrizione e la sopravvivenza alterata in individui colpiti5. Mentre la disfunzione della ghiandola salivare in questa popolazione è stata ben documentata, i meccanismi di fondo del danno alle cellule di acinare sono stati contestati, e c'è poca integrazione tra i diversi modelli animali6,7.
I metodi attuali per studiare la funzione della ghiandola salivare e i danni causati dalle radiazioni includono l'uso di modelli in vivo, linee cellulari immortalate, colture cellulari primarie bidimensionali (2-D) e colture di salisphere tridimensionali (3-D)8, 9,10,11,12. Tradizionalmente, i modelli di colture cellulari provenienti da linee cellulari immortalate e culture 2-D coinvolgono singole celle a strati coltivate su superfici piane e sono preziosi per sperimentazioni rapide, semplici e convenienti. Tuttavia, le condizioni di coltura delle cellule artificiali possono alterare lo stato di differenziazione e le risposte fisiologiche delle cellule esposte a varie condizioni, e i risultati spesso non riescono a tradursi in interi modelli di organismo14,15. Inoltre, le colture cellulari immortalate richiedono la modulazione dell'attività di p53, che è fondamentale per la risposta della ghiandola salivare ai danni del DNA16,17.
le colture di salisphere 3-D sono arricchite per le cellule staminali e progenitrici nei primi momenti della cultura e sono state utili per comprendere la radiosensibilità di questo sottoinsieme di cellule della ghiandola salivare9,18. Una limitazione critica di tutti questi modelli di coltura è che sono inefficaci nella visualizzazione della struttura 3D della ghiandola salivare, tra cui la matrice extracellulare (ECM) e le interazioni cellulare-cellula su vari strati, che sono cruciali nella modulazione salivare secrezione15. La necessità di un metodo che comprenda il comportamento del tessuto nel suo complesso, ma può anche essere manipolato in condizioni di laboratorio per studiare gli effetti del trattamento è necessario per scoprire ulteriormente i meccanismi di base della ghiandola salivare indotta da radiazioni Disfunzione.
Il sezionamento e la coltura dei tessuti vivi sono stati documentati in precedenza19,20 ed è spesso usato per studiare le interazioni cervello-tessuto21. Negli studi precedenti, il tessuto della ghiandola salivare parotide (PAR) dai topi è stato sezionato a circa 50 μm e coltivato fino a 48 h, e l'analisi della vitalità, della morte cellulare e della funzione è stata eseguita successivamente19. Su et al. (2016) ha ampliato questa metodologia coltivando ghiandole sottomandibolari umane (SMG) sezionate a 35 μm o 50 μm per 14 giorni20. Il metodo proposto è un progresso in quanto comprende sia le ghiandole salivari parotide che sottomandibolare sezionate a 50 μm e 90 μm e la valutazione delle colture per 30 giorni. La capacità di tagliare una gamma di spessore del tessuto è importante per valutare le interazioni cellula-cella e Cell-ECM che sono rilevanti per i processi cellulari, tra cui la polarità apicale-basolaterale e l'innervazione per la secrezione. Inoltre, le fette di ghiandola salivare sono state irradiate mentre in coltura per determinare la fattibilità di questo modello di coltura per studiare il danno della ghiandola salivare indotta da radiazioni.
Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Per determinare le sezioni temporali massime che sono vitali post-dissezione, la colorazione blu Trypan, la colorazione delle cellule vive e la colorazione immunoistochimica per la morte delle cellule sono state eseguite. La microscopia confocale e la colorazione immunofluorescente sono state utilizzate per valutare popolazioni cellulari specifiche, strutture morfologiche e livelli di proliferazione. Le colture di sezione tissutale sono state esposte anche a radiazioni ionizzanti per determinare gli effetti delle radiazioni su vari marcatori in questo modello 3-D. L'induzione della morte delle cellule, la rottura del citoscheletro, la perdita di marcatori di differenziazione e la proliferazione compensatoria nelle colture ex vivo irradiate sono state confrontate con studi precedenti di modelli in vivo. Questa metodologia fornisce un mezzo per indagare il ruolo delle interazioni delle cellule cellulari dopo il danno da radiazioni e fornisce un modello sperimentale per valutare in modo efficiente l'efficacia degli interventi terapeutici (manipolazioni genetiche o agenti farmacologici ) che possono essere meno adatte per i modelli in vivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Iposalivazione e xerostomia creano complicanze orali croniche che diminuiscono la qualità della vita nei pazienti affetti da tumore della testa e del collo che sono trattati con la radioterapia. Approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi di disfunzione e restauro della ghiandola salivare si sono concentrati su modelli in vivo, che sono portatori di handicap dall'incapacità di schermo sistematicamente candidati terapeutici ed efficienze in trasfezione capacità di manipolare geni specifici. Lo scopo di questo protocollo di coltura organotipica della ghiandola salivare è quello di valutare il tempo massimo di vitalità della cultura e caratterizzare i cambiamenti cellulari dopo il trattamento delle radiazioni ex vivo. Abbiamo utilizzato la colorazione immunofluorescente e la microscopia confocale per determinare quando specifiche popolazioni di cellule e marcatori sono presenti durante un periodo di coltura di 30 giorni. Inoltre, i marcatori cellulari precedentemente segnalati nei modelli di radiazioni in vivo sono valutati in colture che sono irradiate ex vivo. In futuro, questo metodo è una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo delle risposte del tessuto della ghiandola salivare murina e umana agli agenti terapeutici che migliorano la funzione salivare.

Le colture primarie 2-D sono coltivate nei media integrati del siero bovino fetale (FBS), mentre le colture principali di salisphere 3-D sono tipicamente coltivate in condizioni esenti da siero10,11. Inoltre, i due studi precedenti che utilizzarono le colture VIBRATOME di ghiandole salivari hanno coltivato le loro sezioni in 0% o 10% FBS completati media19,20. Le fette sot...

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Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

L'uso di colture organotipiche tridimensionali per visualizzare la morfologia e i marcatori funzionali delle ghiandole salivari può fornire nuove intuizioni sui meccanismi del danno tissutale dopo la radiazione. Qui di seguito è riportato un protocollo per sezioni, colture, irraggiamento, macchia e immagini di 50 – 90 μm di spessore di sezione della ghiandola salivare prima e dopo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

Trattamento radiante delle colture organotipiche da ghiandole salivari Sottomandibulari e parotidi modelli chiave in vivo caratteristiche

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Questo protocollo consente la valutazione delle interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule all'interno di un tessuto e manipolazioni molecolari e farmacologiche ex vivo che sarebbero meno fattibili in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica è il lungo periodo di tempo in cui queste sezioni tissutali potrebbero essere mantenute in coltura consentendo la loro valutazione in periodi di tempo successivi. Questa tecnica consentirà uno screening più rapido dei composti terapeutici per correggere i danni alla ghiandola salivare e probabilmente ridurrà il numero di topi utilizzati per questi studi.Abbiamo in programma di utilizzare questa tecnica per comprendere la risposta della ghiandola salivare alla radioterapia nei punti intermedi e per accendere e spegnere i geni a intervalli specifici. L'aspetto più difficile di questa procedura è il sessamento dei tessuti e la prevenzione della perdita di sezioni tissutali durante la coltura e le fasi di colorazione. Prima di iniziare la procedura disinfettare i componenti del vibratomo staccabili con 70%etanolo, seguiti dalla sterilizzazione UV per almeno 30 minuti.Fissare un foglio aggiuntivo di pellicola di laboratorio sul vassoio tampone per evitare che il ghiaccio cada e riempire la camera di ghiaccio con ghiaccio frantumato. Rimuovere la pellicola da laboratorio dal vassoio tampone e riempire il vassoio tampone con 100 millilitri di PBS ghiacciato integrati con 1%penicillina streptomicina ampicillina, o PSA. Quindi posizionare una lama di rasoio in acciaio inossidabile nel supporto della lama e utilizzare un cacciavite per facilitare la regolazione dell'angolo della lama.Dopo aver isolato le ghiandole salivari, posizionare il tessuto raccolto in un piatto sterile da coltura di 30 millimetri contenente due millilitri di PBS ghiacciato integrato con 1%PSA. Utilizzando le forcelle autoclavate, trasferire le ghiandole sul fondo dello stampo incorporante e coprire il tessuto con agarosio liquido a basso punto di fusione del 3%. Usando le forcelle, regolare il tessuto al centro del blocco nel piano appropriato e posizionare il blocco di agarosio sul ghiaccio per 10 minuti.Quando l'agarosio si è indurito, eseguire con cura una lama di rasoio attorno al bordo esterno dello stampo e lasciare che il blocco scivoli sul film di laboratorio sterilizzato dai raggi UV. Utilizzare la lama del rasoio per tagliare una scatola di agarosio contenente la ghiandola salivare, facendo attenzione che il piano di sezione sia dritto e parallelo al lato opposto del blocco. Utilizzare la supercolla per fissare il blocco alla superficie di taglio e ottenere sezioni spesse 50 o 90 micrometri sul vibratomo a una velocità di 0,075 millimetri al secondo a una frequenza di 100 hertz.Quindi utilizzare una spazzola per capelli naturale autoclavata per trasferire le sezioni in singoli pozzi di un piatto di coltura tissutale di 24 pozzetti contenente un millilitro di PBS ghiacciato per così come sono ottenuti. Una volta acquisite tutte le sezioni, utilizzare e autoclavare micro spatola per trasferire le sezioni in singoli inserti di membrana pour size da 0,4 micrometri in ogni pozzo di una piastra di coltura tissutale di 24 po 'contenente 300 microlitri di mezzo di coltura del vibratomo per pozzo. Quindi posizionare la piastra in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% con umidità, rinfrescando il mezzo nella parte inferiore di ogni pozzo e aggiungendo 40 microlitri di mezzo agli inserti della membrana a giorni diversi se necessario per un massimo di 30 giorni.Per irradiare i tessuti, trasferire le sezioni all'impianto di irradiatore in un contenitore coperto di polistirolo per evitare fluttuazioni di temperatura e trattare le sezioni con un'unica dose di radiazioni di cinque gradi. Quindi riportare le colture in un incubatore di coltura tissutale sicuro per le radiazioni. Per la colorazione degli anticorpi delle sezioni tissutali, lavare i campioni con almeno due lavaggi di cinque minuti in PBS sterile e fissare le sezioni in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte.La mattina successiva lavare le sezioni tre volte con PBS integrato con albumina di siero bovino all'1% e 0,1%Triton X-100, o PBT, prima di permeabilizzare i tessuti con 0,3%Triton X-100 in PBS per 30 minuti. Lavare le sezioni tre volte in PBT come dimostrato prima di bloccare qualsiasi legame non specifico con agente bloccante integrato con siero di capra normale all'1% per un'ora. Quindi incubare le sezioni durante la notte nell'anticorpo primario appropriato di interesse.Immagini al microscopio a campo brillante di colture primarie di sezione di ghiandola salivare 2D rivelano la presenza di tessuti vitali per un massimo di 30 giorni di coltura sotto tutte le concentrazioni di completamento del siero testato. La capacità proliferativa di queste fette coltivate rappresentative è stata valutata dall'immunostaining Ki-67 e questo marcatore è stato osservato in ogni momento valutato. Un basso livello di cellule positive di Caspasi-3 scisto è stato osservato in tutti i punti di tempo con un piccolo aumento rilevato al giorno 30.La colorazione dell'e-cadherina è stata osservata sia nelle fette di ghiandola sottomandibolare che in quello parotido durante il periodo di coltura di 30 giorni. Cellule positive all'actina muscolare liscia e organizzazione citoscheletricha sono state rilevate a livelli simili durante tutto il periodo di coltura. Allo stesso modo, sono state rilevate anche proteine funzionali come l'amilasi e l'acquaporina-5, anche se al giorno 14 la colorazione sembrava essere più granulare.Al contrario, CD31 e TUBB3 non sono stati costantemente espressi durante tutto il periodo della coltura in entrambe le ghiandole, suggerendo che vi sia una diversità di costituenti tissutali mantenuti per diversi periodi di tempo durante il periodo di coltura di 30 giorni. Le fette irradiate in entrambe le ghiandole imitavano simili cambiamenti proliferativi apoptotici e citoscheletrici osservati in vivo. Fare attenzione quando si spostano le sezioni dal bagno PBS nel vibratomo alla piastra di coltura e durante le procedure di colorazione in quanto le sezioni sono piccole e delicate.Le colture di sezione possono essere trattate con la maggior parte dei metodi di coltura della linea cellulare con l'ulteriore vantaggio di essere in condizioni più strettamente correlate all'in vivo. Prevediamo che questa sarà una tecnica potente per altri ricercatori da incorporare nei loro esperimenti. La lama sul vibratomo è affilata e può essere difficile da inserire, quindi sii stanco durante la manipolazione.Anche il colorante blu trypan è tossico e cancerogeno, quindi segui tutte le linee guida pp.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Incannulazione della ghiandola salivare sottomandibolare del mouse tramite il Duct Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Ricerca

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

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In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal ghiandola sottomandibolare instillazione e localizzati frazionato irradiazione in un modello murino di salivare Ipofunzione

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

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L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

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Valutazione funzionale salivare murina attraverso dopo stimolazione Pilocarpina frazionato radiazione

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Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...