Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet delvis av piloten finansiering levert av University of Arizona Office of Research and Discovery og National Institutes of Health (R01 DE023534) til Kirsten Limesand. Den Cancer biologi Training Grant, T32CA009213, forutsatt stipend støtte for Wen Yu Wong. Forfatterne vil gjerne takke M. Rice for hans verdifulle tekniske bidrag.

1. utarbeidelse av vibratome
<ol><li>Spray avtakbare komponenter av vibratome inkludert bufferbrettet, blad vedlegg, agarose blokk mold, og laboratorie film med 70% etanol, deretter UV-sterilisere i minst 30 min.</li>
	<li>Plasser og fest et ekstra ark med laboratorie film over bufferbrettet for å hindre at isen faller inn.</li>
	<li>Fyll isen kammer med knust is, fjerne laboratoriet filmen fra bufferbrettet, og fyll bufferbrettet med 100 mL iskald 1x fosfat bufret saltvann (PBS) løsning supplert med 1% penicillin-St...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer.">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li><li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer.">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li><li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+(chemo)radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy.">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznan&#769; and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li><li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation:+from+animal+models+to+therapies.">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li><li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands.">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing.">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis.">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li><li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding.">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death &amp; Disease. 1, (2010).</li><li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands.">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li><li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland.">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands:+the+slice+culture+model.">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li><li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome.">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

Spyttkjertel forskning har benyttet en rekke kultur modeller, inkludert udødeliggjort 2-D kulturer, primære 2-D kulturer, 3-D salisphere kulturer, og 3-D orgel kulturer fra embryonale explants å konstatere spørsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har gitt innsiktsfull informasjon på tvers av et variert utvalg av forskning spørsmål og vil fortsette å være viktige verktøy i spytt forskning. Begrensningene i disse kultur modellene inkluderer modulering av p53 aktivitet under immortali...

Riktig spyttkjertel funksjon er avgjørende for oral helse og endres etter hode og nakke kreft behandling med strålebehandling1. I 2017 ble nesten 50 000 nye tilfeller av hode-og nakke kreft rapportert i USA2. På grunn av vev-ødeleggende og ofte irreversible effekter av strålebehandling på omkringliggende normalt vev som spyttkjertler, pasienter er ofte igjen med alvorlige bivirkninger og redusert livskvalitet2,3, firetil. Vanlige komplikasjoner forårsaket av stråle skade manifesterer i symptomer som xerostomia (den subjektive følelsen av tørr munn), tannråte, nedsatt evne til å tygge og svelge, tale nedsatt funksjonsevne, og kompromittert oral microbiomes2, 3 andre priser , 4. disse symptomene kollektivt kan føre til underernæring og nedsatt overlevelse i berørte individer5. Mens spyttkjertel dysfunksjon i denne populasjonen har vært godt dokumentert, har de underliggende mekanismene for skade på acinar celler vært omstridt, og det er lite integrasjon mellom ulike dyremodeller6,7.
Den nåværende metoder for å studere spyttkjertel funksjon og stråling-indusert skade inkluderer bruk av in vivo-modeller, udødeliggjort cellelinjer, todimensjonal (2-D) primær cellekulturer, og tredimensjonale (3-D) salisphere kulturer8, 9,10,11,12. Tradisjonelt vil cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2D-kulturer involvere enkelt lags celler kultivert på flate overflater og er verdifulle for rask, enkel og kostnadseffektiv eksperimentering. Imidlertid kan kunstig cellekultur forhold endre differensiering status og fysiologiske reaksjoner av celler eksponert for ulike forhold, og resultatene ofte ikke å oversette til hele organismen modeller14,15. I tillegg udødeliggjort cellekulturer krever modulering av p53 aktivitet, noe som er avgjørende for spyttkjertel respons på DNA skade16,17.
3-D salisphere kulturer er beriket for Stem og stamceller ved tidlig tidspunkt i kultur og har vært nyttig for å forstå radiosensitivity av denne undergruppe av spyttkjertel celler9,18. En kritisk begrensning av alle disse kultur modeller er de er ineffektive i å visualisere 3-D strukturen i spyttkjertel, inkludert ekstracellulære matrise (ECM) og celle-celle interaksjoner over ulike lag, som er avgjørende i modulerende spytt sekresjon15. Behovet for en metode som omfatter virkemåten til vevet som helhet, men kan også manipuleres under laboratorieforhold for å studere virkningene av behandlingen er nødvendig for å ytterligere oppdage de underliggende mekanismene for stråling-indusert spyttkjertel Dysfunksjon.
Levende vev snitting og kultur har blitt dokumentert tidligere19,20 og brukes ofte til å studere hjerne-vev interaksjoner21. I tidligere studier, parotid (PAR) spyttkjertel vev fra mus ble delt på ca 50 μm og kultivert for opp til 48 h, og analyse av levedyktighet, celle død, og funksjonen ble utført deretter19. Su et al. (2016) utvidet på denne metodikken ved dyrking humant submandibular kjertler (SMGs) delt på 35 μm eller 50 μm for 14 dager20. Den foreslåtte metoden er en fremgang i at det inkluderer både parotid og submandibular spyttkjertler delt på 50 μm og 90 μm og evaluering av kulturer i 30 dager. Evnen til å kutte en rekke vev tykkelse er viktig i å evaluere celle-celle og Cell-ECM interaksjoner som er relevante for cellulære prosesser inkludert apikale-basolateral polaritet og innervasjon for sekresjon. Videre spyttkjertel skiver var bestrålt mens i kultur for å bestemme muligheten for denne kulturen modellen for å studere stråling-indusert spyttkjertel skade.
Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. For å bestemme maksimal tid seksjoner som er levedyktig post-disseksjon, trypan blå farging, levende celle farging, og immunhistokjemiske farging for celle død ble utført. Konfokalmikroskopi mikroskopi og immunofluorescent farging ble benyttet for å evaluere spesifikke celle populasjoner, morfologiske strukturer, og nivåer av spredning. Vevs-delen kulturer ble også utsatt for ioniserende stråling å bestemme virkningene av stråling på ulike markører i denne 3-D modellen. Induksjon av celle død, cytoskjelettkomponenter avbrudd, tap av differensiering markører, og kompenserende spredning i bestrålt ex vivo kulturer ble sammenlignet med tidligere studier av in vivo-modeller. Denne metoden gir et middel til å undersøke hvilken rolle celle-celle interaksjoner etter stråling skader og gir en eksperimentell modell for å effektivt evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner (Gen manipulasjoner eller farmakologiske midler ) som kan være mindre egnet for in vivo-modeller.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Hyposalivation og xerostomia skape kroniske muntlige komplikasjoner som reduserer livskvaliteten i hode og nakke kreftpasienter som er behandlet med strålebehandling. Eksperimentelle tilnærminger til forståelse mekanismer av spyttkjertel dysfunksjon og restaurering har fokusert på in vivo-modeller, som er handikappet av en manglende evne til systematisk skjermen terapeutiske kandidater og effektivitet i transfeksjoner evne til å manipulere spesifikke gener. Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. Vi benyttet immunofluorescent farging og konfokalmikroskopi mikroskopi for å avgjøre når bestemte celle populasjoner og markører er til stede under en 30-dagers kultur periode. I tillegg blir celle markører som tidligere er rapportert i in vivo stråling-modeller evaluert i kulturer som er bestrålt ex vivo. Fremover, denne metoden er en attraktiv plattform for rask ex vivo vurdering av murine og menneskelig spyttkjertel vev reaksjoner på terapeutiske midler som forbedrer spytt funksjon.

Primær 2-D kulturer dyrkes i fosterets storfe serum (FBS) supplert Media mens primær 3-D salisphere kultur er vanligvis kultivert i serum-frie betingelser10,11. I tillegg har de to tidligere studier utnytte vibratome kulturer fra spyttkjertler kultivert sine seksjoner i 0% eller 10% FBS supplert Media19,20. Mus submandibular skiver ble delt med en tykkelse på 50 μm ved...

Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Ved hjelp av tredimensjonale organotypic kulturer for å visualisere morfologi og funksjonelle markører for spyttkjertler kan gi romanen innsikt i mekanismer for vevsskade etter stråling. Beskrevet her er en protokoll til del, kultur, irradiate, beis, og bilde 50-90 μm tykke spyttkjertel seksjoner før og etter eksponering for ioniserende stråling.

Strålebehandling av Organotypic kulturer fra submandibular og parotid spyttkjertler modeller Key in vivo kjennetegn

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Denne protokollen tillater evaluering av celle til celle interaksjoner mellom ulike celletyper i et vev, og ex vivo molekylære og farmakologiske manipulasjoner som ville være mindre gjennomførbare in vivo. Den største fordelen med denne teknikken er den lange perioden disse vevsseksjonene kan opprettholdes i kultur slik at deres evaluering på senere tidspunkter. Denne teknikken vil tillate en raskere screening av terapeutiske forbindelser for å korrigere spyttkjertelskade og vil sannsynligvis redusere antall mus som brukes til disse studiene.Vi planlegger å bruke denne teknikken til å forstå spyttkjertelresponsen på strålebehandling på mellomliggende tidspunkter og å slå gener av og på med bestemte intervaller. Det vanskeligste aspektet ved denne prosedyren er vevsseksjonen og forhindrer tap av vevsseksjoner under kultur og fargingstrinn. Før du begynner prosedyren desinfisere avtakbare vibratom komponenter med 70% etanol, etterfulgt av UV sterilisering i minst 30 minutter.Fest et ekstra ark med laboratoriefilm over bufferbrettet for å hindre at isen faller inn, og fyll iskammeret med knust is. Fjern laboratoriefilmen fra bufferbrettet og fyll bufferbrettet med 100 milliliter iskald PBS supplert med 1% penicillin streptomycin ampicillin, eller PSA. Plasser deretter et barberblad i rustfritt stål i bladholderen og bruk en skrutrekker for å forenkle justeringen av bladvinkelen.Etter å ha isolert spyttkjertlene, legg det høstede vevet i en steril 30 millimeter kulturrett som inneholder to milliliter iskald PBS supplert med 1% PSA. Ved hjelp av autoklavet tang, overføre kjertlene til bunnen av innebygging mold og dekke vevet med flytende 3% lavt smeltepunkt agarose. Bruk tang, juster vevet til midten av blokken i riktig plan, og plasser agaroseblokken på is i 10 minutter.Når agarose har herdet, kjør forsiktig et barberblad rundt den ytre kanten av formen og la blokken gli ut på den UV-steriliserte laboratoriefilmen. Bruk barberbladet til å kutte ut en agarose boks som inneholder spyttkjertelen, ta vare på at flyet av delen er rett og parallelt med motsatt side av blokken. Bruk superlim til å feste blokken til skjæreoverflaten og få 50 eller 90 mikrometer tykke seksjoner på vibratomen med en hastighet på 0,075 millimeter per sekund med en 100 hertz-frekvens.Bruk deretter en autoklavet naturlig hårbørste til å overføre seksjonene til individuelle brønner av en 24 brønnvevskulturrett som inneholder en milliliter iskald PBS per vel som de oppnås. Når alle seksjonene er anskaffet, bruk og autoklavet mikro slikkepott for å overføre seksjonene til individuelle 0,4 mikrometer helle størrelse membran innsatser i hver brønn av en 24 brønnvev kultur plate som inneholder 300 mikroliter vibratom kultur medium per brønn. Plasser deretter platen i en 37 grader Celsius og 5% karbondioksidinkubator med fuktighet, forfriskende mediet i bunnen av hver brønn, og tilsett 40 mikroliter med medium til membranen setter inn annenhver dag etter behov i opptil 30 dager.For å bestråle vevet, overfør seksjonene til irradiatoranlegget i en dekket styrofoambeholder for å unngå temperatursvingninger og behandle seksjonene med en enkelt femgrads dose stråling. Deretter returnerer kulturer til en stråling sikker vev kultur inkubator. For antistofffarging av vevsseksjonene, vask prøvene med minst to fem minutters vasker i steril PBS og fest seksjonene i 4% paraformaldehyd ved fire grader Celsius over natten.Neste morgen vask seksjonene tre ganger med PBS supplert med 1% storfe serum albumin og 0,1% Triton X-100, eller PBT, før permeabilizing vev med 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter. Vask seksjonene tre ganger i PBT som vist før du blokkerer en ikke-spesifikk binding med blokkeringsmiddel supplert med 1% normalt geiteserum i en time. Deretter inkubere seksjonene over natten i riktig primær antistoff av interesse.Bright felt mikroskop bilder av primære 2D spyttkjertel seksjon kulturer avslører tilstedeværelsen av levedyktig vev i opptil 30 dager med kultur under alle konsentrasjoner av serum tilskudd testet. Den proliferative kapasiteten til disse representative kultiverte skivene ble vurdert av Ki-67 immunstaining og denne markøren ble observert til enhver tidspunkt evaluert. Et lavt nivå av Cleaved Caspase-3 positive celler ble også observert til enhver tid med en liten økning oppdaget på dag 30.E-kadherinfarging ble observert i både submandibulære og parotidkjertelskiver gjennom hele 30 dagers kulturperiode. Glatte muskel-positive celler og cytoskeletal organisasjon ble oppdaget på lignende nivåer gjennom kulturperioden. På samme måte ble funksjonelle proteiner som amylase og aquaporin-5 også oppdaget, om enn på dag 14 syntes fargingen å være mer granulær.Cd31 og TUBB3 ble derimot ikke konsekvent uttrykt gjennom kulturperioden i begge kjertlene, noe som tyder på at det er et mangfold av vevsbestanddeler opprettholdt i ulike perioder gjennom hele 30-dagers kulturperioden. Bestrålte skiver i begge kjertlene etterlignet lignende proliferative apoptotiske og cytoskeletale endringer observert in vivo. Vær forsiktig når du flytter seksjonene fra PBS-badet i vibratomen til kulturplaten og under fargingsprosedyrene, da seksjonene er små og delikate.Seksjonskulturene kan behandles med de fleste cellelinjekulturmetoder med den ekstra fordelen av å være under forhold som er tettere knyttet til in vivo. Vi forventer at dette vil være en kraftig teknikk for andre forskere å innlemme i sine eksperimenter. Bladet på vibratomen er skarpt og kan være vanskelig å sette inn, så vær trett når du håndterer.Også trypan blå fargestoff er giftig og kreftfremkallende så følg alle PP retningslinjer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal Submandibular Gland Instillasjon og Lokalisert Fraksjonert Bestråling i en rottemodell av spytt hypofunksjon

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generering av Microtumors Bruke 3D Menneskelig Biogel Kultur System og pasient-avledet glioblastom celler for Kinomic Profilering and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Nedbryting av museceller fra menneske tumorxenotransplantater forbedrer Nedstrøms Analyse av Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Stråling planlegging assistent - en strømlinjeformet, helautomatisk strålebehandling behandling planlegging System

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Murine Salivary funksjonelle vurdering via Pilocarpine stimulering følgende fraksjonert stråling

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Målrettet og selektiv behandling av Pluripotent Stamcelle-avledet Teratomas bruke ekstern stråle stråling i en liten-dyr modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...