Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Эта работа была поддержана в части пилотным финансированием, предоставляемый университетом Аризоны Управление исследований и открытий и национальных институтов здравоохранения (R01 DE023534) Кирстен Limesand. Обучение биологии рака Грант, T32CA009213, при условии стипендиальной поддержки Вэнь Юй Вонг. Авторы хотели бы поблагодарить м. Райс за его ценный технический вклад.

1. Приготовление вибратома
<ol><li>Спрей съемные компоненты вибратом включая буфер лоток, лезвие крепления, агарозы блок плесень, и лабораторный фильм с 70% этанола, то УФ-стерилизации, по крайней мере 30 мин.</li>
	<li>Поместите и закрепите дополнительный лист лабораторной пленки над буферным л?...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer.">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li><li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer.">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li><li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+(chemo)radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy.">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznan&#769; and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li><li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation:+from+animal+models+to+therapies.">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li><li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands.">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing.">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis.">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li><li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding.">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death &amp; Disease. 1, (2010).</li><li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands.">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li><li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland.">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands:+the+slice+culture+model.">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li><li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome.">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

Исследования слюнных желез использовал ряд моделей культуры, в том числе увековечены 2-D культур, первичных 2-D культур, 3-D культуры салисферы, и 3-D органные культуры из эмбриональных эксфолиантов для выяснения вопросов на основе биологии и физиологии. Эти модели культуры дали глубокую ин...

Правильная функция слюнных желез имеет важное значение для здоровья полости рта и изменяется после лечения рака головы и шеи с лучевой терапией1. В 2017, около 50 000 новых случаев рака головы и шеи были зарегистрированы в Соединенных Штатах2. Из-за повреждающих ткани и часто необратимых последствий лучевой терапии на окружающих нормальных тканях, таких как слюнные железы, пациенты часто остаются с тяжелыми побочными эффектами и уменьшением качества жизни2,3, 4. в Общие осложнения, вызванные радиационным повреждением проявляется в таких симптомах, как Ксеростомия (субъективное чувство сухости во рту), кариеса зубов, нарушение способности жевать и глотать, нарушения речи и скомпрометированных устных микробиомов2, 3-х , 4. Эти симптомы коллективно может привести к недоеданию и нарушение выживания в пострадавших лиц5. В то время как дисфункция слюнных желез в этой популяции была хорошо документирована, основные механизмы повреждения клеток ацинар были оспорены, и мало интеграции между различными моделями животных6,7.
Текущие методы изучения функции слюнной железы и радиационно-индуцированных повреждений включают использование в моделях естественных условиях, увековечены клеточных линий, двумерных (2-D) первичных клеточных культур, а также трехмерные (3-D) культуры салисферы8, 9,10,11,12. Традиционно, модели клеточной культуры от увековечены клеточных линий и 2-D культур привлекать однослоистых клеток культивировали на плоских поверхностях и ценны для быстрой, простой и экономически эффективных экспериментов. Однако, искусственные условия культуры клетки могут изменить состояние дифференцировки и физиологические реакции клеток, котор подвергли действию к различным условиям, и результаты часто не могут перевести к всем моделям организма14,15. Кроме того, увековечены клеточных культур требует модуляции р. р. деятельности, которая имеет решающее значение для реакции слюнных желез на повреждение ДНК16,17.
3-D культуры салисфера обогащаются для стволовых клеток и клетки-предшественников в раннем времени точки в культуре и были полезны для понимания радиозентивности этого подмножества слюнных желез клеток9,18. Критическое ограничение всех этих моделей культуры они неэффективны в визуализации 3-D структуры слюнной железы, в том числе внеклеточной матрицы (ЕОС) и клеточных взаимодействий в течение различных слоев, которые имеют решающее значение в модуляции слюнных секреции15. Необходимость метода, который включает в себя поведение ткани в целом, но может также манипулировать в лабораторных условиях для изучения последствий лечения необходимо для дальнейшего обнаружить основные механизмы радиационно-индуцированной слюнной железы Дисфункции.
Живая ткань секционирования и культуры был документально ранее19,20 и часто используется для изучения мозга ткани взаимодействия21. В предыдущих исследованиях, околоушной (пар) слюнных желез ткани от мышей был секционного примерно на 50 мкм и культивировали до 48 ч, и анализ жизнеспособности, гибель клеток, и функция была выполнена после19. SU et al. (2016) расширена по этой методологии путем культивирования человеческих Подчелюстные железы (SMGs) секционные на 35 мкм или 50 мкм в течение 14 дней20. Предлагаемый метод является продвижение в том, что она включает в себя как околоушной и подчелюстной слюнных желез секционные на 50 мкм и 90 мкм и оценка культур в течение 30 дней. Способность вырезать диапазон толщины ткани имеет важное значение при оценке клеточных и клеточных взаимодействий, которые актуальны для клеточных процессов, включая апокально-базолатеральной полярности и иннервации для секреции. Кроме того, ломтики слюнной железы были облучены в то время как в культуре, чтобы определить целесообразность этой модели культуры для изучения радиационно-индуцированных повреждений слюнных желез.
Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Чтобы определить максимальное время разделы, которые являются жизнеспособными после рассечения, ТриАН синего окрашивания, живые окрашивание клеток, и иммуногистолехимического окрашивания для клеточной смерти были выполнены. Кофокальная микроскопия и иммунолюминесцентная окрашивание использовались для оценки популяции конкретных клеток, морфологических структур и уровней распространения. Ткани раздел культур также подвергаются ионизирующего излучения для определения последствий излучения на различных маркеров в этой 3-D модели. Индукция клеточной смерти, разрушение цитоскелета, потеря маркеров дифференциации, и компенсационного распространения в облученных ex естественных условиях культуры были по сравнению с предыдущими исследованиями в моделях естественных условиях. Эта методология предоставляет средства для изучения роли клеточных взаимодействий после радиационного поражения и обеспечивает экспериментальную модель для эффективной оценки эффективности терапевтических вмешательств (манипуляции генами или фармакологические агенты ), которые могут быть менее подходящими для в естественных условиях моделей.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Гипосаливация и ксеростомия создают хронические устные осложнения, которые снижают качество жизни больных раком головы и шеи, которые лечатся лучевой терапией. Экспериментальные подходы к пониманию механизмов дисфункции слюнных желез и восстановления были сосредоточены на в моделях естественных условиях, которые являются инвалидами из-за неспособности систематически экран терапевтических кандидатов и эффективность в трансфекции способность манипулировать конкретными генами. Цель этой слюнной железы органотипных культура протокол для оценки максимального времени жизнеспособности культуры и характеризуют клеточных изменений после ex естественных условиях лучевой терапии. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание и кофокальные микроскопии, чтобы определить, когда конкретные популяции клеток и маркеры присутствуют в течение 30-дневного периода культуры. Кроме того, сотовые маркеры ранее зарегистрированных в в естественных условиях излучения модели оцениваются в культурах, которые облученных ex естественных условиях. Двигаясь вперед, этот метод является привлекательной платформой для быстрого ex в естественных условиях оценки мышиных и человека слюнных желез ткани ответы на терапевтические агенты, которые улучшают функцию слюнных.

Первичные 2-D культуры выращиваются в фетальной сыворотке говядины (ФПС) дополнены средствами массовой информации в то время как первичная 3-D культура салисферы, как правило, культивируются в сыворотке без условий10,11. Кроме того, два пред...

Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Использование трехмерных органотипных культур для визуализации морфологии и функциональных маркеров слюнных желез может обеспечить новый взгляд на механизмы повреждения тканей после облучения. Описанный здесь протокол к разделу, культуре, излучать, пятно, и изображение 50-90 мкм толщиной слюнных желез разделы до и после воздействия ионизирующего излучения.

Лучевая терапия Органотипных культур от подчелюстной и околоушной слюнных желез модели ключ в естественных характеристик

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Этот протокол позволяет оценки взаимодействия клеток с клетками между различными типами клеток в ткани, и ex vivo молекулярных и фармакологических манипуляций, которые были бы менее осуществимы in vivo. Основным преимуществом этого метода является длительный период времени эти секции тканей могут быть сохранены в культуре позволяет их оценки в более поздние моменты времени. Этот метод позволит более быстрый скрининг терапевтических соединений для коррекции повреждения слюнных желез и, скорее всего, уменьшить количество мышей, используемых для этих исследований.Мы планируем использовать этот метод, чтобы понять реакцию слюнных желез на лучевую терапию в промежуточных точках времени и включить и выключить гены через определенные промежутки времени. Наиболее сложным аспектом этой процедуры является раздел тканей и предотвращение потери секций тканей во время культуры и окрашивания шагов. Перед началом процедуры дезинфицируют съемные вибромные компоненты 70%этанолом, за которыми следует УФ-стерилизация не менее 30 минут.Закрените дополнительный лист лабораторной пленки над буферным лоток, чтобы предотвратить падение льда, и заполнить ледяную камеру дробленым льдом. Удалите лабораторную пленку из буферного лотка и заполните буферный лоток 100 миллилитров ледяного PBS, дополненного 1%пенициллин стрептомицин ампициллин, или PSA. Затем поместите лезвие бритвы из нержавеющей стали в держатель лезвия и используйте отвертку, чтобы облегчить регулировку угла лезвия.После изоляции слюнных желез поместите собранную ткань в стерильное 30-миллиметровое культурное блюдо, содержащее два миллилитров ледяного PBS, дополненного 1%PSA. Используя автоматические типсы, перенесите железы на дно встраивающейся формы и накройте ткань жидкостью 3%low плавильной точки агарозы. Используя типсы, отрегулируйте ткань к середине блока в соответствующей плоскости, и поместите блок агарозы на лед в течение 10 минут.Когда агароза затвердела, осторожно запустите лезвие бритвы вокруг внешнего края формы и пусть блок выскользнуть на УФ-стерилизованной лабораторной пленки. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать агарозную коробку, содержащую слюнную железу, заботясь о том, чтобы плоскость секции была прямой и параллельной противоположной стороне блока. Используйте суперклей, чтобы прикрепить блок к поверхности резки и получить 50 или 90 микрометров толщиной разделов на виброме на 0,075 миллиметра в секунду скоростью 100 герц частоты.Затем используйте автоклавированную натуральную расческу для волос, чтобы перенести секции в отдельные колодцы 24 хорошо ткани культуры блюдо, содержащее один миллилитр ледяной PBS за а также они получены. Когда все разделы были приобретены, использовать и autoclaved микро шпатель для передачи разделов в отдельных 0,4 микрометра залить размер мембраны вставки в каждом хорошо из 24 хорошо ткани культуры пластины, содержащей 300 микролитров виброма культуры среды на колодец. Затем поместите пластину в 37 градусов по Цельсию и 5%углекислый газ инкубатор с влажностью, освежает среду в нижней части каждой хорошо, и добавить 40 микролитров среднего мембраны вставляет через день по мере необходимости на срок до 30 дней.Чтобы облучить ткани, перенесите секции на облучатель в крытый контейнер из пенополистирола, чтобы избежать колебаний температуры и обработать секции одной пятиклассной дозой радиации. Затем верните культуры в инкубатор культуры радиационной безопасной ткани. Для антитела окрашивания тканей разделов, мыть образцы, по крайней мере две пять минут моет в стерильных PBS и исправить разделы в 4%paraformaldehyde при четырех градусах по Цельсию в одночасье.На следующее утро мыть разделы три раза с PBS дополняется 1%бычьей сыворотки альбумин и 0,1%Triton X-100, или PBT, прежде чем пронизыть ткани с 0,3%Triton X-100 в PBS в течение 30 минут. Вымойте секции три раза в PBT, как попродемонстрировано, прежде чем блокировать любые неспецифические связывания с блокирующим агентом дополнен 1%нормальной сыворотки козы в течение одного часа. Затем инкубировать разделы на ночь в соответствующих первичных антител интересов.Яркие изображения полевого микроскопа первичных культур секции слюнных желез 2D показывают наличие жизнеспособных тканей на срок до 30 дней культуры при всех концентрациях проверенных добавок сыворотки. Пролиферативная способность этих репрезентативных культурных ломтиков была оценена иммуностимулятором Ки-67, и этот маркер наблюдался во все моменты оценки. Низкий уровень клеток Cleaved Caspase-3 также наблюдался во все моменты времени с небольшим увеличением, обнаруженным в день 30.E-кадерин окрашивание наблюдалось как в подумандибулярных и околоушных ломтиков железы в течение 30-дневного периода культуры. Гладкие мышцы актин-позитивных клеток и цитоскелет организации были обнаружены на аналогичных уровнях на протяжении всего периода культуры. Аналогичным образом, функциональные белки, такие как амилаза и аквапорин-5 были также обнаружены, хотя в день 14 окрашивание оказалось более гранулированным.В отличие от этого, CD31 и TUBB3 не были последовательно выражены на протяжении всего периода культуры в обеих железах, что свидетельствует о том, что существует разнообразие компонентов тканей поддерживается в течение различных периодов времени в течение 30-дневного периода культуры. Облученые ломтики в обеих железах имитировали аналогичные пролиферативные апоптотические и цитоскелетные изменения, наблюдаемые in vivo. Будьте осторожны при перемещении секций из ванны PBS в виброме на культурную тарелку и во время процедур окрашивания, так как секции маленькие и деликатные.Культуры раздела можно обработать с большинств методами культуры линии клетки с добавленной пользой быть под условиями которые близко связаны к in vivo. Мы ожидаем, что это будет мощный метод для других исследователей, чтобы включить в свои эксперименты. Лезвие на виброме является острым и может быть трудно вставить так устал при обработке.Кроме того, trypan синий краситель является токсичным и канцерогенным, так что следуйте всем руководящим принципам PP.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Катетеризации из Мышь подчелюстные слюнные железы через Канальные Уортон

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal Подчелюстные Сальник закапывания и локализованный фракционированного облучения в крысиной модели слюнных гипофункции

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Генерация Microtumors Использование 3D человека биогель системы культуры и терпеливый происхождения клеток глиобластомы для Kinomic профилирование и тестирования реагирования на наркотики

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Истощение мышиных клеток из ксенотрансплантатов опухолей человека значительно улучшает Downstream Анализ клеток-мишеней

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Излучения, Планирование помощника - обтекаемый, полностью автоматизированный лечения лучевой системы планирования

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Мышиных слюнных функциональной оценки через после стимуляции пилокарпин фракционированный излучения

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Целенаправленный и избирательный лечение плюрипотентных стволовых клеток тератомы, используя внешний пучка излучения в модели малого животных

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...