Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado en parte por la financiación piloto proporcionada por la oficina de investigación y descubrimiento de la Universidad de Arizona y los institutos nacionales de salud (r01 DE023534) a Kirsten Limesand. La beca de capacitación en Biología del cáncer, T32CA009213, proporcionó apoyo de estipendio a Wen Yu Wong. A los autores les gustaría agradecer a M. Rice su valiosa contribución técnica.

1. preparación del vibratomo
<ol><li>Pulverizar los componentes desmontables del vibratomo incluyendo la bandeja tampón, el accesorio de la cuchilla, el molde del bloque de agarosa, y la película de laboratorio con el etanol 70%, entonces esterilizar UV por lo menos 30 minutos.</li>
	<li>Coloque y asegure una lámina adicional de película de laboratorio sobre la bandeja de amortiguación para evitar que caiga hielo.</li>
	<li>Llene la cámara de hielo con hielo triturado, extraiga la película de laboratorio de la ...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. 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M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

La investigación de glándulas salivales ha utilizado una serie de modelos de cultivo, incluyendo culturas 2-D inmortalizadas, cultivos primarios 2-D, cultivos salisales 3-D, y cultivos de órganos 3-D de explantas embrionarias para determinar preguntas sobre la biología subyacente y la fisiología. Estos modelos de cultura han arrojado información perspicaz a través de una diversa variedad de preguntas de investigación y seguirán siendo herramientas importantes en la investigación salival. Las limitaciones de est...

La función de la glándula salival adecuada es esencial para la salud bucal y se altera después del tratamiento del cáncer de cabeza y cuello con radioterapia1. En 2017, se notificaron cerca de 50.000 casos nuevos de cáncer de cabeza y cuello en los Estados Unidos2. Debido a los efectos perjudiciales para los tejidos y con frecuencia irreversibles de la radioterapia en los tejidos normales circundantes, como las glándulas salivales, a los pacientes a menudo se les deja con efectos secundarios graves y disminución de la calidad de vida2,3, 4. Las complicaciones comunes causadas por el daño por radiación se manifiestan en síntomas como la xerostomía (la sensación subjetiva de sequedad bucal), la caries dental, la capacidad deteriorada para masticar y tragar, las deficiencias del habla y los microbiomas orales comprometidos2, 3 , 4. estos síntomas colectivamente pueden conducir a la desnutrición y la supervivencia deteriorada en los individuos afectados5. Mientras que la disfunción de las glándulas salivales en esta población ha sido bien documentada, los mecanismos subyacentes de daño a las células acinares han sido cuestionados, y hay poca integración entre los diferentes modelos animales6,7.
Los métodos actuales de estudio de la función de la glándula salival y el daño inducido por la radiación incluyen el uso de modelos in vivo, líneas celulares inmortalizadas, cultivos de células primarias bidimensionales (2-D) y culturas tridimensionales (3-D) de la salifera8, 9,10,11,12. Tradicionalmente, los modelos de cultivo celular de líneas celulares inmortalizadas y cultivos en 2-D implican células de capas únicas cultivadas en superficies planas y son valiosas para una experimentación rápida, fácil y rentable. Sin embargo, las condiciones de cultivo celular artificial pueden alterar el estado de diferenciación y las respuestas fisiológicas de las células expuestas a diversas afecciones, y los resultados a menudo no se traducen a los modelos de organismos enteros14,15. Además, los cultivos celulares inmortalizados requieren la modulación de la actividad de p53, que es fundamental para la respuesta de la glándula salival al daño del ADN16,17.
las culturas salisfera 3-D se enriquecen para las células madre y progenitoras en los primeros momentos de la cultura y han sido útiles para comprender la radiosensibilidad de este subconjunto de células de la glándula salival9,18. Una limitación crítica de todos estos modelos de cultivo es que son ineficaces en la visualización de la estructura 3-D de la glándula salival, incluyendo la matriz extracelular (ECM) y las interacciones de células celulares sobre varias capas, que son cruciales en la modulación de salivales secreción15. La necesidad de un método que abarque el comportamiento del tejido en su conjunto, pero también puede ser manipulado en condiciones de laboratorio para estudiar los efectos del tratamiento es necesario para descubrir los mecanismos subyacentes de la glándula salival inducida por radiación disfunción.
La seccionamiento de tejido vivo y la cultura se han documentado previamente19,20 y a menudo se utiliza para estudiar interacciones cerebro-tejido21. En estudios previos, el tejido parótida (PAR) de las glándulas salivales de los ratones se seccionó a aproximadamente 50 μm y se cultivó hasta 48 h, y se realizaron análisis de viabilidad, muerte celular y función a partir de entonces19. Su et al. (2016) ampliado en esta metodología mediante el cultivo de glándulas submandibulares humanas (SMG) seccionadas a 35 μm o 50 μm durante 14 días20. El método propuesto es un avance en el que incluye las glándulas salivales parótidas y submandibulares seccionadas a 50 μm y 90 μm y la evaluación de los cultivos durante 30 días. La capacidad de cortar una gama de espesor de tejido es importante en la evaluación de las interacciones célula-célula y Cell-ECM que son relevantes para los procesos celulares incluyendo la polaridad apical-basolateral y la inervación para la secreción. Además, las rebanadas de las glándulas salivales fueron irradiadas mientras estaban en cultivo para determinar la viabilidad de este modelo de cultivo para estudiar el daño causado por la glándula salival inducida por radiación.
El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Para determinar las secciones máximas de tiempo que son viables después de la disección, se realizaron manchas azules de tripan, tinción de células vivas e inmunohistoquímica para la muerte celular. La microscopía confocal y la tinción inmunofluorescente se utilizaron para evaluar poblaciones celulares específicas, estructuras morfológicas y niveles de proliferación. Los cultivos de sección de tejido también se exponían a la radiación ionizante para determinar los efectos de la radiación en varios marcadores en este modelo 3-D. Se comparó la inducción de la muerte celular, la alteración del citoesqueleto, la pérdida de marcadores de diferenciación y la proliferación compensatoria en cultivos ex vivo irradiados a estudios previos de modelos in vivo. Esta metodología proporciona un medio para investigar el papel de las interacciones de células celulares tras el daño por radiación y proporciona un modelo experimental para evaluar eficientemente la eficacia de las intervenciones terapéuticas (manipulaciones genéticas o agentes farmacológicos ) que pueden ser menos adecuados para los modelos in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

La hiposalivación y la xerostomía crean complicaciones orales crónicas que disminuyen la calidad de vida en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que reciben tratamiento con radioterapia. Los enfoques experimentales para comprender los mecanismos de disfunción y restauración de las glándulas salivales se han centrado en los modelos in vivo, que se encuentran discapacitados por la incapacidad de sistematiar sistemáticamente a los candidatos terapéuticos y la eficiencia en la transfección capacidad de manipular genes específicos. El propósito de este protocolo de cultivo organotípico de la glándula salival es evaluar el tiempo máximo de viabilidad de la cultura y caracterizar los cambios celulares después del tratamiento de radiación ex vivo. Utilizamos la tinción inmunofluorescente y la microscopía confocal para determinar cuándo están presentes poblaciones y marcadores específicos de células durante un período de cultivo de 30 días. Además, los marcadores celulares notificados previamente en modelos de radiación in vivo se evalúan en cultivos irradiados ex vivo. Avanzando, este método es una plataforma atractiva para la evaluación rápida ex vivo de las respuestas del tejido de las glándulas salivales murinas y humanas a los agentes terapéuticos que mejoran la función salival.

Los cultivos primarios en 2-D se cultivan en el suero bovino fetal (FBS), mientras que la cultura salisfera primaria 3-D se cultiva típicamente en condiciones libres de suero10,11. Además, los dos estudios previos que utilizan cultivos de vibratomo de glándulas salivales cultivaron sus secciones en 0% o 10% de FBS suplementados con medios de comunicación19,20. Las roda...

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Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

El uso de cultivos organotípica tridimensionales para visualizar la morfología y los marcadores funcionales de las glándulas salivales puede proporcionar ideas novedosas sobre los mecanismos de daño tisular después de la radiación. Aquí se describe un protocolo de sección, cultura, irradiar, mancha, y la imagen de 50 – 90 μm grueso secciones de la glándula salival antes y después de la exposición a la radiación ionizante.

Tratamiento de radiación de cultivos organotípico de glándulas salivales submandibulares y parótidas modelos clave en vivo características

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Este protocolo permite la evaluación de las interacciones de células a células entre diversos tipos de células dentro de un tejido, y manipulaciones moleculares y farmacológicas ex vivo que serían menos factibles in vivo. La principal ventaja de esta técnica es el largo período de tiempo que estas secciones tisulares podrían mantenerse en el cultivo permitiendo su evaluación en puntos de tiempo posteriores. Esta técnica permitirá un cribado más rápido de compuestos terapéuticos para corregir el daño de las glándulas salivales y probablemente reducirá el número de ratones utilizados para estos estudios.Planeamos utilizar esta técnica para entender la respuesta de la glándula salival a la radioterapia en puntos de tiempo intermedios y para activar y desactivar los genes a intervalos específicos. El aspecto más difícil de este procedimiento es la sección del tejido y la prevención de la pérdida de secciones tisulares durante los pasos de cultivo y tinción. Antes de comenzar el procedimiento desinfectar los componentes vibratomos desmontables con 70%etanol, seguido de esterilización UV durante al menos 30 minutos.Asegure una hoja adicional de película de laboratorio sobre la bandeja tampón para evitar que caiga hielo, y llene la cámara de hielo con hielo triturado. Retire la película de laboratorio de la bandeja tampón y llene la bandeja tampón con 100 mililitros de PBS helado complementado con 1%penicilina ampicilina ampicilina, o PSA. A continuación, coloque una cuchilla de afeitar de acero inoxidable en el soporte de la hoja y utilice un destornillador para facilitar el ajuste del ángulo de la hoja.Después de aislar las glándulas salivales, coloque el tejido cosechado en un plato de cultivo estéril de 30 milímetros que contenga dos mililitros de PBS helado complementado con 1%PSA. Usando fórceps autoclaves, transfiera las glándulas a la parte inferior del molde incrustado y cubra el tejido con líquido 3% bajo punto de fusión agarosa. Usando fórceps, ajuste el tejido a la mitad del bloque en el plano apropiado y coloque el bloque de agarosa sobre hielo durante 10 minutos.Cuando la agarosa se haya endurecido, ejecute cuidadosamente una cuchilla de afeitar alrededor del borde exterior del molde y deje que el bloque se deslice hacia la película de laboratorio esterilizada con UV. Utilice la cuchilla de afeitar para cortar una caja de agarosa que contiene la glándula salival, teniendo cuidado de que el plano de la sección sea recto y paralelo al lado opuesto del bloque. Utilice superpegamento para fijar el bloque a la superficie de corte y obtener secciones de 50 o 90 micrómetros de espesor en el vibratome a una velocidad de 0,075 milímetros por segundo a una frecuencia de 100 hercios.Luego usa un cepillo de pintura de cabello natural autoclavizado para transferir las secciones a pozos individuales de un plato de cultivo de tejido de 24 pozos que contenga un mililitro de PBS helado por su parte, ya que se obtienen. Una vez adquiridas todas las secciones, utilice y autoclave micro espátula para transferir las secciones a inserciones individuales de membrana de tamaño de vertido de 0,4 micrómetros en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 24 pozos que contiene 300 microlitros de medio de cultivo de vibratoma por pozo. A continuación, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius y 5%con humedad, refrescándolo en la parte inferior de cada pozo y añadiendo 40 microlitros de medio a la membrana se inserta cada dos días según sea necesario durante un máximo de 30 días.Para irradiar los tejidos, transfiera las secciones a la instalación del irradiador en un recipiente cubierto de espuma de poliestireno para evitar fluctuaciones en la temperatura y tratar las secciones con una sola dosis de radiación de cinco grados. Luego devuelva los cultivos a una incubadora de cultivo de tejido segura contra radiación. Para la tinción de anticuerpos de las secciones del tejido, lave las muestras con al menos dos lavados de cinco minutos en PBS estéril y fije las secciones en 4%paraformaldehído a cuatro grados centígrados durante la noche.A la mañana siguiente lavar las secciones tres veces con PBS complementado con 1%albúmina sérica bovina y 0.1%Tritón X-100, o PBT, antes de permeabilizar los tejidos con 0.3%Tritón X-100 en PBS durante 30 minutos. Lavar las secciones tres veces en PBT como se ha demostrado antes de bloquear cualquier unión inespecífico con agente bloqueador complementado con 1%suero de cabra normal durante una hora. Luego incubar las secciones durante la noche en el anticuerpo primario de interés apropiado.Imágenes brillantes del microscopio de campo de cultivos primarios de sección de glándulas salivales 2D revelan la presencia de tejidos viables para hasta 30 días de cultivo bajo todas las concentraciones de suplementos séricos probados. La capacidad proliferativa de estas rebanadas cultivadas representativas fue evaluada por la inmunostaining Ki-67 y este marcador se observó en todos los puntos de tiempo evaluados. También se observó un nivel bajo de células positivas de Caspase-3 en todos los momentos con un pequeño aumento detectado en el día 30.Se observó tinción de cadherina en las rodajas de glándula submandibular y parótida durante el período de cultivo de 30 días. Las células de actina positiva lisa y la organización citoesquelética se detectaron a niveles similares durante todo el período de cultivo. Del mismo modo, también se detectaron proteínas funcionales como la amilasa y la aquaporina-5, aunque en el día 14 la tinción parecía ser más granular.Por el contrario, CD31 y TUBB3 no se expresaron consistentemente a lo largo del período de cultivo en ambas glándulas, lo que sugiere que hay una diversidad de componentes tisulares mantenidos durante diferentes períodos de tiempo durante el período de cultivo de 30 días. Las rodajas irradiadas en ambas glándulas imitaron cambios apoptóticos y citoesqueléticos proliferativos similares observados in vivo. Tenga cuidado al mover las secciones del baño PBS en el vibratome a la placa de cultivo y durante los procedimientos de tinción, ya que las secciones son pequeñas y delicadas.Los cultivos de sección se pueden tratar con la mayoría de los métodos de cultivo de líneas celulares con el beneficio adicional de estar en condiciones que están más estrechamente relacionadas con in vivo. Anticipamos que esta será una técnica poderosa para que otros investigadores se incorporen a sus experimentos. La hoja del vibratome es afilada y puede ser difícil de insertar, así que esté cansado al manipularla.También el tinte azul trypan es tóxico y cancerígeno, así que siga todas las pautas del PP.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Canulación de la glándula salival submaxilar del ratón a través del conducto de Wharton

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

Investigación

Medicina

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Recopilación de la saliva y la medición de cortisol salival y alfa-amilasa en Frail comunitarios residentes adultos mayores a través de Cuidadores de Familia

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Retroductal submandibular Glándula instilación y con localización fraccionado irradiación en un modelo de rata de hipofunción salival

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

El agotamiento de las células de ratón a partir de xenoinjertos de tumores humanos mejora significativamente análisis de aguas abajo de las células diana

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Radiación planificación a asistente - aerodinámico, automatizado sistema de planificación de tratamiento de radioterapia

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...