Name: radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics
Uploaded: 2019-05-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Bu çalışma, Arizona Üniversitesi araştırma ve keşif ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 DE023534) tarafından Kirsten Limesand için sağlanan pilot finansman tarafından kısmen destekleniyordu. Kanser biyoloji eğitim Grant, T32CA009213, Wen yu Wong için maaş desteği sağladı. Yazarlar değerli teknik katkısı için M. Rice teşekkür etmek istiyorum.

1. vibratomun hazırlanması
<ol><li>Tampon tepsisi, bıçak eki, agaroz blok kalıbı ve% 70 etanol ile laboratuvar filmi dahil olmak üzere vibratomun çıkarılabilir bileşenlerini sprey, daha sonra en az 30 dakika boyunca UV-sterilize.</li>
	<li>Buzun düşmesini önlemek için tampon tepsisinde ek bir laboratuvar filmi yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.</li>
	<li>Buz odasını ezilmiş buzla doldurun, laboratuvar filmini tampon tepsisine çıkarın ve tampon tepsisini 100 mL buz-soğuk 1x fosfat ta...

<ol>
	<li>Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+xerostomia+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+literature+review.">Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review.</a> Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+Statistics,+2017.">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li><li>Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+and+dental+management+related+to+radiation+therapy+for+head+and+neck+cancer.">Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer.</a> Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).</li><li>Nguyen, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+of+life+following+chemoradiation+and+postoperative+radiation+for+locally+advanced+head+and+neck+cancer.">Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer.</a> Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).</li><li>Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malnutrition+and+cachexia+in+patients+with+head+and+neck+cancer+treated+with+(chemo)radiotherapy.+Reports+of+Practical+Oncology+and+Radiotherapy.">Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy.</a> Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznan&#769; and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).</li><li>Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+salivary+glands+to+radiation:+from+animal+models+to+therapies.">Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies.</a> Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).</li><li>Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity.">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li><li>Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+salivary+gland+acinar+cells+spontaneously+form+three-dimensional+structures+and+change+the+protein+expression+patterns.">Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).</li><li>Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+growth+factors+promotes+salisphere+formation+from+irradiated+parotid+salivary+glands.">Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands.</a> PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Rat+Parotid+and+Submandibular+Acinar+Cell+Apoptosis+In+Primary+Culture.">Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Animal. 39 (3), 170 (2003).</li><li>Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+IL-6+expression+in+human+salivary+gland+cell+line+by+IL-17+via+activation+of+p38+MAPK,+ERK,+PI3K/Akt,+and+NF-&#954;B+pathways.">Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-&#954;B pathways.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).</li><li>Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAGE+expression+and+NF-&#954;B+activation+attenuated+by+extracellular+domain+of+RAGE+in+human+salivary+gland+cell+line.">RAGE expression and NF-&#954;B activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).</li><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors.">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+microenvironments+to+improve+cell-based+drug+testing.">Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing.</a> Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li><li>Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+salivary+gland+dysfunction+results+from+p53-dependent+apoptosis.">Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).</li><li>Mitchell, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF1+activates+cell+cycle+arrest+following+irradiation+by+reducing+binding.">IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding.</a> of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death &amp; Disease. 1, (2010).</li><li>Lombaert, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+Salivary+Gland+Function+after+Stem+Cell+Transplantation+in+Irradiated+Glands.">Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands.</a> PLoS ONE. 3 (4), (2008).</li><li>Warner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+form+and+function+in+organotypic+slices+of+the+adult+mouse+parotid+gland.">Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture+of+human+salivary+glands:+the+slice+culture+model.">Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model.</a> Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).</li><li>Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profile+analysis+of+hepatic+porcine+and+murine+brain+tissue+slices+obtained+with+a+vibratome.">Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome.</a> PeerJ - The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).</li><li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).</li><li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation.">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li><li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration.">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417 (2010).</li><li>Chibly, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKCzeta-dependent+Repression+of+Yap+is+Necessary+for+Functional+Restoration+of+Irradiated+Salivary+Glands+with+IGF-1.">aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).</li><li>Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+disruption+of+lateral+junctional+complexes+and+actin+cytoskeleton+in+parotid+salivary+glands+following+radiation+treatment.">Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).</li><li>Emmerson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+regulates+acinar+cell+development+in+the+salivary+gland.">SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+innervation+regulates+tubulogenesis+in+the+developing+salivary+gland.">Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland.</a> Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).</li><li>Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+regulation+of+salivary+gland+epithelial+patterning.">Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning.</a> Development. 144 (2), 211-220 (2017).</li><li>Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonula+occludens-1,+occludin+and+E-cadherin+expression+and+organization+in+salivary+glands+with+Sjogren's+syndrome.">Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren's syndrome.</a> Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).</li><li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Btbd7+is+essential+for+region-specific+epithelial+cell+dynamics+and+branching+morphogenesis+in+vivo.">Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo.</a> Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).</li><li>Nam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Irradiated+Human+Submandibular+Glands+Display+High+Collagen+Deposition,+Disorganized+Cell+Junctions,+and+an+Increased+Number+of+Adipocytes.">Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).</li></ol>

Tükürük bezi araştırmaları, ölümsüzleşmiş 2-d kültürler, primer 2-d kültürler, 3-d salisphere kültürler ve embriyonik Method 3-b organ kültürlerini temel biyoloji ve Fizyoloji hakkında bazı soruları tespit etmek gibi birçok kültür modelini kullandı. Bu kültür modelleri araştırma soruları çeşitli bir dizi üzerinde anlayışlı bilgi vermiştir ve tükürük araştırma önemli araçlar olmaya devam edecektir. Bu kültür modellerinin sınırlamaları, ölümsüzleştirme sırasında p53 a...

Uygun tükürük bezi fonksiyonu ağız sağlığı için esastır ve radyoterapi ile baş ve boyun kanseri tedavisi aşağıdaki değiştirilir1. 2017 yılında Amerika Birleşik Devletleri2' de yaklaşık 50.000 yeni baş ve boyun kanseri vakaları bildirilmiştir. Doku-zararlı ve genellikle tükürük bezleri gibi normal dokulara çevreleyen radyasyon tedavisinin geri dönüşümsüz etkileri nedeniyle, hastalar sıklıkla ciddi yan etkileri ve azalan yaşam kalitesi ile bırakılır2,3, 4' ü yapın. Aksostomi (Kuru ağız subjektif hissi), diş çürükleri, çiğnemek ve yutmak, konuşma bozuklukları ve tehlikeye oral mikrobiomes2 gibi semptomlarda radyasyon hasar belirtileri nedeniyle yaygın komplikasyonlar, 3 ' ü , 4. bu belirtiler topluca kötü beslenme ve etkilenen bireyler hayatta kalma bozukluğu yol açabilir5. Bu nüfusun tükürük bezi disfonksiyon iyi belgelenmiş iken, asiner hücrelerine hasar temel mekanizmaları tartışmalı olmuştur, ve farklı hayvan modelleri arasında az entegrasyon vardır5/6.
Tükürük bezi fonksiyonu ve radyasyona bağlı hasar eğitimi mevcut yöntemler in vivo modellerin kullanımı dahil, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları, iki boyutlu (2-D) Primer hücre kültürlerinin, ve üç boyutlu (3-D) salisphere kültürler8, 9,10,11,12. Geleneksel olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve 2-D kültürler hücre kültürü modelleri düz yüzeyler üzerinde kültürlü tek katmanlı hücreler içerir ve hızlı, kolay ve maliyet-etkili deney için değerlidir. Bununla birlikte, yapay hücre kültürü koşulları çeşitli koşullara maruz kalan hücrelerin farklılaşma durumunu ve fizyolojik yanıtlarını değiştirebilir ve sonuçlar genellikle tüm organizmalar için14,15' e tercüme etme başarısız olur. Buna ek olarak, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinde DNA hasarı için tükürük bezi tepkisi için kritik p53 aktivite, modülasyon gerektirir16,17.
3-D salisphere kültürler, kültür erken zaman noktalarında kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiştir ve bu tükürük bezi hücrelerinin bu alt kümesinin radyosensitivite anlamak için yararlı olmuştur9,18. Tüm bu kültür modellerinin kritik bir sınırlaması, tükürük bezinin 3-b yapısının görselleştirilmesinde etkisiz olup, çeşitli katmanlar üzerinde hücre içi matris (ECM) ve hücreler arası etkileşimler de dahil olmak üzere, tükürük modülasyon açısından çok önemlidir. salgı15. Bir bütün olarak doku davranışını kapsar ama aynı zamanda tedavinin etkilerini incelemek için laboratuvar koşullarında manipüle edilebilir bir yöntem için ihtiyaç daha da radyasyon kaynaklı tükürük bezi temel mekanizmaları keşfetmek için gereklidir Disfonksiyon.
Canlı doku bölümleme ve kültür önceden belgelenmiştir19,20 ve genellikle beyin-doku etkileşimleri incelemek için kullanılan21. Önceki çalışmalarda, farelerden parotis (PAR) tükürük bezi dokusu yaklaşık 50 μm ' ye kadar yer aldı ve 48 h 'ye kadar Kültürlenmiş, daha sonra19' luk, hücre ölümü ve fonksiyon analizi yapıldı. Su ve Al. (2016) Bu metodoloji üzerinde, insan submandibular bezlerinin (SMGs) 35 μm veya 50 μm ' de 14 gün20' ye kadar bölünerek genişletilmiştir. Önerilen yöntem, 50 μm ve 90 μm ' de kesitli parotis ve submandibular tükürük bezleri ve kültürlerin 30 gün boyunca değerlendirilmesi içeren bir gelişmedir. Bir dizi doku kalınlığının kesilmesi yeteneği, apikal-basolateral Polarite ve salgılanma için innervasyon dahil olmak üzere hücresel süreçler için ilgili hücre hücresi ve hücre-ECM etkileşimlerini değerlendirmede önemlidir. Ayrıca, tükürük bezi dilimleri radyasyon kaynaklı tükürük bezi hasarı incelemek için bu kültür modelinin fizibilitesi belirlemek için kültürde iken ışınlanmış.
Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. Kalıcı Post-diseksiyon olan maksimum zaman bölümlerini belirlemek için, tripan mavi boyama, canlı hücre boyama ve hücre ölümü için immunhistokimyasal boyama yapıldı. Özel hücre popülasyonları, morfolojik yapıları ve proliferasyon düzeylerini değerlendirmek için Konfokal mikroskobik ve immünofluorescent boyama kullanılmıştır. Doku bölümü kültürlerinin de bu 3-b modelinde çeşitli işaretçileri üzerinde radyasyon etkilerini belirlemek için iyonlaştırıcı radyasyon maruz kalmıştı. Hücre ölümü indüksiyonu, sitorinasyon bozulması, ayrım işaretçileri kaybı ve ışınlanmış ex vivo kültürlerde telafi edici proliferasyon, In vivo modellerin önceki çalışmalarla karşılaştırıldı. Bu metodoloji, radyasyon hasarını takiben hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmak için bir yol sağlar ve terapötik müdahalelerin etkinliğini (gen manipülasyonları veya farmakolojik ajanlar) etkili bir şekilde değerlendirmek için deneysel bir model sağlar ) in vivo modellerde daha az uygun olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Vibratome for sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Edge Stainless Steel Razor Blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td>Low-melt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-745H</td>
			<td>PSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite UltraGel Control Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchased at hardware store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Natural Red Sable Round Paintbrush</td>
			<td>Princeton Art &#38; Brush Co</td>
			<td>7400R-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1676045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-8158-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutatmine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Elements</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN1676549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12585014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R2625-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3160602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>150-90-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell Cell Culture Insert</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td>12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td>Only used LIVE dye component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9129S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-E-cadherin Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SMA Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-amylase Antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab28364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUBB3 Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>5568S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A20185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21568-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde Prills</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5027632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New England Nuclear Blocking Agent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2346249</td>
			<td>No longer sold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SPSII Spectral Confocal</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt-60 Teletherapy Instrument</td>
			<td>Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amac Box, Clear</td>
			<td>The Container Store</td>
			<td>60140</td>
			<td>Agarose block mold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radiation treatment of organotypic cultures from submandibular and parotid salivary glands models key in vivo characteristics

Hiposalivasyon ve ağız kuruluğu, radyoterapi ile tedavi edilen baş ve boyun kanseri hastalarında yaşam kalitesini azaltan kronik sözlü komplikasyonlar yaratır. Tükürük bezi fonksiyon bozukluğu ve restorasyon mekanizmalarının anlaşılması için deneysel yaklaşımlar, sistematik olarak terapötik adaylara ve transfeksiyon verimliliklerini ekrana getiren bir yetersizlik ile engelli olan in vivo modellerde duruldu belirli genler işlemek için yeteneği. Bu tükürük bezi organotypic kültür protokolünün amacı, kültürün en uygun süresini değerlendirmek ve ex vivo radyasyon tedavisinden sonra hücresel değişiklikleri karakterize etmektir. 30 günlük kültür döneminde belirli hücre nüfus ve işaretçileri ne zaman bulunduğunu belirlemek için immünofluorescent boyama ve Konfokal mikroskopisi kullandık. Buna ek olarak, daha önce in vivo radyasyon modellerinde bildirilen hücresel işaretler, ex vivo ışınlanmış kültürlerde değerlendirilir. İleriye doğru hareket eden bu yöntem, tükürük fonksiyonunu geliştiren terapötik ajanlar için duvar ve insan tükürük bezi dokusu yanıtlarının hızlı ex vivo değerlendirmesi için cazip bir platformdur.

Primer 2-D kültürlerinde fetal sığır serumu (FBS) tamamlayıcı ortamlarda yetiştirilen, primer 3-D salisphere kültürü genellikle serum içermeyen koşullarda kültürlenmiştir10,11. Buna ek olarak, tükürük bezlerinden vibratom kültürlerini kullanan iki önceki çalışmalar% 0 veya% 10 FBS tamamlayıcı medyadaki bölümlerini kültürlü19,20. Fare submand...

Watch this Scientific Journal Video about Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics at JoVE.com

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...

Bu protokol, hücrenin doku içindeki çeşitli hücre tipleri arasındaki hücre etkileşimlerinin değerlendirilmesi ve vivo'da daha az uygulanabilir olacak eski vivo moleküler ve farmakolojik manipülasyonların değerlendirilmesini sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu doku bölümlerinin kültürde daha sonraki zaman noktalarında değerlendirilmelerine olanak sağlayan uzun süre yitirilmesidir. Bu teknik tükürük bezi hasarı düzeltmek için terapötik bileşiklerin daha hızlı bir tarama sağlayacak ve büyük olasılıkla bu çalışmalar için kullanılan fare sayısını azaltacaktır.Bu tekniği, ara zaman noktalarında radyoterapiye tükürük bezi yanıtını anlamak ve genleri belirli aralıklarla açıp kapatmak için kullanmayı planlıyoruz. Bu işlemin en zor yönü doku kesiti ve kültür ve boyama adımları sırasında doku kesitlerinin kaybını önlemektir. İşleme başlamadan önce çıkarılabilir vibratom bileşenlerini %70 etanol ile dezenfekte edin ve ardından uv sterilizasyonunu en az 30 dakika boyunca uygulayın.Buzun düşmesini önlemek için tampon tepsinin üzerine ek bir laboratuvar filmi kağıdı yerleştirin ve buz haznesini ezilmiş buzla doldurun. Tampon tepsiden laboratuvar filmini çıkarın ve tampon tepsiyi %1 penisilin streptomisin ampisilin veya PSA ile birlikte 100 mililitre buz gibi PBS ile doldurun. Daha sonra bıçak tutucuya paslanmaz çelik jilet yerleştirin ve bıçağın açısının ayarını kolaylaştırmak için bir tornavida kullanın.Tükürük bezleri izole sonra, steril bir içine hasat doku yerleştirin 30 milimetrelik bir kültür çanak buz gibi pbs iki mililitre içeren 1% PSA ile takviye. Otoklavlı forceps kullanarak, kalıbın altına bezleri aktarın ve sıvı ile doku kapağı 3%düşük erime noktası agarose. Forseps kullanarak, uygun düzlemde bloğun ortasına doku ayarlayın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde agarose blok yerleştirin.Agarose sertleştiğinde, kalıbın dış kenarına dikkatlice jilet çalıştırın ve bloğun UV sterilize edilmiş laboratuvar filmine kaymasına izin verin. Tükürük beziiçeren bir agarose kutusunu kesmek için jilet kullanın, bölümün düzlemi düz ve bloğun karşı tarafına paralel olduğunu özen. Bloğu kesme yüzeyine takmak için süper yapıştırıcı kullanın ve 100 hertz frekansTa saniyede 0,075 milimetre hızda vibratom üzerinde 50 veya 90 mikrometre kalınlığında kesitler elde edin.Daha sonra, bölümleri, elde edilen buz gibi pbs bir mililitre içeren 24 kuyu doku kültürü çanak bireysel kuyular içine aktarmak için bir otoklavlı doğal saç boya sıcağı kullanın. Tüm bölümler edinildiğinde, kullanım ve otoklavlı mikro spatula tek tek 0.4 mikrometre dökmek boyutu membran ekler her kuyuda 24 kuyu doku kültür plakası içeren 300 vibratom kültür orta kuyusu başına 300 mikrolitre. Daha sonra plakayı nem oranı yla birlikte 37 derece santigrat derece ve %5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin, her kuyunun alt kısmındaki orta yısınve 30 güne kadar gerektiği gibi her gün membran astarlarına 40 mikrolitre orta madde ekleyin.Dokuları ışınlamak için, sıcaklık dalgalanmaları önlemek ve radyasyon tek bir beş sınıf doz ile bölümleri tedavi etmek için kapalı bir strafor konteyner içinde ışınlayıcı tesise bölümleri aktarın. Sonra kültürleri radyasyondan korunmaya karşı doku kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Doku bölümlerinin antikor boyama için, steril PBS en az iki beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın ve dört derece santigrat bir gecede% 4 paraformaldehit bölümleri düzeltmek.Ertesi sabah pbs ile üç kez yıkama küçülme % 1 sığır serum albumin ve 0.1% Triton X-100 veya PBT ile takviye, 30 dakika pbs 0.3% Triton X-100 ile dokuları permeabilizing önce. Bir saat boyunca %1 normal keçi serumu ile takviye edilen bloke edici ajanile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engellemeden önce pbt'de üç kez bölümleri yıkayın. Daha sonra ilgi uygun birincil antikor gecede bölümleri kuluçka.Primer 2D tükürük bezi kesit kültürlerinin parlak alan mikroskop görüntüleri test serum takviyesi tüm konsantrasyonları altında kültür 30 güne kadar canlı dokuların varlığını ortaya koymaktadır. Bu temsili kültür dilimlerinin proliferatif kapasitesi Ki-67 immünboyama ile değerlendirildi ve bu işarether zaman değerlendirme noktasında gözlendi. Cleaved Caspase-3 pozitif hücrelerin düşük düzeyde de 30 gün tespit küçük bir artış ile her zaman noktalarında gözlendi.30 günlük kültür dönemi boyunca hem submandibular hem de parotis bezi dilimlerinde e-kadherin boyama gözlendi. Düz kas aktin pozitif hücreleri ve sitosiskelet organizasyonu kültür dönemi boyunca benzer düzeylerde saptandı. Benzer şekilde, amilaz ve aquaporin-5 gibi fonksiyonel proteinler de tespit edildi, 14.Buna karşılık, CD31 ve TUBB3 her iki bezde de kültür dönemi boyunca sürekli olarak ifade edilmemiştir ve 30 günlük kültür dönemi boyunca farklı dönemlerde tutulan doku bileşenlerinin çeşitliliği olduğunu düşündürmektedir. Her iki bezde ışınlanmış dilimler benzer proliferatif apoptotik ve sitoskeletal değişiklikleri taklit in vivo gözlendi. Bölümler küçük ve hassas olduğu için vibratomdaki PBS banyosundaki bölümleri kültür plakasına ve boyama işlemleri sırasında hareket ettirirken dikkatli olun.Kesit kültürleri in vivo ile daha yakından ilişkili koşullar altında olmanın yararı ile en hücre hattı kültür yöntemleri ile tedavi edilebilir. Bunun diğer araştırmacıların deneylerine dahil etmeleri için güçlü bir teknik olacağını tahmin ediyoruz. Vibratom üzerindeki bıçak keskindir ve elleçleme yaparken yorgun olmak için eklemek zor olabilir.Ayrıca trypan mavi boya toksik ve kanserojen bu yüzden tüm PP yönergeleri izleyin.

Research

JoVE Journal

Medicine

Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct

Wharton Kanalı üzerinden Fare Submandibular Tükürük Bezi kanülasyonu

Severe salivary gland hypofunction is frequently found in patients with Sj&ouml;gren's syndrome and those who receiving therapeutic 
irradiation in their ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Collecting Saliva and Measuring Salivary Cortisol and Alpha-amylase in Frail Community Residing Older Adults via Family Caregivers

Salivary measures have emerged in bio-behavioral research  that are easy-to-collect, minimally invasive, and relatively inexpensive  biologic markers of ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

Tükürük hipofonksiyonunun bir Sıçan Modelinde Retroductal Submandibuler Bezi damlatma ve yerelleştirilmiş fraksiyonlara Işınlama

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Yardımcısı - aerodinamik, planlama radyasyon tam radyoterapi tedavi planlama sistemi otomatik

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Fare tükürük işlevsel değerlendirme Pilokarpin stimülasyon aşağıdaki yolu ile radyasyon şeker

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Pluripotent kök hücre kaynaklı Teratomas Dış Beam radyasyon bir küçük-hayvan modelinde kullanarak hedeflenen ve seçici tedavisinde

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...