Name: electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode
Uploaded: 2019-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode at JoVE.com

Finanziamento per questo progetto è stato fornito da una sovvenzione dell'Istituto di neuroscienze di Melbourne (di PTG, PRJ & BVB).

Tutte le procedure di elettroretinogramma (ERG) sono state eseguite secondo le disposizioni del codice Australian National Health and Medical Research Council di pratica per la cura e l'uso di animali e sono state approvate dal comitato di etica animale istituzionale presso il Università di Melbourne.
1. preparazione buffer
<ol><li>Preparare il tampone pesce rosso Ringer 10x (1,25 M di NaCl, KCl di 26 mM, 25 mm CaCl2, 10mm MgCl2, glucosio di 100 mM, 100 mM HEPES) utili...

<ol>
	<li>Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).</li><li>Nguyen, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Recording+of+Electroretinography+and+Visual+Evoked+Potentials+in+Anesthetized+Rats.">Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).</li><li>Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. 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Letture di funzionali quali l'ERG sono diventati sempre più importanti in una suite di strumenti utilizzati per lo studio di zebrafish larvale8,9,12,14. A causa delle piccole dimensioni dell'occhio larvale zebrafish, micropipette di vetro sono state adattate come elettrodi di registrazione pubblicato più protocolli3,4,<sup ...

Il danio zebrato (Danio rerio) è diventato un ampiamente usato modello genetico di vertebrati, compreso gli studi di neuroscienze visual. La crescente popolarità di questa specie può essere attribuita ai vantaggi tra cui la facilità di manipolazione genetica, il sistema visual vertebrati altamente conservato (tipi di neurone, morfologia anatomica e organizzazione e genetica sottostante), alta fecondità e ridurre il costo di allevamento rispetto a modelli mammiferi1. Non invasivo elettroretinogramma (ERG) lungo è stato utilizzato clinicamente per valutare la funzione visiva umana e in ambito di laboratorio per quantificare la visione in una gamma di specie piccole e grandi, tra cui roditori e larvale zebrafish2,3 , 4 , 5. i componenti ERG più comunemente analizzati sono la a onda e b-fluttua, proveniente dalla luce-sensing fotorecettori e bipolare interneuroni, rispettivamente. In zebrafish larvale, strati distinti nella retina sono stabiliti dalla post-fecondazione 3 giorni (dpf) e la morfologia del cono fotorecettore terminale sinapsi maturo prima 4 dpf6,7. Funzione esterna della retina di zebrafish larvale è così stabilita prima 4 dpf, significato che l'ERG è misurabile da questa tenera età in poi. A causa del breve ciclo sperimentale e le proprietà di alto-rendimento del modello, l'ERG è stato applicato a larvale zebrafish per valutazione funzionale dei modelli di malattia, analizzando lo sviluppo di colore, visione e retinico, studiando i ritmi circadiani visual e test farmaci8,9,10,11,12.
Tuttavia, approcci attuali per zebrafish larvale ERG ha alcune complessità che possono rendere più difficile ad adottare. Zebrafish larvale pubblicate ERG protocolli comunemente utilizzano una micropipetta di vetro riempita con liquido conduttivo come la registrazione dell'elettrodo3,4,5,13, che richiede una micropipetta di alta qualità Suggerimento3. Attrezzature specializzate, come ad esempio un estrattore micropipetta e in alcuni casi una microforge, sono necessari per la loro fabbricazione. Questo può essere una sfida per i laboratori con risorse limitate e conduce a un costo aggiuntivo anche quando adattamento disponibili sistemi per ERG piccoli animali per la misurazione della funzione visiva zebrafish larvale. Anche quando levigata, la punta della micropipetta taglienti possa danneggiare la superficie dell'occhio larvale. Inoltre, i titolari delle imprese micropipetta per elettrofisiologia sono costruiti con un filo d'argento fisso. Questi fissi fili diventano passivati dopo uso ripetitivo, che richiede l'acquisto di nuovi supporti di costi di manutenzione maggiore.
Qui descriviamo un metodo ERG utilizzando un elettrodo di registrazione di spugna-punta a forma di cono, che è particolarmente utile per l'adeguamento stabilito piccoli animali ERG configurazioni per le misurazioni di ERG di zebrafish larvale. L'elettrodo è fatta facilmente utilizzando comune spugna di acetato di polivinile (PVA) e filo di argento fine senza qualsiasi altre attrezzature specializzate. I nostri dati indicano che questo romanzo elettrodo è sensibile e affidabile abbastanza per dimostrare lo sviluppo funzionale dei circuiti neurali retinici in zebrafish larvale tra 4 e 7 dpf. Questo elettrodo economico e pratico spugna-suggerimento può essere utile ai ricercatori che istituisce nuovi sistemi di ERG o la modifica di sistemi esistenti di piccoli animali, per gli studi di zebrafish.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Filters the 10&#215; goldfish ringer&#39;s buffer for sterilizatio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>DVR-5175</td>
			<td>With a 30G &#215; &#189;&#34; needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G &#215; &#189;&#34; needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN*3013R</td>
			<td>For adding saline toteh sopnge tip electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioamplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML135</td>
			<td>For amplifying ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td>King White</td>
			<td>9333441000973</td>
			<td>For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation water bath</td>
			<td>Lauda-Ko&#776;nigshoffen</td>
			<td>MGW Lauda</td>
			<td>Used to make the water-heated platfrom.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode lead</td>
			<td>Grass Telefactor</td>
			<td>F-E2-30</td>
			<td>Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganzfeld Bowl</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxeon LEDs</td>
			<td>Phillips Light Co.</td>
			<td></td>
			<td>For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 50-2625</td>
			<td>Holds the recording electrode during experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version 2010</td>
			<td>Spreadsheet software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisturizing eye gel</td>
			<td>GenTeal Gel</td>
			<td>9319099315560</td>
			<td>Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Copan</td>
			<td>200C</td>
			<td>Used to caredully transfer larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML785</td>
			<td>Controls the LEDs to generate stimuli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA sponge</td>
			<td>MeiCheLe</td>
			<td>R-1675</td>
			<td>For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>Aaxis Pacific</td>
			<td>13317002</td>
			<td>For electroplating silver wire electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scope Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>version 3.7.6</td>
			<td>Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver (fine round wire)</td>
			<td>A&#38;E metal</td>
			<td>0.3 mm</td>
			<td>Used to make recording and reference ERG electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td>For anaethetizing larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-heated platform</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode

Il danio zebrato (Danio rerio) è comunemente usato come un modello di vertebrati in studi evolutivi ed è particolarmente adatto per le neuroscienze visual. Per misure funzionali di prestazioni visive, l'elettroretinografia (ERG) è un metodo non invasivo ideale, che è stato affermato in specie di vertebrati superiori. Questo approccio è sempre più utilizzato per l'esame della funzione visiva in zebrafish, inclusi durante le prime fasi dello sviluppo larvale. Tuttavia, l'elettrodo di registrazione più comunemente usati per zebrafish larvale ERG fino ad oggi è l'elettrodo di una micropipetta di vetro, che richiede attrezzature specializzate per la sua fabbricazione, che presenta una sfida per i laboratori con risorse limitate. Qui, presentiamo un protocollo ERG larvale zebrafish utilizzando un elettrodo di spugna-punta a forma di cono. Il romanzo dell'elettrodo è più facile fabbricazione e maniglia, più economico e meno probabilità di danneggiare l'occhio larvale rispetto la micropipetta di vetro. Come metodi ERG precedentemente pubblicati, l'attuale protocollo è in grado di valutare la funzione retinica esterna attraverso dei fotorecettori e risposte delle cellule bipolari, l'a - e b-onda, rispettivamente. Il protocollo può illustrare chiaramente la raffinatezza della funzione visiva in tutto lo sviluppo iniziale delle larve di zebrafish, sostenendo l'utilità, la sensibilità e l'affidabilità dell'elettrodo romanzo. L'elettrodo semplificata è particolarmente utile quando organismo di modello che istituisce un nuovo sistema ERG o modifica esistente apparato ERG di piccoli animali per la misura di zebrafish, aiutando i ricercatori nelle neuroscienze visual utilizzare zebrafish.

Questa sezione fornisce risultati rappresentativi per ERG misurazioni effettuate ogni giorno da 4 a 7 dpf. Da 4 dpf, ERG risposte mostrano robusti componenti di onde a e b, che derivano da fotorecettori e cellule bipolari, rispettivamente. A ogni età testati, l'ampiezza delle onde b aumentato con intensità della luce (Figura 2; Figura 3). In particolare, la sensibilità della retina larvale zebrafish per dimmer lampi aumentato con l'età. L...

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Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

Qui, presentiamo un protocollo che semplifica la misurazione della luce dell'elettroretinogramma evocato le risposte dallo zebrafish larvale. Un elettrodo di romanzo spugna a forma di cono-Punta può contribuire a rendere lo studio di sviluppo visivo in zebrafish larvale utilizzando l'elettroretinogramma ERG più facile raggiungere con risultati attendibili e costi inferiori.

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Questo protocollo aiuta a semplificare le misurazioni di elettroretinogrammi o ENG nel pesce zebra larvale che fornisce un'importante lettura funzionale dello sviluppo visivo e dei modelli di malattie genetiche. Le punte di spugna morbida degli elettrodi di registrazione utilizzati in questo protocollo sono facili da produrre utilizzando materiali economici e prontamente disponibili ed evitano potenziali danni agli occhi larvali. L'elettrodo con punta in spugna più morbido può facilitare ripetute misurazioni ERG dello stesso occhio.Gli individui nuovi a questa procedura potrebbero avere difficoltà a lavorare sotto l'illuminazione rossa fioca utilizzata durante tutta la procedura. Ma è importante che l'adattamento oscuro sia mantenuto. Per preparare l'elettrodo di registrazione della spugna a forma di cono, tagliare l'estremità da un'estensione del piombo dell'elettrodo di platino e utilizzare un bisturi per rimuovere 10 millimetri del rivestimento isolante esterno in politetrafluoroetilene dalla nuova estremità dell'estensione.Tagliare un pezzo di 40 millimetri di un filo d'argento di 0,3 millimetri di diametro e intrecciare il filo d'argento con il filo interno esposto per fissare saldamente il filo al piombo dell'elettrodo. Racchiudere il giunto con nastro isolante lasciando esposta una lunghezza di circa 15 millimetri di filo d'argento. Collegare un altro filo al terminale negativo della batteria e immergere l'altra estremità del filo nella salina.Immergere il filo d'argento esposto in soluzione salina normale e collegare l'altra estremità al terminale positivo di una sorgente di corrente diretta a nove volt. Dopo 60 secondi, posizionare il filo sul tessuto assorbente per asciugare. Nel frattempo, tagliare un quadrato di 20 per 20 millimetri di spugna di acetato di polivinile a forma di cono e saturare la spugna in una volta il tampone di Ringer.Al microscopio leggero con una barra di scala sull'oculare, utilizzare una lama bisturi per modellare l'apice del cono a un diametro di circa 40 micrometri. Asciugare all'aria la spugna a forma di cono su carta velina assorbente fino a quando non è solida. Prima di inserire il filo d'argento nella spugna di acetato di polivinile a forma di cono solido essiccato attraverso la base del cono, utilizzando il nastro adesivo per isolare qualsiasi metallo esposto in eccesso per ridurre gli artefatti fotovoltaici.Il giorno dell'esperimento, immergere l'elettrodo con punta di spugna nel tampone di Ringer per 15 minuti per saturare completamente la spugna. Almeno otto ore prima delle registrazioni, posizionare non più di 20 larve di zebrafish in un unico tubo da 15 millilitri senza coperchio e avvolto in un foglio di alluminio in un'incubatrice scura. Alla fine dell'incubazione, versare il pesce zebra adattato al buio in una piastra di Petri sotto un'illuminazione rossa fioca da un diodo che emette luce.Per preparare la piattaforma di spugna, tagliare un pezzo di spugna di acetato di polivinile approssimativamente uguale di spessore alla profondità di una piastra di Petri di 35 millimetri in modo che la spugna si adatti perfettamente all'interno della piastra. Effettuare un piccolo taglio verticalmente attraverso un'estremità della spugna per ospitare il filo d'argento dell'elettrodo di riferimento e immergere la spugna nel tampone del pesce rosso Ringer fino a quando la spugna non è satura. Quindi posizionare la spugna in una piastra di petri pulita di 35 millimetri e utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire il liquido extra fino a quando nessuna soluzione trasuda dalla spugna in risposta a una leggera pressione delle dita.Per posizionare l'animale per l'esperimento, utilizzare una pipetta Pasteur di tre millimetri per trasferire una larva anestetizzata su un quadrato di carta assorbente di tre per tre centimetri e utilizzare le forcette per posizionare il quadrato sulla spugna inumidita. Utilizzando un pennello fine imbevuto nel tampone di Ringer, regolare la posizione della larva con un occhio rivolto verso l'alto e lontano da qualsiasi liquido sull'asciugamano sotto la larva. Glassare il corpo larvale con gel oculare idratante per mantenere l'animale idratato durante la registrazione dell'elettroretinogramma.E metti il piatto su una piccola piattaforma riscaldata ad acqua di fronte allo stimolo leggero della ciotola di Ganzfeld situato all'interno di una gabbia di Faraday. Inserire l'elettrodo di riferimento nel taglio realizzato nella spugna della piattaforma. E collegare un elettrodo di terra ottenuto commercialmente alla gabbia di Faraday.Fissare l'elettrodo di registrazione a un portaelettro e fissare il supporto al braccio stereotassico di un micromanipolatore. Utilizzando una pipetta Pasteur di tre millimetri, rivendere la punta della spugna dell'elettrodo con una goccia della soluzione di Ringer e posizionare il microscopio nella gabbia di Faraday sulla piattaforma elettroretinogramma. Utilizzare la punta di un tessuto assorbente per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso dalla punta della spugna dell'elettrodo e al microscopio, posizionare l'elettrodo attivo in modo che la punta della spugna tocchi delicatamente la superficie corneale centrale dell'occhio larvale zebrafish.Quindi spostare la ciotola di Ganzfeld verso la piattaforma di spugna facendo attenzione che la larva sia coperta dalla ciotola e chiudere la gabbia per ridurre il rumore elettromagnetico estraneo. La sensibilità della retina larvale di zebrafish a dimmer lampeggia aumenta con l'età. Poiché le onde a e b non sono riconoscibili a intensità inferiori a meno 1,61 log candela seconda al metro al quadrato a quattro giorni dopo la fecondazione, mentre segnali chiari sono rilevabili a queste intensità nelle larve più vecchie.L'ampiezza dell'onda B aumenta notevolmente tra i quattro e i cinque post fecondazione. A sette giorni, il segnale a 2,48 log candela secondo al metro al quadrato è maggiore rispetto ai giorni cinque e sei dopo la fecondazione. I tempi impliciti dell'onda A e b diventano significativamente più veloci dopo cinque giorni dopo la fecondazione.Nel complesso, questi risultati dimostrano una maturazione nella funzione retinica del pesce zebra tra i quattro e i sette giorni dopo la fecondazione. Per eseguire con successo questo protocollo è fondamentale che le spugne siano completamente sature di fluido che aiuta a mantenere la conducibilità dell'elettrodo di registrazione e abbassa i livelli di rumore. Se l'onda a è di particolare interesse, i trattamenti farmacologici possono essere applicati per bloccare la componente dell'onda b esponendo così l'onda a completa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

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