Name: electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode
Uploaded: 2019-03-27T15:00:00
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このプロジェクトのための資金によって提供された助成金からメルボルン神経科学研究所 (PTG、PRJ BVB と)。

網膜電図 (ERG) プロシージャがすべての動物の使用とケアのための実践規範のオーストラリア国立保健医療研究評議会の規定に従って行われた、動物倫理委員会で承認された、メルボルンの大学.
1. バッファー準備
<ol><li>金魚リンゲル液バッファー (1.25 M の NaCl、KCl 26 mM, 25 mm CaCl2、10 mM MgCl2, 100 mM グルコース、100 mM HEPES) x 10 の準備逆浸透 (RO) の水を使用し...

<ol>
	<li>Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).</li><li>Nguyen, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Recording+of+Electroretinography+and+Visual+Evoked+Potentials+in+Anesthetized+Rats.">Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).</li><li>Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. 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ERG など機能のリードアウトは、ゼブラフィッシュ稚魚8,9,12,14を研究に使用するツールのスイートでますます重要になっています。ゼブラフィッシュ稚魚の目のサイズが小さいためガラス マイクロ ピペットは、ほとんど公開されているプロトコル3,4...

ゼブラフィッシュ (動脈分布) 視覚神経科学の研究など、広く使用されている遺伝的脊椎動物モデルとなっています。この種の人気の高まりは、遺伝子操作、非常に節約された脊椎動物の視覚システム (ニューロンの種類、解剖学的形態および組織、および基になる遺伝学)、高い多産の使いやすさなどの利点に起因することができます。飼育哺乳類モデル1と比較しての低コスト。非侵襲的な局所網膜電図 (ERG) は、人間の視覚機能を評価するために臨床的に使用されています長いと齧歯動物およびゼブラフィッシュ稚魚2,3を含む大小の種の範囲のビジョンを定量化する実験室の設定で,4,5します。 最も一般的分析 ERG コンポーネントは、a 波と b 波、それぞれ光を感じる視細胞と双極ニューロンから発信されました。ゼブラフィッシュ稚魚における網膜の異なる層は、3 日後受精 (dpf) によって確立された、シナプス ターミナル光受容体円錐形の形態の 4 dpf6、7の前に成熟しました。ゼブラフィッシュ稚魚の外側の網膜機能は 4 dpf、ERG がこの初期の時代以降から測定可能なことを意味する前にこのように行われます。短い実験サイクルとモデルの高スループット特性のため ERG に適用されている疾患モデルにおける機能的アセスメントのゼブラフィッシュ稚魚カラー ビジョンと網膜の開発を分析、ビジュアルの概日リズムを勉強してテスト薬8,9,10、11,12。
しかし、ゼブラフィッシュ稚魚の現在アプローチ ERG は採用が困難になることがありますいくつかの複雑さを持っています。公開されたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルは一般的、記録電極3,4,5,として13、高品質マイクロ ピペットを必要とする導電性の液体で満たされたガラス ピペットを使用してください。ヒント3を。専門機器、マイクロ ピペットの引き手などマイクロフォージ、いくつかのケースでは、その製造に必要です。これは、限られた資源で研究所のための挑戦をすることができます、ゼブラフィッシュ稚魚視覚機能の測定に使用可能な小さな動物 ERG システムを適応させるときにも余分なコストに 。滑らかに、時でさえシャープ マイクロ ピペット チップは幼虫の眼の表面を損傷することが。さらに、電気生理学の商業マイクロ ピペット ホルダーは、固定の銀線で構成されます。これらのワイヤを固定になる増加維持管理費につながる新しいホルダーの購入を必要とする、繰り返し使用した後不動態処理されました。
ここでゼブラフィッシュ稚魚 ERG 測定の確立された小動物 ERG セットアップを適応させるために特に有用である円錐形のスポンジ チップ記録電極を用いた ERG 手法について述べる。電極が一般的なポリ酢酸ビニル (PVA) スポンジおよび他の専門にされた装置なし銀細線を使用して簡単になります。我々 のデータは、この新規電極は敏感であり 4 と 7 の dpf 間幼虫のゼブラフィッシュの網膜の神経回路の機能の開発を示すに十分な信頼性の高いことを見る。この経済的で実用的なスポンジ チップ電極は、エルグの新しいシステムを確立することやゼブラフィッシュ研究、小動物の既存のシステムを変更することは研究者に役に立つかもしれません。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Filters the 10&#215; goldfish ringer&#39;s buffer for sterilizatio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>DVR-5175</td>
			<td>With a 30G &#215; &#189;&#34; needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G &#215; &#189;&#34; needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN*3013R</td>
			<td>For adding saline toteh sopnge tip electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioamplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML135</td>
			<td>For amplifying ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td>King White</td>
			<td>9333441000973</td>
			<td>For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation water bath</td>
			<td>Lauda-Ko&#776;nigshoffen</td>
			<td>MGW Lauda</td>
			<td>Used to make the water-heated platfrom.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode lead</td>
			<td>Grass Telefactor</td>
			<td>F-E2-30</td>
			<td>Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganzfeld Bowl</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxeon LEDs</td>
			<td>Phillips Light Co.</td>
			<td></td>
			<td>For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 50-2625</td>
			<td>Holds the recording electrode during experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version 2010</td>
			<td>Spreadsheet software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisturizing eye gel</td>
			<td>GenTeal Gel</td>
			<td>9319099315560</td>
			<td>Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Copan</td>
			<td>200C</td>
			<td>Used to caredully transfer larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML785</td>
			<td>Controls the LEDs to generate stimuli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA sponge</td>
			<td>MeiCheLe</td>
			<td>R-1675</td>
			<td>For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>Aaxis Pacific</td>
			<td>13317002</td>
			<td>For electroplating silver wire electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scope Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>version 3.7.6</td>
			<td>Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver (fine round wire)</td>
			<td>A&#38;E metal</td>
			<td>0.3 mm</td>
			<td>Used to make recording and reference ERG electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td>For anaethetizing larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-heated platform</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode

ゼブラフィッシュ (動脈分布) の発達研究の脊椎動物モデルとして用い、視覚神経科学に特に適して。鳥類網膜電図 (ERG) は、視覚的なパフォーマンスの機能測定より高い脊椎動物種に確立されている理想的な非侵襲的な方法です。このアプローチは、ますますゼブラフィッシュ、発達初期の幼虫などの視機能を検査するため使用されています。日付に幼虫ゼブラフィッシュ ERG の最も一般的に使用される記録電極はガラス マイクロ ピペット電極は、限られた資源で研究所の挑戦を提示、その製造に特殊な機器が必要です。ここでは、円錐状のスポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚 ERG プロトコルを提案します。新規電極は製造してより経済的なガラス マイクロ ピペットより幼虫の目を損傷する可能性は低く、ハンドルに簡単です。以前に公開した ERG メソッドと同様現在のプロトコルはそれぞれ視細胞と双極細胞応答、a ・ b 波、外側の網膜機能を評価できます。プロトコルは、ユーティリティ、感度、および新規電極の信頼性を支えるゼブラフィッシュ幼虫の初期開発全体を通して視覚機能の改良を説明することが明らかに。簡易電極は、モデル生物の新しい ERG システムを確立または変更既存小動物 ERG 測定装置の試作ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュを使用する視覚神経科学の研究者を助ける時に便利です。

7 dpf に 4 から毎日取られる ERG 測定の代表的な結果を説明します。4 dpf ERG 応答を示す堅牢な a 波と b 波のコンポーネントがあり、それぞれ視細胞と双極細胞から生じる.テスト各歳、b 波の振幅増加光強度 (図 2;図 3)。特に、年齢と共に増加し調光が点滅するゼブラフィッシュ稚魚網膜の感度。A ・ b 波が明らかに信号が古い幼虫 (<stro...

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Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

ここでは、ゼブラフィッシュ稚魚から光誘発網膜電図反応の測定を簡素化するプロトコルを提案する.新規円錐状のスポンジ チップ電極は、ビジュアル開発の研究は、ゼブラフィッシュ稚魚網膜電図 ERG を信頼性の高い結果と低コストで達成するために簡単に使用する助けることができます。

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

このプロトコルは、視覚発達および遺伝病モデルの重要な機能的読み出しを提供する幼虫ゼブラフィッシュにおける電解図またはERGの測定を簡素化するのに役立ちます。このプロトコルで使用される記録電極の柔らかいスポンジ先端は経済的で容易に利用できる材料を使用して製造し易く、幼虫の目への潜在的な損傷を避ける。柔らかいスポンジチップ電極は同じ目の繰り返しERG測定を容易にすることができる。この手順に慣れた個人は、手順全体で使用される薄暗い赤色の照明の下で作業するのが難しいかもしれません。しかし、暗い適応が維持されるのが重要です。円錐形のスポンジ記録電極を準備するには、白金電極リードエクステンションから端を切り、メスを使用して延長の新しい端から外側のポリテトラフルオロエチレン断熱コーティングの10ミリメートルを除去します。直径0.3ミリメートルの銀線40ミリメートルを切り、銀線を露出したインナーワイヤーで巻き取り、電極リードにワイヤーをしっかりと取り付けます。約15ミリメートルの長さの銀線を露出させたまま絶縁テープでジョイントを包みます。別のワイヤーをバッテリーの負の端子に接続し、その他の端を生理線に浸します。露出した銀線を通常の生理学に浸し、反対側を9ボルト直流電流源の正の端子に接続します。60秒後、吸水組織にワイヤーを置いて乾燥させる。その間、ポリ酢酸ビニルスポンジの20 x 20ミリメートル平方メートルを円錐形に切り、リンゴの緩衝液を1回で飽和させます。接眼用のスケールバーを持つ軽い顕微鏡の下で、約40マイクロメートルの直径に円錐の頂点を形作るためにメスの刃を使用する。吸着性ティッシュペーパーの上にコーン状のスポンジを固体になるまで空気乾燥させます。乾燥した固体コーン状のポリ酢酸ビニルスポンジに銀線を挿入する前に、マスクテープを使用して余分な露出金属を絶縁して光起電力のアーティファクトを低減する。実験当日、スポンジ先端電極をリンガーのバッファーに15分間浸し、スポンジを完全に飽和させます。録音の少なくとも8時間前に、蓋なしで15ミリリットルチューブに20匹以下のゼブラフィッシュの幼虫を入れ、暗いインキュベーターでアルミニウム箔で包みます。インキュベーションの最後に、暗く適応したゼブラフィッシュを発光ダイオードから薄暗い赤い照明の下でシャーレに注ぎます。スポンジプラットフォームを準備するには、ポリ酢酸ビニルスポンジの一部を35ミリメートルのシャーレの深さにほぼ等しい厚さにカットして、スポンジが皿の中にぴったりと収まるようにします。参照電極の銀線を収容するためにスポンジの一方の端を縦に細かく切り、スポンジが飽和するまでスポンジを金魚リンガーのバッファに浸します。その後、スポンジをきれいな35ミリメートルのシャーレに入れ、薄い指のプレスに応答してスポンジから溶液が出なくなるまで余分な液体を吸収するためにペーパータオルを使用します。実験のために動物を配置するには、3ミリメートルのパスツールピペットを使用して麻酔幼虫を3センチメートル平方のペーパータオルに移し、鉗子を使用して湿らせたスポンジの上に正方形を置きます。リンガーのバッファーに浸した細かいブラシを使用して、片目を上向きにして、幼虫の下のタオルの液体から離れて幼虫の位置を調整します。幼虫の体を保湿眼用ゲルでグレーズし、電気レティノグラム記録全体で動物を水分補給し続けます。そして、ファラデーケージの中に位置するガンツフェルトボウルライト刺激の前に、小さな水で加熱されたプラットフォームに料理を置きます。リファレンス電極をプラットフォームスポンジで作ったカットに挿入します。そして、市販の接地電極をファラデーケージに接続します。記録電極を電極ホルダーに取り付け、マイクロマニピュレーターのステレオタックスアームにホルダーを固定します。3ミリメートルのパスツールピペットを使用して、リンガーの溶液の1滴で電極のスポンジ先端を再飽和させ、電極レチノグラムプラットフォーム上のファラデーケージに顕微鏡を配置します。吸収剤組織の先端を使用して、電極スポンジ先端から余分な液体を取り除き、顕微鏡の下で、スポンジ先端が幼虫ゼブラフィッシュの目の中央角膜表面に優しく触れるようにアクティブ電極を配置します。その後、ガンツフェルトボウルをスポンジプラットフォームに向かって移動させ、幼虫がボウルで覆われていることを考慮し、余分な電磁ノイズを減らすためにケージを閉じます。幼虫ゼブラフィッシュのレチナの調光に対する感受性は、年齢とともに増加する。A波とb波は受精後4日で1メートル当たりマイナス1.61ログカンデラ秒未満の強度では認識できないのに対し、古い幼虫ではこれらの強度で明確な信号が検出可能です。B波振幅は、受精後4~5回の間で著しく増加する。7日では、1メートル当たり2.48ログカンデラ秒の信号は、受精後5日と6日目に比べて大きくなります。A波とb波の暗黙の時間は受精後5日後に有意に速くなる。全体的に、これらの結果は、受精後4〜7日間の間にゼブラフィッシュのレチナル機能の成熟を示す。このプロトコルを正常に実行するには、スポンジが完全に液体で飽和し、記録電極の導電性を維持し、ノイズレベルを下げることが重要です。a波が特に関心がある場合、薬理学的治療を適用してB波成分をブロックし、それによって完全なa波を暴露することができる。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Using Touch-evoked Response and Locomotion Assays to Assess Muscle Performance and Function in Zebrafish

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

Zebrafish muscle development is highly conserved with mammalian systems making them an excellent model to study muscle function and disease. Many ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

血管内皮幹細胞の血管形成を視覚化するための新規乳腺脂肪移植技術

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

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調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

A 小説円錐状スポンジ チップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録

A 小説円錐状スポンジチップ電極を用いたゼブラフィッシュ稚魚における網膜電図記録