Name: electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode
Uploaded: 2019-03-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode at JoVE.com

Financiamento para este projeto foi fornecido por uma concessão do Instituto de neurociência de Melbourne (a PTG, PRJ & BVB).

Electroretinogram (ERG) todos os procedimentos foram realizados de acordo com as disposições do código de prática para o cuidado da saúde nacional australiano e o Medical Research Council e o uso de animais e foram aprovados pelo Comitê de ética animal institucional na Universidade de Melbourne.
1. preparação buffer
<ol><li>Preparar o 10x buffer de peixinho Ringer (1.25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10mm MgCl2, glicose de 100 mM, 100 mM HEPES) usando água de...

<ol>
	<li>Roper, C., Tanguay, R. L., Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). , 143-151 (2018).</li><li>Nguyen, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Recording+of+Electroretinography+and+Visual+Evoked+Potentials+in+Anesthetized+Rats.">Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e54158 (2016).</li><li>Chrispell, J. D., Rebrik, T. I., Weiss, E. 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Leituras funcionais como o ERG tornaram-se cada vez mais importantes na suíte de ferramentas usadas para estudar o zebrafish larval8,9,12,14. Devido ao pequeno tamanho do olho zebrafish larval, micropipetas de vidro foram adaptadas como gravação eletrodos em protocolos mais publicado3,4,5,</sup...

O peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um modelo de vertebrados genético amplamente utilizado, incluindo estudos de Neurociências visuais. A crescente popularidade desta espécie pode ser atribuída ao vantagens, incluindo a facilidade de manipulação genética, o sistema de visual vertebrado altamente conservado (neurônio e tipos de morfologia anatômica e organização genética subjacente), alta fecundidade e menor custo de produção animal em comparação com modelos mamíferos1. O electroretinogram não-invasiva (ERG) tem sido muito utilizado clinicamente para avaliar a função visual humana e na configuração de laboratório para quantificar a visão em uma variedade de espécies de grandes e pequenas, incluindo roedores e larval zebrafish2,3 , 4 , 5. os componentes ERG mais comumente analisados são a uma onda e onda b, provenientes do sensor de luz fotorreceptores e interneurônios bipolares, respectivamente. No zebrafish larval, camadas distintas na retina são estabelecidas pela fertilização pós de 3 dias (dpf) e a morfologia do cone fotorreceptoras terminal sinapses maduro antes 4 dpf6,7. Função da retina exterior de zebrafish larval é assim estabelecida antes dpf 4, significando que o ERG é mensurável nesta idade precoce em diante. Por causa do curto ciclo experimental e as propriedades de alto rendimento do modelo, o ERG foi aplicado ao larval zebrafish para avaliação funcional dos modelos da doença, analisando o desenvolvimento de visão e da retina de cor, estudando visual dos ritmos circadianos e teste de drogas8,9,10,11,12.
No entanto, as abordagens atuais para zebrafish larval ERG tem algumas complexidades que podem dificultar a adoptar. Publicado zebrafish larval ERG protocolos geralmente usam uma micropipeta de vidro cheia com líquido condutor, como a gravação de eletrodo3,4,5,13, que exige uma micropipeta de alta qualidade Dica3. Equipamentos especializados, tais como um puxador de micropipeta e em alguns casos, um microforge, são necessários para o seu fabrico. Isto pode ser um desafio para os laboratórios com recursos limitados e leva a custos extras, mesmo quando adapta disponíveis pequenos animais ERG sistemas para medição de função visual zebrafish larval. Mesmo quando alisado, a ponta afiada micropipeta pode danificar a superfície do olho larval. Além disso, micropipeta comercial os suportes para eletrofisiologia são construídos com um fio de prata fixo. Estas fixa os fios se tornam passivadas após uso repetitivo, exigindo a compra de novos titulares, levando a manutenção do aumento dos custos.
Aqui nós descrevemos um método de ERG usando um eletrodo gravação de esponja-ponta em forma de cone, que é particularmente útil para configurações ERG pequeno-animal estabelecidas para medições de ERG zebrafish larval a adaptação. O eletrodo é feito facilmente usando a esponja comum de acetato de polivinila (PVA) e fio de prata fino sem outros equipamentos especializados. Nossos dados mostram que este romance eletrodo é sensível e confiável o suficiente para demonstrar o desenvolvimento funcional de circuitos neurais da retina no zebrafish larval entre 4 e 7 dpf. O eletrodo de ponta em esponja econômico e prático pode ser útil para pesquisadores, o estabelecimento de novos sistemas ERG ou modificando os sistemas existentes de pequenos animais, para estudos de zebrafish.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>Filters the 10&#215; goldfish ringer&#39;s buffer for sterilizatio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>DVR-5175</td>
			<td>With a 30G &#215; &#189;&#34; needle to add drops of saline to the electrode sponge tip to prevent drying and increased noisein the ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G &#215; &#189;&#34; needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN*3013R</td>
			<td>For adding saline toteh sopnge tip electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioamplifier</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML135</td>
			<td>For amplifying ERG signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td>King White</td>
			<td>9333441000973</td>
			<td>For an alternative method of sliver electrode chlorination. Active ingredient: 42 g/L sodium hypochlorite.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulation water bath</td>
			<td>Lauda-Ko&#776;nigshoffen</td>
			<td>MGW Lauda</td>
			<td>Used to make the water-heated platfrom.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode lead</td>
			<td>Grass Telefactor</td>
			<td>F-E2-30</td>
			<td>Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday Cage</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing dark adaptation and enclosing the Ganzfeld setup to improve signal-to-noise ratio.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganzfeld Bowl</td>
			<td>Photometric Solution International&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxeon LEDs</td>
			<td>Phillips Light Co.</td>
			<td></td>
			<td>For light stimulation twenty 5W and one 1W LEDs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>BS4 50-2625</td>
			<td>Holds the recording electrode during experiments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version 2010</td>
			<td>Spreadsheet software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moisturizing eye gel</td>
			<td>GenTeal Gel</td>
			<td>9319099315560</td>
			<td>Used to cover zebrafish larvae during recordings to avoiding dehydration. Active ingredient: 0.3 % Hypromellose and 0.22 % carbomer 980.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Copan</td>
			<td>200C</td>
			<td>Used to caredully transfer larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powerlab data acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML785</td>
			<td>Controls the LEDs to generate stimuli.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA sponge</td>
			<td>MeiCheLe</td>
			<td>R-1675</td>
			<td>For the placement of larval zebrafish and making the cone-shaped electrode ti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>Aaxis Pacific</td>
			<td>13317002</td>
			<td>For electroplating silver wire electrode.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scope Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>version 3.7.6</td>
			<td>Simultaneously triggers the stimulus through the Powerlab system and collects data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver (fine round wire)</td>
			<td>A&#38;E metal</td>
			<td>0.3 mm</td>
			<td>Used to make recording and reference ERG electrodes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td>Used to shape and measure the cone-shaped sponge apex (with scale bar on eyepiece). Positioned in the Faraday cage for electrode placement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>E10521-50G</td>
			<td>For anaethetizing larval zebrafish.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-heated platform</td>
			<td>custom-made</td>
			<td></td>
			<td>For maintianing the temperature of the sponge platform and the larval body during ERG recordings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram recording in larval zebrafish using a novel cone-shaped sponge-tip electrode

O peixe-zebra (Danio rerio) é comumente usado como um modelo de vertebrados em estudos do desenvolvimento e é particularmente adequado para a neurociência visual. Para a medição funcional de desempenho visual, estudos de electroretinografia (ERG) é um método não-invasivo ideal, que tem sido bem estabelecido em espécies de vertebrados superiores. Esta abordagem é cada vez mais sendo usada para examinar a função visual no zebrafish, incluindo durante os estágios iniciais de desenvolvimento larvas. No entanto, o eletrodo de gravação mais comumente usados para larval zebrafish ERG até à data é o eléctrodo de micropipeta de vidro, que exige equipamentos especializados para sua fabricação, apresentando um desafio para os laboratórios com recursos limitados. Aqui, apresentamos um protocolo ERG zebrafish larval usando um eletrodo esponja-ponta cônica. O eléctrodo de romance é mais fácil fabricação e punho, mais econômico e menos susceptível de danificar o olho larval que a micropipeta de vidro. Como métodos ERG anteriormente publicados, o atual protocolo pode avaliar função da retina exterior através do fotoreceptor e respostas de célula bipolar, o a - e b-onda, respectivamente. O protocolo claramente pode ilustrar o refinamento da função visual ao longo do desenvolvimento precoce de larvas de peixe-zebra, apoiando o utilitário, sensibilidade e confiabilidade do eléctrodo romance. O eletrodo simplificado é particularmente útil quando estabelecer um novo sistema ERG ou modificação de aparelho ERG pequeno-animal existente para medição de zebrafish, auxiliando os pesquisadores em Neurociências visuais para usar o zebrafish do organismo modelo.

Esta seção fornece resultados representativos para medições de ERG tomadas diariamente de 4 a 7 dpf. De 4 dpf, ERG respostas show robustos componentes a e b-onda, que surgem de fotorreceptores e células bipolares, respectivamente. Em cada idade testada, a amplitude da onda-b aumentou com a intensidade de luz (Figura 2-; Figura 3). Notavelmente, a sensibilidade da retina larval zebrafish para flashes redutor aumentada com a idade. O a - e...

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Electroretinogram Recording in Larval Zebrafish using A Novel Cone-Shaped Sponge-tip Electrode

Electroretinogram gravação no Zebrafish Larval usando eletrodo de esponja-ponta em forma de Cone de romance A

Aqui, apresentamos um protocolo que simplifica a medição de luz electroretinogram evocado respostas de zebrafish larval. Um eletrodo de esponja-ponta cónica romance pode ajudar a tornar o estudo de desenvolvimento visual no zebrafish larval usando o electroretinogram ERG mais fácil de conseguir com resultados confiáveis e menor custo.

The zebrafish (Danio rerio) is commonly used as a vertebrate model in developmental studies and is particularly suitable for visual neuroscience. For ...

Este protocolo ajuda a simplificar as medidas de eletroretinogramas ou ERGs em zebrafish larval que fornece uma leitura funcional importante do desenvolvimento visual e modelos de doenças genéticas. As pontas de esponja macia de gravação de eletrodos usados neste protocolo são fáceis de fabricar usando materiais econômicos e prontamente disponíveis e evita danos potenciais aos olhos larvais. O eletrodo mais macio com ponta de esponja pode facilitar repetidas medições de ERG do mesmo olho.Indivíduos novos neste procedimento podem achar difícil trabalhar sob a iluminação vermelha fraca que é usada durante todo o procedimento. Mas é importante que a adaptação sombria seja mantida. Para preparar o eletrodo de gravação de esponja em forma de cone, corte a extremidade de uma extensão de chumbo eletrodo de platina e use um bisturi para remover 10 milímetros do revestimento de isolamento de politetrafluoroetileno externo da nova extremidade da extensão.Corte um pedaço de 40 milímetros de um fio de prata de 0,3 milímetros de diâmetro e entrelaça o fio de prata com o fio interno exposto para fixar o fio com segurança ao chumbo do eletrodo. Encarnar a junta com fita isolante deixando um comprimento de aproximadamente 15 milímetros de fio de prata exposto. Conecte outro fio ao terminal negativo da bateria e mergulhe a outra extremidade do fio no soro fisiológico.Mergulhe o fio de prata exposto em soro fisiológico normal e conecte a outra extremidade ao terminal positivo de uma fonte de corrente direta de nove volts. Após 60 segundos, coloque o fio no tecido absorvente para secar. Enquanto isso, corte um quadrado de 20 por 20 milímetros de esponja de acetato de polivinyl em uma forma de cone e saturar a esponja em uma vez tampão de Ringer.Sob um microscópio leve com uma barra de escala na ocular, use uma lâmina de bisturi para moldar o ápice do cone a aproximadamente 40 micrômetros de diâmetro. Seque o ar da esponja em forma de cone em papel de tecido absorvente até ficar sólido. Antes de inserir o fio de prata na esponja de acetato de polivinil em forma de cone sólido seco através da base do cone, usando fita adesiva para isolar qualquer excesso de metal exposto para reduzir artefatos fotovoltaicos.No dia do experimento, mergulhe o eletrodo de ponta esponja no tampão de Ringer por 15 minutos para saturar totalmente a esponja. Pelo menos oito horas antes das gravações, coloque não mais do que 20 larvas de zebrafish em um único tubo de 15 mililitros sem tampa e envolto em papel alumínio em uma incubadora escura. No final da incubação, despeje o zebrafish adaptado à escuridão em uma placa de petri sob iluminação vermelha fraca de um diodo emissor de luz.Para preparar a plataforma de esponja, corte um pedaço de esponja de acetato de polivinyl aproximadamente igual em espessura à profundidade de uma placa de petri de 35 milímetros para que a esponja se encaixe perfeitamente dentro da placa. Faça um pequeno corte verticalmente através de uma extremidade da esponja para acomodar o fio de prata do eletrodo de referência e mergulhe a esponja no tampão de Ringer de peixe dourado até que a esponja esteja saturada. Em seguida, coloque a esponja em uma placa de petri de 35 milímetros limpa e use uma toalha de papel para absorver o líquido extra até que nenhuma solução exale da esponja em resposta a uma prensa de dedo leve.Para posicionar o animal para o experimento, use uma pipeta Pasteur de três milímetros para transferir uma larva anestesiada para um quadrado de três por três centímetros de papel toalha e use fórceps para colocar o quadrado na esponja umedeçada. Usando uma escova fina encharcada no tampão de Ringer, ajuste a posição da larva com um olho voltado para cima e para longe de qualquer líquido na toalha sob a larva. Esmalte o corpo larval com gel ocular hidratante para manter o animal hidratado durante toda a gravação do eletroretinograma.E coloque o prato em uma pequena plataforma aquecida à água em frente ao estímulo leve da tigela ganzfeld situado dentro de uma gaiola faraday. Insira o eletrodo de referência no corte feito na esponja da plataforma. E conectar um eletrodo terrestre obtido comercialmente à jaula de Faraday.Conecte o eletrodo de gravação a um suporte de eletrodo e fixe o suporte no braço estereotipado de um micromanipulador. Usando uma pipeta Pasteur de três milímetros, ressaturar a ponta da esponja do eletrodo com uma gota da solução de Ringer e posicionar o microscópio na gaiola de Faraday sobre a plataforma de eletroretinograma. Use a ponta de um tecido absorvente para remover qualquer excesso de líquido da ponta da esponja de eletrodo e sob o microscópio, posicione o eletrodo ativo para que a ponta da esponja toque suavemente a superfície córnea central do olho de zebrafish larval.Em seguida, mova a tigela ganzfeld em direção à plataforma de esponja tomando cuidado para que a larva esteja coberta pela tigela e feche a gaiola para reduzir o ruído eletromagnético estranho. A sensibilidade da retina de zebrafish larval para dimmer pisca com a idade. Como as ondas a e b não são reconhecíveis em intensidades inferiores a menos 1,61 log candela segundo por metro quadrado a quatro dias após a fertilização, enquanto sinais claros são detectáveis nessas intensidades nas larvas mais antigas.A amplitude da onda B aumenta significativamente entre quatro e cinco pós-fertilização. Aos sete dias, o sinal a 2,48 log candela segundo por metro quadrado é maior em comparação com os dias cinco e seis pós-fertilização. Os tempos implícitos de ondas A e B tornam-se significativamente mais rápidos após cinco dias após a fertilização.No geral, esses resultados demonstram um amadurecimento na função de retina de zebrafish entre quatro a sete dias após a fertilização. Para executar com sucesso este protocolo é fundamental que as esponjas estejam totalmente saturadas com fluido, o que ajuda a manter a condutividade do eletrodo de gravação e reduz os níveis de ruído. Se a onda a for de interesse particular, tratamentos farmacológicos podem ser aplicados para bloquear o componente de onda B, expondo assim a onda A completa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Imageamento ao vivo de interações celulares imunes inatas e pré-neoplásicas usando um sistema de indução de expressão Gal4/UAS em pele larval de peixe-zebra

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Biologia do Desenvolvimento

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

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Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

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