Name: capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00
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La financiación fue proporcionada por el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en el Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); Universidad de Illinois en Chicago Inicio fondos (L.M.S.); Donación de 543296 de la Alianza de fondo de investigación de cáncer de ovario (M.D.); y ES029073 UG3 (J.E.B.) y por el centro nacional para avanzar traslacional Ciencias, Instituto Nacional de salud, a través de subsidio UL1TR002003 (JEB & LMS).

Todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con directrices para los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobaron por el Comité institucional de Animal de uso y cuidado (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. preparación de reactivos
<ol><li>Mantener células del epitelio oviducto murino (MOE) a 37° C con 5% CO2 en una incubadora humidificada en alfa medios medio esencial mínimo (αMEM) suplementados con suer...

<ol>
	<li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model.">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).</li><li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+Metabolic+Exchange+with+Imaging+Mass+Spectrometry.">Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li><li>Li, H., Hummon, A. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Grade+Serous+Ovarian+Carcinomas+Originate+in+the+Fallopian+Tube.">High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube.</a> Nature Communications. 8 (1), (2018).</li><li>Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+A+Stimulates+Migration+of+the+Fallopian+Tube+Epithelium,+an+Origin+of+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer,+through+Non-Canonical+Signaling.">Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling.</a> Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).</li><li>King, S. M., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+Progenitor+Cells+of+Ovarian+Cancer:+Analysis+of+Current+Animal+Models.">Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models.</a> BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).</li><li>Reznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+Metabolic+Variation+across+Tumor+Types.">Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types.</a> Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).</li><li>Watkins, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Impact+of+Selective+and+Nonselective+Beta-Blockers+on+Survival+in+Patients+with+Ovarian+Cancer:+Beta-Blockers+and+Ovarian+Cancer+Survival.">Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival.</a> Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).</li><li>Lutgendorf, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-Related+Mediators+Stimulate+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion+by+Two+Ovarian+Cancer+Cell+Lines.">Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines.</a> Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).</li><li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+Hormone-Mediated+Invasion+of+Ovarian+Cancer+Cells.">Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).</li><li>Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Matrix+Deposition+on+Dried+Agar+for+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+of+Microbial+Cultures.">Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).</li><li>Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Crosstalk+between+the+Fallopian+Tube+and+the+Ovary+That+Drives+Primary+Metastasis+of+Ovarian+Cancer.">Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).</li><li>Armaiz-Pena, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Activation+by+&#946;-Adrenoreceptors+Is+a+Key+Switch+for+Tumour+Metastasis.">Src Activation by &#946;-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis.</a> Nature Communications. 4, 1403 (2013).</li><li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness.">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).</li></ol>

Hay un cuerpo creciente de evidencia que implica el papel de la norepinefrina en el HGSOC12,17,18, y esta técnica ha aportado información más mecanicista. Con al menos ocho condiciones biológicas presentes en la misma diapositiva, el método puede explicar controles biológicos tales como gene y especificidad celular así como controles de los medios de comunicación en un solo IMS. Mientras que el método fue optimizado eva...

Espectrometría de masas (IMS) de imágenes ha sido optimizada para caracterizar la distribución espacial de características moleculares en tres aplicaciones ampliamente utilizadas: rebanadas de tejido, esferoides y colonias microbianas1,2,3. Rebanadas de tejido pueden utilizarse para evaluar la localización de los metabolitos en el contexto de las condiciones biológicas en un host, ya sea dirigido o no dirigido dentro de un intervalo específico de masa. Sin embargo, las diferencias entre características moleculares son los más evidentes y significativos comparados con un tejido sano es una condición enferma, por ejemplo, un tumor. Este enfoque IMS es particularmente adaptado a la detección de biomarcadores de la enfermedad, sin embargo, adquirir muestras de tejido en etapas discretas de progresión de la enfermedad (por ejemplo, grados de tumor) impide la identificación de señales que podrían ser importantes para la iniciación de la de la enfermedad. El intercambio de información a través del espacio es una característica omnipresente de muchos sistemas biológicos, y rebanadas de tejido no pueden capturar esta dinámica química relé. Una técnica que es capaz de visualizar la difusión y el intercambio químico es IMS de microbianas colonias cultivadas en placas de agar; pequeñas moléculas son capaces de difundir a través de y en el agar y pueden ser capturadas mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de desorción/ionización espectrometría de masas4. Esta configuración de crecimiento puede utilizarse para identificar moléculas intercambiadas entre entidades biológicas discretas (colonias) y también puede determinar la direccionalidad de la producción del metabolito. La plataforma diseñada originalmente para el crecimiento de la Colonia microbiana se adaptó para explorar el metabolismo primario de explantes de tejido convertido células de mamífero, y IMS se utilizó para evaluar el intercambio químico dinámico en un sistema mamífero in vitro.
En los últimos años, ha quedado claro que el cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC) a menudo se origina en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE) y luego se extiende por metástasis al ovario durante la enfermedad temprana de desarrollo5,6, 7 , 8. la razón por la que FTE tumorigenic células propagación al ovario, donde grandes tumores eventualmente forman y hacen metástasis más, es actualmente confusa. Investigaciones anteriores se ha centrado en el papel de proteínas ováricos primaria metástasis al ovario; sin embargo, recientemente ha sido demostrado que la transición de una saludable a un tejido tumorigenic resulta en interrupción masiva del metabolismo celular y altera la producción de moléculas pequeñas9,10,11. Por lo tanto, la hipótesis de que moléculas pequeñas entre la FTE y el ovario pueden ser en parte responsables primaria metástasis de HGSOC.
Con nuestro procedimiento IMS desarrollado recientemente, hemos determinado que cocultivo de FTE tumorigenic y tejido ovárico sano induce la producción de norepinefrina desde el ovario. Sin embargo, otros tipos de la célula o células FTE normales no provocan este efecto. Un beneficio extraordinario de este método es que se pueden visualizar la producción molecular e intercambio de señales que representan moléculas reales, por lo que incluso en un cocultivo es posible determinar la fuente de una señal. Esto es una ventaja sobre el análisis de las muestras homogeneizadas, donde se pierde toda la información espacial. En nuestro sistema modelo, hemos sido capaces de asignar claramente la producción de noradrenalina al ovario. La noradrenalina se ha relacionado con la metástasis y la quimiorresistencia de cánceres ováricos, y la detección de esta molécula ha validado que el novedoso método IMS puede descubrir moléculas biológicamente relevantes12,13, 14. Esta validación nos permite proponer que esta nueva aplicación de IMS puede ser particularmente útil para grupos que están intentando identificar moléculas pequeñas en entornos de cocultivo y para entender los acontecimientos tempranos que influyen en la transformación de la célula de investigación y metástasis. El objetivo general de este método es aclarar la identidad y la distribución espacial de moléculas pequeñas durante el intercambio entre los tejidos y órganos, representados en vitro los cultivos celulares 3D o tejido vivo ex .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tubes</td>
			<td>Denville</td>
			<td>C1017-O</td>
			<td>To collect cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PEZGS0816</td>
			<td>Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34998-4L</td>
			<td>Solvent for sprayed matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium (&#945;MEM)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td>Cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex speed MALDI-TOF LRF</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>For IMS data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>To collect cells and remove supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHCA Matrix</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td>8201344</td>
			<td>Matrix sprayed onto dried slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHB Matrix</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td>8201346</td>
			<td>Matrix sprayed onto dried slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-079-707</td>
			<td>For removal of the ovaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-804-6</td>
			<td>For removal of the ovaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Media mixed with agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epidermal growth factor</td>
			<td>Peprotech Inc.</td>
			<td>100-15</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>22-282</td>
			<td>For agarose aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estradiol-17&#946;</td>
			<td>Simga-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Denville</td>
			<td>fb5001</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexControl 3.4</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td></td>
			<td>IMS data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging 4.1</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td></td>
			<td>IMS data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (fine)</td>
			<td>Fsiher</td>
			<td>22-327379</td>
			<td>For removal of the ovaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, Transferrin, Selenium (ITS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11074547001</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO-coated slide</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>8237001</td>
			<td>Platform for co-culture incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Media used during tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>Mixed with media for plating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media basin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td>Used to cut plastic dividers for divided chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Calibration Standard</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td>8206195</td>
			<td>Calibrant for medium mass range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phophorus red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>343-242-5G</td>
			<td>Calibrant for low mass range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab 2015</td>
			<td>Bruker Daltonic</td>
			<td></td>
			<td>IMS data statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Forceps (blunt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-875-8B</td>
			<td>For removal of the ovaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Technologies</td>
			<td>A116-50</td>
			<td>Added to matrix solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies</td>
			<td></td>
			<td>For applying matrix</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry

Espectrometría de masas (IMS) la proyección de imagen rutinaria se ha aplicado a tres tipos de muestras: tejido, esferoides y colonias microbianas. Estos tipos de muestras se han analizado mediante láser asistida por matriz de desorción/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) para visualizar la distribución de las proteínas, lípidos y metabolitos en muestras biológicas de interés. Hemos desarrollado un método de preparación de la novela muestra que combina las ventajas de las tres aplicaciones anteriores para abordar un enfoque underexplored para la identificación de comunicación química en cáncer, por la siembra de cultivos de células mamíferas en agarosa en cocultivo con tejidos sanos, seguidos de desecación de la muestra. Las células y tejidos de mamíferos son morfología en proximidad cercana, permitiendo la comunicación química a través de la difusión entre el tejido y las células. En momentos específicos, se seca la muestra basado en la agarosa de la misma manera que las colonias microbianas preparado para el análisis IMS. Nuestro método se desarrolló para modelar la comunicación entre el cáncer de ovario seroso de alto grado derivada de la trompa de Falopio como interactúa con el ovario durante la metástasis. Optimización de la preparación de la muestra dio como resultado la identificación de la noradrenalina como un componente clave de la química en el microambiente ovárico. Este nuevo método puede aplicarse a otros sistemas biológicos que requieren una comprensión de la comunicación química entre las células adyacentes o los tejidos.

Una óptimo secada diapositiva ITO tendrá como resultado una plana muestra desecada con mínimo sin arrugas en la superficie de la agarosa y agarosa piezas que mantienen la separación espacial de la diapositiva (figura 3). Figura 3A muestra secado óptimo, mientras que la figura 3B muestra las arrugas que deben ser evitadas. Esta optimización requiere cuidadoso monitoreo de la diapositiva en el ho...

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Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Molécula pequeña comunicación entre tejidos y células mediante espectrometría de masas en la proyección de imagen de captura

Un novedoso método de preparación de la muestra fue desarrollado para acomodar el cocultivo de células y tejidos para detectar cambio de molécula pequeña usando spectrometry total de la proyección de imagen.

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Nuestro protocolo puede mapear la comunicación química de moléculas pequeñas entre células y tejidos, y hemos aplicado específicamente esto para explorar moléculas pequeñas en la metatesis de cáncer de ovario. La principal ventaja de nuestra técnica es la capacidad de medir moléculas pequeñas de una manera libre de etiquetas mientras se mantiene la integridad espacial de las células y tejidos en 2D. Esta técnica nos ha permitido interrogar la contribución de pequeñas moléculas en las metástasis del cáncer de ovario de una manera no objetivo.Esto podría revelar nuevas dianas terapéuticas y vías que previamente han sido pasadas por alto. Esta metodología podría extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer que se pueden cultivar en agarosa y cualquier otra enfermedad en la que un componente espacial podría ser importante para el fenotipo celular resultante. Asegurar que todas las células y componentes estén en la mano y la paciencia con el proceso de secado es esencial para este protocolo.Un paso de desicación apresurado a menudo puede conducir a datos de espectrometría de masas de mala calidad. La demostración visual de este método es útil para comprender nuestros pasos de preparación y desicación de muestras, ya que se desvían en gran medida de los experimentos típicos de espectrometría de masas por imágenes que utilizan tejidos o microbios en el agar. Para empezar, licuar la agarosa a 70 grados Celsius en un plato caliente.Coloque el divisor de ocho pozos encima de la diapositiva tratada con ITO. Mediante el tratamiento estándar de la trippsina, recoja las células MOE en un tubo cónico de 15 mililitros, centrífuga, y agregue una vez medios DMEM a resuspend para obtener una concentración de 50.000 células por cada 150 microlitros, que es dos veces la densidad final deseada. Para coculturas indivisas, utilice fórceps para agregar explanta ovárica al centro de los cuatro pozos.Justo antes del enchapado, combine 200 microlitros de suspensión celular y 200 microlitros de agarosa licuada en tubos individuales de dos mililitros. Evite las burbujas de aire durante el pipeteo. Inmediatamente, agregue 300 microlitros de la mezcla de agarosa celular a cada pozo, y aplique una suave presión descendente continua sobre el divisor para asegurar que no se filtren ni mezclen entre pozos.Asegúrese de que no haya burbujas de aire y que el ovario permanezca en el centro del pozo. Si la agarosa pipetado alteró el ovario, utilice suavemente la punta de la pipeta para centrarla antes de que la agarosa se enfríe. Luego, incuba el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada.Para coculturas divididas, corte los divisores de plástico fino y liso. Se utilizan los lados de una cuenca de medios estéril y desechable. Cortarlos lo suficientemente ancho para encajar perfectamente en la hipotenusa del pozo.Coloque el divisor de ocho pozos en la parte superior de la corredera tratada con ITO e inserte divisores de plástico diagonalmente en pozos. Preparar cultivos celulares como se hizo anteriormente, y combinar 100 microlitros de suspensión celular y 100 microlitros de agarosa licuada en un tubo de dos mililitros. Inmediatamente, placa 150 microlitros de la mezcla de agarosa celular en un lado del divisor manteniendo la presión hacia abajo en el divisor.Deje que la agarosa se enfríe y solidifique durante aproximadamente un minuto, y luego retire el divisor. Utilice fórceps para colocar el ovario explant en el centro de la mitad vacía del pozo. Añadir 150 microlitros de mezcla de células-agarosa sobre la parte superior del ovario.Incubar el tobogán a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Después de cuatro días, retire el divisor de la cámara de los tapones de agarosa. Con una espátula plana, separe los lados de la agarosa de la cámara y tire suavemente de la cámara hacia arriba.Si se mueve algún tapón de agarosa, vuelva a colocarlos suavemente para que no se toquen unos a otros. Coloque el portaobjetos en un horno Celsius de 37 grados durante aproximadamente cuatro horas y gire 90 grados cada hora para garantizar una distribución uniforme del calor a lo largo de la muestra. El portaobjetos debe estar completamente seco.De lo contrario, puede provocar una explosión de la muestra en el entorno de alto vacío del espectrómetro de masas MALDI-TOF. Secar la diapositiva y monitorear el progreso es el paso más crítico para lograr una alta resolución espacial y espectros de masa de calidad. Si se produce descamación o arrugas excesivas, no recomendamos recopilar los datos de espectrometría de masas.Con los parámetros establecidos en el pulverizador de matriz, aplique la solución de matriz a la diapositiva. Para utilizar Phosphorus Red como calibrador, agregue un microlitro de Phosphorus Red a un punto claro en la diapositiva. Para utilizar la mezcla de péptidos como calibrador, mezcle con la matriz en Parafilm en una relación de uno a uno para ayudar a la ionización, y detecte 0.5 a un microlitro en la diapositiva.Espere a que el calibrador se seque antes de la adquisición de datos de espectrometría de masas por imágenes. Dibuje una X utilizando un marcador permanente en cada esquina de la diapositiva y tome una imagen óptica usando una cámara o un escáner a 1200 ppp. En este experimento, un control cuidadoso del portaobjetos en el horno es esencial para asegurar un portaobjetos ITO seco óptimo, lo que resulta en una muestra plana desecada con arrugas mínimas o nulas a través de la superficie de la agarosa.Esta figura muestra las arrugas que deben evitarse. Las arrugas pueden afectar ligeramente a la altura y, por lo tanto, a la precisión de masa de las señales de espectrometría de masas de imágenes. Las arrugas leves no afectarán la calidad de los datos.Un tejido localizado de forma óptima debe estar lo más cerca posible del centro. El tejido utilizado debe estar en el centro del pozo si no está dividido o en el centro del medio triángulo si se divide para que la adquisición de datos IMS no esté contaminada con efectos de borde. El tejido mal posicionado, cuando se muestra en imagen, puede dar lugar a señales de masa falsas de los efectos del borde.La imagen de diapositiva seca se utiliza para enseñar al espectrómetro de masas MALDI-TOF qué regiones se deben imaginar. Se seleccionaron pequeñas regiones alrededor del tejido ovárico para el IMS a 50 micrómetros. Se muestra una imagen representativa de una señal m-over-z para coculturas no divididas, así como para la configuración de cámara dividida.Lo más importante a recordar es que los datos resultantes son tan buenos como la preparación de la muestra. Preste especial atención al proceso de secado. El aspecto más emocionante es validar las pequeñas moléculas descubiertas de esta manera utilizando otros experimentos, como ensayos de invasión o ensayos de colonización, para informar sobre la concentración efectiva y traducir a la biología humana.Esperamos que esto abra la puerta para descubrir nuevas vías de posibles dianas terapéuticas para el cáncer de ovario mediante una mejor comprensión de los procesos en la metatesis primaria del cáncer de ovario.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

Human pituitary adenoma (PA) is a common tumor that occurs in the human pituitary gland in the hypothalamus-pituitary-targeted organ axis systems, and may ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Un modelo de ratón preclínica de Osteosarcoma a definir la comunicación mediada por vesículas extracelular entre Tumor y las células madre mesenquimales

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Caracterización de células del Tumor mediante un alambre de médico para la captura de circulación de las células del Tumor: un enfoque 3D basada en la inmunofluorescencia y DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

Distinción basada en la morfología entre sanas y patológicas de las células utilizando transformadas de Fourier y mapas de auto-organización

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Extracción de metabolitos acuosos de células adherentes cultivadas para análisis metabolómicos por electroforesis capilar-espectrometría de masas

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Preparación de Mitocondrias a partir de tejidos de cáncer de ovario y tejidos ováricos de control para el análisis proteómico cuantitativo

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...