Name: imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells
Uploaded: 2019-11-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells at JoVE.com

AH var en modtager af en Diabetes UK PhD Studentship, EV blev støttet af OXION-Wellcome Trust træningsprogram, AIT afholdt en Oxford biomedicinsk Forskningsråd postdoc stipendium.

Alle metoder, der er beskrevet her, er udviklet i overensstemmelse med Det Forenede Kongeriges lov (videnskabelige procedurer) Act (1986) og University of Oxford etiske retningslinjer.
1. Isoler mus bugspytkirtel Holme
<ol><li>Forbered dyrkningsmediet og isolations opløsningen.<ol>
<li>Udgør dyrkningsmediet: RMPI1640 (Se tabel over materialer), suppleret med 10% af føtal kalv serum, 100 enheder/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin. Udlad mediet til 2 60 mm plastik Petri...

<ol>
	<li>Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocytochemical+and+morphometric+study+of+the+rat+pancreatic+islets.">An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets.</a> Journal of Anatomy. 186, 629 (1995).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-,+delta-and+PP-cells:+are+they+the+architectural+cornerstones+of+islet+structure+and+co-ordination.">Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).</li><li>F&#230;rch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+accompanied+by+increased+fasting+glucagon+and+delayed+glucagon+suppression+in+individuals+with+normal+and+impaired+glucose+regulation.">Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation.</a> Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).</li><li>Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+architecture+of+the+ATP-binding+site+of+the+KATP+channel+subunit+Kir6+2.">Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2.</a> The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).</li><li>Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+store-operated+mechanism+determines+the+activity+of+the+electrically+excitable+glucagon-secreting+pancreatic+alpha-cell.">A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell.</a> Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca+2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity+in+neural+circuits+with+genetically+encoded+indicators.">Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).</li><li>Tarasov, A. I., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 542, 289-311 (2014).</li><li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+mitochondrial+Ca(2+)+accumulation+regulates+ATP+synthesis+in+pancreatic+&#946;+cells.">Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic &#946; cells.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca2++indicators+directly+inhibit+the+Na,+K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity.">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> Elife. 5, 12727 (2016).</li><li>Theis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+Spike+Rate+Inference+in+Population+Calcium+Imaging.">Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging.</a> Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).</li><li>Hamilton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenaline+Stimulates+Glucagon+Secretion+by+Tpc2-Dependent+Ca(2+)+Mobilization+From+Acidic+Stores+in+Pancreatic+alpha-Cells.">Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells.</a> Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).</li><li>Adriaenssens, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+pancreatic+alpha,+beta+and+delta+cell+populations+identifies+delta+cells+as+a+principal+target+for+ghrelin+in+mouse+islets.">Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets.</a> Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+experimental+design+to+estimate+statistically+significant+periods+of+oscillations+in+time+course+data.">Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data.</a> PloS One. 9 (4), 93826 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+is+a+positive+autocrine+signal+for+glucagon+release.">Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release.</a> Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+real-time+hormone+release+kinetics+via+high-content+3-D+imaging+of+compensatory+endocytosis.">Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).</li><li>Knudsen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Glucagon+Secretion+by+Hyperglycemia-Induced+Sodium-Dependent+Reduction+of+ATP+Production.">Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production.</a> Cell Metabolism. , (2018).</li><li>Adam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarate+hydratase+deletion+in+pancreatic+&#946;+cells+leads+to+progressive+diabetes.">Fumarate hydratase deletion in pancreatic &#946; cells leads to progressive diabetes.</a> Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+approaches+and+software+for+clustering+islet+cell+functional+heterogeneity.">Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity.</a> Islets. 8 (2), 48-56 (2016).</li><li>Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+divergent+glucose+effects+on+calcium+metabolism+in+pancreatic+beta-+and+alpha+2-cells.">Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells.</a> Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Longo, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+cytosolic+free+Ca2+,+oxygen+consumption,+and+insulin+secretion+in+glucose-stimulated+rat+pancreatic+islets.">Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).</li><li>Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+raises+cytoplasmic+calcium+in+pancreatic+alpha+2-cells+by+mobilizing+calcium+incorporated+in+response+to+glucose.">Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose.</a> Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).</li><li>Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+cytoplasmic+Ca2++oscillations+in+stimulated+pancreatic+&#946;-cells.">Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic &#946;-cells.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).</li><li>Okamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytosolic+Ca2++in+impaired+sensitivity+to+glucose+of+rat+pancreatic+islets+exposed+to+high+glucose+in+vitro.">Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro.</a> Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).</li><li>Gilon, P., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+membrane+potential+changes+on+cytoplasmic+Ca2++concentration+in+an+electrically+excitable+cell,+the+insulin-secreting+pancreatic+B-cell.">Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).</li><li>Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+digital+image+analysis+of+glucose-induced+[Ca2+]i+oscillations+in+mouse+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks:+elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle.">Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li><li>Stout, A. L., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evanescent+field+excitation+of+fluorescence+by+epi-illumination+microscopy.">Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy.</a> Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).</li><li>Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-+and+hormone-induced+cAMP+oscillations+in+alpha-+and+beta-cells+within+intact+pancreatic+islets.">Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets.</a> Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).</li><li>Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+coupling+and+calcium+waves+in+the+pancreatic+islet.">Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).</li><li>van Gurp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intravital+imaging+reveals+in+vivo+dynamics+of+pancreatic+tissue+transplanted+under+the+kidney+capsule+in+mice.">Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice.</a> Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).</li></ol>

Der er tre stadier i protokollen, der er afgørende for den samlede succes. Vellykket injektion af Liberase enzym i galdegangen bestemmer ikke blot den kvantitative succes af isolations proceduren, men også påvirker kvaliteten af de isolerede Holme. Unoppustet pancreata kan resultere i mangel på nogle vigtige metaboliske reaktioner i de isolerede Holme. For det andet, lastning af farvestof/udtrykket af sensoren definerer signal-til-støj forholdet af time-lapse optagelse. Signaler er fraværende eller svækket i overb...

Formålet med metoden er at billede real-time ændringer i cytosolisk calciumkoncentration ([ca2 +]Cyt) i mindre delpopulationer af bugspytkirtel ø-celler. Dette gør det muligt at afdække de mekanismer, der styrer hormon sekretion i disse celler, afslørende detaljer om krydstale mellem forskellige celletyper og potentielt introducere en populationel dimension i det større billede af ø-signalering.
Holme består af flere celletyper. Ud over de mere velkendte insulin-udskilning β-celler, der er mindst to subpopulationer, der er også afgørende for reguleringen af blodglukose3. α-celler (der udgør omkring 17% af ø-celler) udskiller Glucagon, når blodglucose bliver for lav, hvilket signalerer frigivelse af glucose i blodbanen fra depoter i leveren. Overdreven Glucagon-niveauer (hyperglucagonæmi) og nedsat kontrol af Glucagon-Release ledsage (og, teknisk, kan bidrage til) den prædiab etiske tilstand af nedsat insulinfølsomhed4. δ-celler (ca. 2%) udskiller somatostatin som respons på glukose højde. Dette allestedsnærværende peptidhormon vil sandsynligvis være til stede ved høje koncentrationer i nærheden af α-og β-celler inden for Holme, som har en stærk Gi Receptor-medieret formildende virkning på både Glucagon og insulinsekretion.
α-celler og δ-celler deler en stor del af de glukose-sensing maskiner med deres nære afstamning slægtninge, β-celler. Alle tre celler typer er udstyret med ATP-følsomme K+ kanaler, udførlige metaboliske sensorer5 , der styrer plasma membranpotentialet i disse overgearet celler. Samtidig reguleres udskillelsen af insulin, somatostatin og Glucagon forskelligt af glucose. Billeddannelse af ca2 + dynamik i de to mindre delpopulationer af ø-celler kan derfor give et indblik i Cross-Talk mellem blodglukose og ø-sekretions produktion.
Tidlige forsøg på at overvåge excitabiliteten af α-og δ-celler ved hjælp af patch-clamp Elektrofysiologi blev snart efterfulgt af billeddannelse af ca2 + i enkelt α-og δ-celler. Identiteten af celler i disse eksperimenter blev verificeret via en efterfølgende farvning med anti-Glucagon eller anti-somatostatin antistoffer. Disse bestræbelser blev ofte hæmmet af konstateringen af, at ø-celler opfører sig meget forskelligt inden for øen og som enkeltceller. Selv om β-celler kan synes at være de vigtigste velgørere af øen arrangement (på grund af deres overvældende flertal, der ligger til grund for deres stærke elektriske kobling), den største uoverensstemmelse var, overraskende, fundet i α-celler. Inden for den intakte ø er disse celler konstant og vedvarende aktiveret ved lavt glucose, hvilket kun gælder for ca. 7% af enkelt dispergerede α-celler6. Indberetning af aktiviteten af α-og δ-celler inden for intakte Holme menes derfor at repræsentere en tættere tilnærmelse af in vivo-betingelser.
Generelt er der to måder at rapportere ca2 + dynamik specifikt fra α-celle eller δ-celle delpopulationer: (i) at udtrykke en genetisk kodet ca2 + sensor via en vævs specifik promotor eller (II) ved hjælp af markør forbindelser. Den mere elegante tidligere tilgang tilføjer den betydelige fordel af ægte 3D-billeddannelse og dermed studere celle fordeling inden for øen. Det kan dog ikke anvendes på intakt menneskeligt ømateriale. En anden potentiel bekymring er den "lækage" af arrangøren, især når β-/α-celle-Trans differentiering eller α-celle respons på høj glukose er på plads. Sidstnævnte fremgangsmåde kan anvendes med frisk isoleret væv, herunder humane prøver eller dyrkede Holme. Dataene indsamles dog udelukkende fra det perifere lag af ø-celler, da det er udfordrende at levere farvestof/markør molekyle i dybere lag uden at ændre den ø-arkitektur. En uventet fordel ved sidstnævnte fremgangsmåde er kompatibiliteten med Wide-Field Imaging mode, som tillader opskalering af eksperimenter til simultan billeddannelse af titusinder eller hundredvis af Holme (dvs. tusinder til titusinder af celler).
Calcium er afbildet in vivo ved hjælp af genetisk kodet gcamp7 (eller pericam8) familie sensorer, som er varianter af cirkulært permuteret grønt fluorescerende protein (gfp) smeltet til calcium bindende protein calmodulin og dets mål sekvens, M13 fragment af myosin lyskæde kinase7,9. Gcamps har fremragende signal-til-støj-forhold i rækken af nanomolær ca2 + koncentrationer og et højt 2-foton tværsnit, hvilket gør dem til et ideelt valg til in vivo arbejde10,11. Det udfordrende aspekt ved at bruge rekombinante sensorer er deres levering i cellerne. Heterologe udtryk kræver brug af en viral vektor og multi-time ex vivo-dyrkning, som ofte giver anledning til betænkeligheder med hensyn til potentiel afsondring eller forringelse af celle funktioner. Selvom musemodeller, der er udviklet til at udtrykke GCaMP, løser dette problem, tilføjer de nye udfordringer ved at øge gennemløbstiden betydeligt og begrænse arbejdet til en ikke-menneskelig model. Meget høj følsomhed over for ændringer af intracellulær pH er en anden negativ side af protein-baserede sensorer12, hvilket dog er mindre af et problem for at detektere oscillatoriske signaler, såsom ca2 +.
Fordelen ved opfanges farvestoffer (såsom grøn fluorescerende Fluo4) er, at de kan indlæses i frisk isoleret væv inden for omkring en time. Forudsigeligt, opfanges farvestoffer har lavere signal-til-støj nøgletal og (meget) lavere foto stabilitet end deres rekombinante modparter. Vi kan ikke bekræfte13 rapporterne om toksicitet af de opfanges farvestoffer14, men farvestof overbelastning er et hyppigt problem.
Røde rekombinante ca2 + sensorer baseret på cirkulær permutation har udviklet sig hurtigt siden 201115, og den seneste udvikling udgør en stærk konkurrence til gcamps16 for vævs Imaging, givet højere dybde penetration af rødt lys. Kommercielt tilgængelige rød opfanges farvestoffer kan anvendes pålideligt til enkelt celle-billeddannelse, men på vævsniveau, kan ikke konkurrere godt med de grønne analover.
Der er tilsyneladende meget lidt valg af billedteknologi til eksperimenter i væv, hvor out-of-fokus lys bliver et kritisk problem. Konfokale system giver acceptabel enkelt celle opløsning ved annullering af out-of-fokus lys med ethvert mål på Na over 0,3 (for tilfælde af GCaMP6) eller 0,8 (trappable farvestof). I teknisk forstand kan et konventionelt Konfokal mikroskop anvendes til simultan billeddannelse af [ca2 +]Cyt fra hundredvis (gcamp) eller snesevis af Holme (trappable Dye). Det eneste realistiske alternativ til konfokale mode i tilfælde af 3D-ekspression af sensoren i væv er måske lysplade mikroskopi.
Tingene er lidt anderledes for tilfældet, når sensoren er udtrykt i det perifere lag af celler inden for ø-vævet. For lyse rekombinante sensorer, der har et levende intracellulært udtryks mønster, kan brug af en Wide-Field Imaging-tilstand med en lav-NA-målsætning give tilstrækkelig kvalitet og belønne forskeren med en betydelig stigning i synsfeltet område og dermed Overførselshastighed. Et bredt felt system giver dårligere rumlig opløsning, da ikke-fokus lyset ikke annulleres; Derfor er billedbehandlings vævet med høj-NA (lav dybde af felt) mål mindre informativ, da single-celle signalet er voldsomt forurenet af tilstødende celler. Forureningen er meget mindre for lav-NA (høj dybde af felt) mål.
Der er dog opgaver, hvor høj dataoverførselshastighed og/eller samplingsfrekvens bliver en kritisk fordel. α-og δ-celler udviser betydelig heterogenitet, hvilket skaber en efterspørgsel efter høje stikprøvestørrelser for at afsløre subpopulationernes bidrag. Wide-felt Imaging er hurtig og mere følsom, med en industriel skala store Field-of-View system Imaging hundredvis (gcamp) eller TENS (Fluo4) af Holme ved samme signal-støj-forhold som de konfokale eksperimenter på ti eller en enkelt ø, hhv. Denne forskel i gennemløb gør det brede felt system fordelagtigt for befolkningsmæssige Imaging med en enkelt celle opløsning, som kan være særligt kritisk for små subpopulationer som δ-celle en. På samme måde vil forsøg på at rekonstruere elektrisk aktivitet fra ca2 + spiking17 drage fordel af den højere samplingfrekvens, der leveres af en Wide-Field Imaging-tilstand. På samme tid, flere "niche" problemer som aktiviteten af bugspytkirtel α-celler ved stimulering af den dominerende β-celle subpopulation, kræver brug af en konfokale system. En faktor, der påvirker beslutningen mod konfokale mode er tilstedeværelsen af betydelige kontaminerende signal fra β-celle subpopulation.
Selv om du bruger hormon-specifik antistof farvning til at kontrollere identiteten af cellerne efter billeddannelse eksperimenter er stadig en mulighed, kan mindre celle delpopulationer identificeres ved hjælp af funktionelle markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der blev vist at selektivt stimulere ca2 + dynamik i α-18 og δ-celler19,20, hhv.
Analysen af tidsforskudt billeddata har til formål at give oplysninger ud over triviel farmakologi, såsom populationelle heterogenitet, korrelation og interaktion mellem forskellige signaler. Konventionelt, imaging data analyseres som intensitet vs. tid og normaliseret til den oprindelige fluorescens (F/F0). Der er ofte behov for korrektion ved baseline på grund af blegning af fluoroforet-signalet eller kontaminering ved ændringer i autofluorescens eller ph (typisk induceret af millimolære niveauer af glucose12). Ca2 + data kan analyseres på mange forskellige måder, men tre vigtigste tendenser er at måle ændringer i Spike frekvens, plateau fraktion, eller område under kurven, beregnet vs. tid. Vi fandt den sidstnævnte fremgangsmåde fordelagtig, især i anvendelse på stærkt under samplede konfokale data. Fordelen ved pAUC metrisk er dens følsomhed over for både ændringer i signal frekvens og amplitude, hvorimod beregning af frekvensen kræver et betydeligt antal oscillationer21, hvilket er svært at opnå ved hjælp af konventionel billeddannelse. Den begrænsende faktor for pAUC analyse er dens høje følsomhed over for baseline ændringer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:779px;" width="779">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">40x/1.3 objective</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Axiovert 200 microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">emission</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">Excitation</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo4</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">&#160; F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector</td>
			<td style="width:277px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; solution&#160;</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liberase</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss LSM510-META confocal system</td>
			<td style="width:277px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells

Pancreas ø hormoner regulere blodglucose homøostase. Ændringer i blodglucose inducere svingninger af cytosolisk calcium i bugspytkirtlen ø-celler, der udløser sekretion af tre vigtigste hormoner: insulin (fra β-celler), Glucagon (α-celler) og Somatostatin (δ-celler). β-celler, som udgør størstedelen af ø-celler og er elektrisk koblet til hinanden, reagerer på glukose stimulus som en enkelt enhed. Excitabiliteten af de mindre delpopulationer, α-celler og δ-celler (udgør ca. 20% (30%) og 4% (10%) af de samlede henholdsvis gnaver1 (2) ø-cellenumre) er mindre forudsigelige og derfor af særlig interesse.
Calcium sensorer leveres ind i det perifere lag af celler inden for den isolerede ø. Den ø eller en gruppe af Holme er derefter immobiliseret og afbildet ved hjælp af en fluorescens mikroskop. Valget af Imaging mode er mellem højere gennemløb (Wide-felt) og bedre rumlig opløsning (confocal). Konventionelt, Laserscanning confokal mikroskopi bruges til billedbehandlings vævet, da det giver den bedste adskillelse af signalet mellem de tilstødende celler. Et bredt felt system kan også udnyttes, hvis det kontaminerende signal fra den dominerende population af β-celler minimeres.
Når calcium dynamikken som reaktion på specifikke stimuli er blevet registreret, udtrykkes data i numerisk form som fluorescens intensitet vs. tid, normaliseret til den oprindelige fluorescens og baseline-korrigeret, for at fjerne virkningerne forbundet med blegning af fluoroforet. Ændringer i spids frekvensen eller delarealet under kurven (pAUC) er beregnet til at kvantificere de observerede virkninger. pAUC er mere følsom og ganske robust mens spiking frekvens giver mere information om mekanismen af calcium stigning.
Mindre celle delpopulationer kan identificeres ved hjælp af funktionelle reaktioner på markør forbindelser, såsom adrenalin og ghrelin, der inducerer ændringer i cytosolisk calcium i en bestemt population af ø-celler.

Islets belastning ganske godt med de opfanges farvestoffer (figur 1A), medmindre lipid sammensætning afmembranener blevet påvirket (f. eks, ved kronisk eksponering for fedtsyrer). Den humane adenovirus type 5 (Ad5) vektor er også rettet mod alle ø-celler (figur 1B). Der kan opstå problemer, når mere end én rekombinant sensor udtrykkes i samme celle. Desuden er Holme typisk meget godt immobiliseret ved hjælp af teknologie...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells at JoVE.com

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Her præsenterer vi en protokol for billeddannelse og kvantificering af calcium dynamik i heterogene cellepopulationer, såsom pancreas-ø-celler. Fluorescerende reportere leveres ind i det perifere lag af celler inden for øen, som derefter er immobiliseret og imaged, og per-celle analyse af dynamikken i fluorescens intensitet udføres.

Imaging calcium dynamik i subpopulationer af mus bugspytkirtel ø-celler

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Protokollen tillader hurtig isoleret funktion af små delpopulationer af celler i bugspytkirtlen holme af Langerhans. Fordelene ved denne teknik omfatter real-time karakter og høj statistisk effekt, og dermed høj reproducerbarhed, af de erhvervede data. For at immobilisere holmene til billeddannelse skal du samle et billeddannelseskammer til et omvendt mikroskop og placere et glasdæksel slip inde i kammeret.Sørg for, at glaskammergrænsefladen er vandtæt, og bekræft, at dækslet er inden for mikroskopmålets rækkevidde. Dernæst skæres 20 med 20 millimeter kvadrater af fine og grove mesh og brug 45 til 50 mikrometer stykker tykt tape til at skabe to spacer vægge på et stykke finmasket. Nedsænk det grove mesh og en vægt i en 35 millimeter petriskål af billedbehandlingsopløsning, og læg finmasket under et dissekerende mikroskop.Vend finmasket med afstandsvæggene på hovedet og afstandserne opad. Og brug en p20 pipette til at overføre flere holme mellem de to afstandsløbere. Brug urmagere'snørke, placere mesh på hovedet inde i billeddannelse kammer af den omvendte mikroskop, således at afstandsspillerne vender nedad for at sidde direkte på kammeret dække slip, fældefangst holmene mellem afstandshuller og mesh i midten af dækslet slip.Pas på, at masken er godt hydreret uden at indeholde for store opløsningsmængder, som kan fremkalde prøvens laterale bevægelse. Derefter placere grove mesh og vægten på toppen af finmasket i kammeret, og tilsæt billedbehandling løsning til kammeret. Når holmene er blevet immobiliseret, skal du vælge billeddannelsestilstand og mål på det omvendte mikroskop og placere kammeret med holmene på mikroskopets temperaturstyrede fase.Efter indstilling af perfusionen skal indstrømningen placeres lavere end udstrømningen i kammeret, og udstrømningen indstilles til at være større end indstrømningsstrømmen. Sørg for, at udstrømningen har minimal kontakt med opløsningen, så den fjerner opløsningen i flere sekventielle små dråber, så du undgår lange intervaller for kontinuerlig opløsningsfjernelse. Dernæst indlede perfusion med billeddannelse løsning, der indeholder tre millimolar glukose, og vælg lys sti og filtre til billeddannelse grønne fluorophores.Kør derefter live imaging for at konfigurere billeddannelsesparametrene, og juster visningen for at fange de øer, der er af interesse. For at optimere signal-støj-forholdet i billedet skal du justere excitationslysintensiteten, eksponeringstiden og binningen, så indstillingerne giver mulighed for en tydelig visualisering af hver celle i holmene ved den minimale mulige lysintensitet og eksponering. Derefter billede holmene på 0,1 til fem hertz, kontrol kvaliteten af de erhvervede data, som det er fanget.Når alfacelleaktiviteten kan spores, skal du bruge et onlinediagram over signaldynamikken i anskaffelsessoftwaren som muligt og tilføje adrenalin eller glutamat i badløsningen i to til fem minutter. Et hurtigt hop i calcium efterfulgt af en afmatning eller annullering af alfacellesoscillationer vil blive observeret. Dernæst tilsættes ghrelin, som for nylig er blevet rapporteret til at aktivere deltaceller selektivt.En hurtig reversibel stigning i calcium vil blive observeret i en lille subpopulation af ø-celler. Derefter tilsættes 10 millimolar glukose. Der observeres et koordineret oscillerende respons i betacelleunderpopulationen.Bemærk også svarene fra celler, der tidligere blev aktiveret af adrenalin eller glutamat og ghrelin. Når du har gemt billederne, skal du importere dataene til et passende dataanalysesoftwareprogram og normalisere dataene for rå fluorescensintensitet til den oprindelige værdi af fluorescens. Hvis datasættet celle til cellevariiabilitetsintensitetsintensitet stadig er væsentligt, skal du definere et kontrolområde for det tidsrum, hvor kontrolløsningen blev anvendt.Hvis kontrolområdet har et klart ikke-oscillerende signal, antages det, at fluorescensintensiteten vendte tilbage til baseline efter hver anvendelse af kontrolopløsningen. Hvis du vil rette data om tidsforfald for hver celle, skal du opdele dataene i segmenter adskilt af de punkter, hvor kontrolløsningen blev tilføjet, og anvende lineær korrektion på hvert segment. Hvis kontrolområdet har tydelige svingninger, eller der er yderligere faktorer til stede, skal du bruge en algoritme til registrering af spidse.For at måle hyppigheden af calcium pigge og reaktionen på tilføjelsen af agonister og antagonister, opdele optagelsen i lige tidsintervaller, tælle pigge inden for intervallet, og normalisere til intervallet varighed til at beregne tidsforløbet af den delvise frekvens. Alternativt kan du indstille tærsklen og beregne plateaufraktionen for hvert af intervallerne. Brøken angiver den procentdel af tiden inden for det interval, som cellen har brugt i ophidset tilstand.Eller beregn det delvise område under kurven for hvert af intervallerne. Medmindre lipidsammensætningen af membranen er blevet påvirket, holme belastning ganske godt med tropiske farvestoffer. Den menneskelige adenovirus type 5 vektor også med succes mål ø-celler.Calcium spiking i alfaceller kan let påvises ved lave glukoseniveauer, og der er en høj celle-for-celle korrelation mellem aktiviteten ved lavt glukose og reaktionen på adrenalin og glutamat. Ghrelin aktiverer nogle adrenalinresponsive celler ved lavt glukose, men har ingen effekt på calciumdynamikken i de fleste af de celler, der aktiveres ved lavt glukose. Når analyseret i form af delvis frekvens, adrenalin eller ghrelin-stimulerede celler viser en betydelig stigning under alt-eller-intet betingelser, selv om de samlede ændringer mellem basal spiking og adrenalin-effekten er subtile.I modsætning hertil er det delvise område under kurven følsomt over for de ændringer, der indføres af adrenalin i alle cellerne, selv når den basale aktivitet er høj. Sørg for, at alle masker er i kontakt med billeddannelsesopløsning, og sørg for at placere vævet rimeligt tæt for at undgå luftbobler. Metoden kan udvides til at omfatte kunstig intelligens til differentiering mellem celletyperne.De farmakologiske markører kan erstattes af mønstergenkendelsesteknologien, hvilket reducerer optagetingstiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Metode til mus pancreasø Isolation og intracellulære cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Udarbejdelse af pancreas acinarceller til brug ved Calcium Imaging, celleskade Målinger og adenovirusinfektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...