Name: imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells
Uploaded: 2019-11-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells at JoVE.com

AH erhielt eine Diabetes UK PhD Studentship, EV wurde vom OXION-Wellcome Trust Training Programme unterstützt, AIT hielt ein Postdoktorandenstipendium des Oxford Biomedical Research Council.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit dem United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986) und den ethischen Richtlinien der Universität Oxford entwickelt.
1. Isolieren Sie Die Pankreasinseln der Maus
<ol><li>Bereiten Sie das Kulturmedium und die Isolationslösung vor.<ol>
<li>Bilden Sie das Kulturmedium: RMPI1640 (siehe Materialtabelle), ergänzt durch 10% fetales Kalbsserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin. Geben Sie d...

<ol>
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Das Protokoll besteht aus drei Phasen, die für den Gesamterfolg entscheidend sind. Die erfolgreiche Injektion des Enzyms Liberase in den Gallengang bestimmt nicht nur den quantitativen Erfolg des Isolationsverfahrens, sondern beeinflusst auch die Qualität der isolierten Inselchen. Ungeblähte Pankreata kann dazu führen, dass einige wichtige metabolische Reaktionen in den isolierten Inseln fehlen. Zweitens definiert die Belastung des Farbstoffs/der Expression des Sensors das Signal-Rausch-Verhältnis der Zeitrafferaufz...

Der Zweck der Methode besteht darin, Echtzeitveränderungen in der zytosolischen Kalziumkonzentration ([Ca2+]cyt) in kleineren Subpopulationen von Pankreas-Isletzellen abzubilden. Dies ermöglicht die Aufdeckung der Mechanismen für die Hormonsekretion in diesen Zellen, die Offenlegung von Details über das Cross-Talk zwischen verschiedenen Zelltypen und möglicherweise die Einführung einer Populationsdimension in das gesamte Bild der Islet-Signalisierung.
Inselchen bestehen aus mehreren Zelltypen. Neben den bekannteren Insulin-Sekret-Zellen gibt es mindestens zwei Subpopulationen, die auch bei der Regulierung des Blutzuckers3von entscheidender Bedeutung sind. Zellen (die etwa 17% der Ischenzellen ausmachen) sezernieren Glucagon, wenn der Blutzuckerzufluss zu niedrig wird, was auf die Freisetzung von Glukose aus den Depots in der Leber signalisiert. Übermäßige Glucagon-Spiegel (Hyperglucagonemie) und beeinträchtigte Kontrolle der Glucagon-Freisetzung begleiten (und, technisch gesehen, kann dazu beitragen), den prädiabetischen Zustand der beeinträchtigten Insulinempfindlichkeit4. •-Zellen (ca. 2%) Somatostatin als Reaktion auf die Glukoseerhöhung. Dieses allgegenwärtige Peptidhormon ist wahrscheinlich in hohen Konzentrationen in der Nähe von -- und -Zellen innerhalb von Inselchen vorhanden, was eine starke G i-Rezeptor-vermittelte Dämpfungswirkung sowohl auf Glucagon als auch auf Insulinsekretion hat.
Die Zellen und Zellen teilen sich einen großen Teil der Glukose-Sensing-Maschinerie mit ihren nahen Linienverwandten, den Zellen. Alle drei Zelltypen sind mit ATP-empfindlichen K+-Kanälen ausgestattet, aufwendigen Stoffwechselsensoren5, die das Plasmamembranpotenzial dieser erregbaren Zellen steuern. Gleichzeitig wird die Sekretion von Insulin, Somatostatin und Glucagon durch Glukose unterschiedlich reguliert. Die Abbildung der Ca2+-Dynamik in den beiden kleineren Subpopulationen von Isletzellen kann somit einen Einblick in den Quertalk zwischen Blutzucker und islet sekretoziellen Output geben.
Frühe Versuche, die Erregbarkeit von Zellen mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie zu überwachen, folgten bald der Bildgebung von Ca2+ in einzelnen Zellen. Die Identität der Zellen in diesen Experimenten wurde durch eine posteriori Färbung mit Anti-Glucagon oder Anti-Somatostatin-Antikörpern überprüft. Diese Bemühungen wurden häufig durch die Feststellung behindert, dass sich Die zellissenzellen innerhalb der Islet und als einzelne Zellen sehr unterschiedlich verhalten. Obwohl die Zellen die Hauptwohltäter der Ischenanordnung zu sein scheinen (aufgrund ihrer überwältigenden Mehrheit, die ihrer starken elektrischen Kopplung zugrunde liegt), wurde die Hauptabweichung überraschenderweise in den Zellen gefunden. Innerhalb der intakten Islet werden diese Zellen ständig und dauerhaft bei niedriger Glukose aktiviert, was nur für etwa 7% der einzelnen dispergierten Zellen6gilt. Es wird daher angenommen, dass die Berichterstattung über die Aktivität von Zellen innerhalb intakter Inselchen eine nähere Annäherung der In-vivo-Bedingungen darstellt.
Im Allgemeinen gibt es zwei Möglichkeiten, ca2+-Dynamik speziell aus den Subpopulationen von '-Zell oder -Zell zu melden: (i) Ausdrücke eines genetisch codierten Ca2+-Sensors über einen gewebespezifischen Promotor oder (ii) unter Verwendung von Markerverbindungen. Der elegantere frühere Ansatz fügt den wesentlichen Vorteil der echten 3D-Bildgebung und damit das Studium der Zellverteilung innerhalb der Islet hinzu. Es kann jedoch nicht für intaktes menschliches Isletmaterial angewendet werden. Ein weiteres potenzielles Problem ist die "Leakiness" des Promotors, insbesondere wenn die Transdifferenzierung oder die Reaktion der Zelle auf hohe Glukose vorhanden ist. Der letztgenannte Ansatz kann mit frisch isoliertem Gewebe einschließlich menschlicher Proben oder kultivierter Inselchen verwendet werden. Die Daten werden jedoch ausschließlich aus der peripheren Schicht von Ischenzellen gewonnen, da die Bereitstellung des Farbstoffs/Markermoleküls in tieferen Schichten, ohne die Isletarchitektur zu verändern, eine Herausforderung darstellt. Ein unerwarteter Vorteil des letztgenannten Ansatzes ist die Kompatibilität mit dem Wide-Field-Imaging-Modus, der es ermöglicht, die Experimente auf die gleichzeitige Abbildung von Dutzenden oder Hunderten von Inselchen (d. h. Tausende bis Zehntausende von Zellen) zu skalieren.
Calcium wird in vivo mit genetisch kodierten GCaMP7 (oder pericam8) Familiensensoren abgebildet, die Varianten von kreisförmig permutiertem grünem Fluoreszenzprotein (GFP) sind, die mit dem Calcium-bindenden Protein-Calmodulin und seiner Zielsequenz, dem M13-Fragment der Myosin-Lichtkettenkinase7,9, verschmolzen werden. GCaMPs haben hervorragende Signal-Rausch-Verhältnisse im Bereich der nanomolaren Ca2+ Konzentrationen und einen hohen 2-Photon-Querschnitt, was sie zu einer idealen Wahl für in vivo Arbeitenmacht 10,11. Der schwierige Aspekt des Einsatzes rekombinanter Sensoren ist ihre Abgabe in die Zellen. Die heterologe Expression erfordert die Verwendung eines viralen Vektors und eine mehrstündige Ex-vivo-Kultivierung, was häufig Bedenken hinsichtlich einer möglichen Entdifferenzierung oder Verschlechterung der Zellfunktionen aufwirft. Obwohl Mausmodelle, die bereits entwickelt wurden, um GCaMP auszudrücken, dieses Problem lösen, fügen sie neue Herausforderungen hinzu, indem sie die Vorlaufzeit erheblich erhöhen und die Arbeit auf ein nicht-menschliches Modell beschränken. Eine sehr hohe Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen des intrazellulären pH-Werts ist eine weitere nachteilige Seite der proteinbasierten Sensoren12, was jedoch weniger ein Problem für die Erfassung oszillatorischer Signale wie Ca2+darstellt.
Der Vorteil von trappablen Farbstoffen (wie z.B. grüne fluoreszierende Fluo4) ist, dass sie innerhalb von etwa einer Stunde in frisch isoliertes Gewebe geladen werden können. Wie vorherzusehen ist, haben abfangbare Farbstoffe ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis und (viel) geringere Photostabilität als ihre rekombinanten Pendants. Wir können13 Berichte über die Toxizität der abfangbaren Farbstoffe14nicht bestätigen, jedoch ist eine Farbüberlastung ein häufiges Problem.
Rote rekombinante Ca2+-Sensoren auf Basis kreisförmiger Permutation haben sich seit 201115rasant weiterentwickelt, und die jüngsten Entwicklungen stellen einen starken Wettbewerb zu GCaMPs16 für die Gewebebildgebung dar, da das rote Licht stärker in die Tiefe eindringt. Kommerziell erhältliche rote, abfangbare Farbstoffe können zuverlässig für die einzellige Bildgebung verwendet werden, können aber auf Gewebeebene nicht gut mit den grünen Analoga konkurrieren.
Es gibt scheinbar kaum eine Auswahl an Bildgebungstechnologie für Experimente im Gewebe, bei denen unkonzentriertes Licht zu einem kritischen Problem wird. Das konfokale System bietet eine akzeptable einzelzellige Auflösung durch Annullierung des nicht fokussierten Lichts mit einem beliebigen Objektiv auf der NA über 0,3 (für den Fall von GCaMP6) oder 0,8 (trappabler Farbstoff). Im technischen Sinne kann ein herkömmliches konfokales Mikroskop zur gleichzeitigen Abbildung von [Ca2+]Cyt aus Hunderten (GCaMP) oder Dutzenden von Inselchen (trappabler Farbstoff) verwendet werden. Die einzige realistische Alternative zum konfokalen Modus bei 3D-Expression des Sensors im Gewebe ist vielleicht die Lichtbogenmikroskopie.
Etwas anders sieht es bei dem Fall aus, wenn der Sensor in der peripheren Zellschicht innerhalb des Ischengewebes ausgedrückt wird. Für helle rekombinante Sensoren, die ein lebendiges intrazelluläres Expressionsmuster aufweisen, kann die Verwendung eines Breitfeld-Bildgebungsmodus mit einem Low-NA-Objektiv eine ausreichende Qualität bieten und den Forscher mit einer erheblichen Zunahme des Sichtbereichs und damit der Durchsatz. Ein Weitfeldsystem bietet eine schlechtere räumliche Auflösung, da das nicht fokussierte Licht nicht aufgehoben wird. Daher ist bildgebendes Gewebe mit hohen NA-Zielen (niedrige Schärfentiefe) weniger informativ, da das einzellige Signal durch benachbarte Zellen stark kontaminiert ist. Die Kontamination ist bei Zielen mit niedriger NA (hohe Schärfentiefe) viel kleiner.
Es gibt jedoch Aufgaben, bei denen ein hoher Durchsatz und/oder eine hohe Abtastrate zu einem entscheidenden Vorteil werden. Die Zellen weisen eine erhebliche Heterogenität auf, was eine Nachfrage nach hohen Stichprobengrößen erzeugt, um den Beitrag der Subpopulationen zu offenbaren. Die Großfeld-Bildgebung ist schnell und empfindlicher, wobei ein industrielles Großfeldsystem Hunderte (GCaMP) oder Dutzende (Fluo4) von Inselchen mit dem gleichen Signal-Rausch-Verhältnis wie die konfokalen Experimente an zehn bzw. einer einzelnen Insel abzeichnet. Dieser Unterschied im Durchsatz macht das Weitfeldsystem vorteilhaft für die populationsbildende Bildgebung mit einer Einzelzellauflösung, die besonders kritisch für kleine Subpopulationen wie die --Zell-Eins sein kann. Ebenso würden Versuche, die elektrische Aktivität von Ca2+ spiking17 zu rekonstruieren, von der höheren Abtastrate profitieren, die von einem Großfeld-Bildgebungsmodus bereitgestellt wird. Zur gleichen Zeit erfordern mehrere "Nischen"-Probleme wie die Aktivität von Bauchspeicheldrüsenzellen bei der Stimulation der dominierenden Subpopulation der Zelle die Verwendung eines konfokalen Systems. Ein Faktor, der die Entscheidung zum konfokalen Modus beeinflusst, ist das Vorhandensein eines erheblichen kontaminierenden Signals aus der Subpopulation der Zelle.
Obwohl die Verwendung von hormonspezifischer Antikörperfärbung zur Überprüfung der Identität der Zellen nach den bildgebenden Experimenten immer noch eine Option ist, können kleinere Zellsubpopulationen mit funktionellen Markerverbindungen wie Adrenalin und Ghrelin identifiziert werden, die nachweislich dieCa2+-Dynamik in den Zellen19,20bzw. selektiv stimulieren.
Die Analyse von Zeitraffer-Bildgebungsdaten zielt darauf ab, Informationen über die triviale Pharmakologie hinaus bereitzustellen, wie z. B. Populationsheterogenität, Korrelation und Interaktion verschiedener Signale. Üblicherweise werden bildgebende Daten als Intensität vs. Zeit analysiert und auf die anfängliche Fluoreszenz normalisiert (F/F0). Aufgrund des Bleichens des Fluorophorsignals oder der Kontamination durch Veränderungen der Autofluoreszenz oder des pH-Wertes (typischerweise induziert durch Millimolar-Glukosespiegel12) ist häufig eine Basiskorrektur erforderlich. Ca2+ Daten können auf viele verschiedene Arten analysiert werden, aber drei Haupttrends sind, Veränderungen in der Spitzenfrequenz, der Plateaufraktion oder dem Bereich unter der Kurve zu messen, berechnet vs. Zeit. Letzterer Ansatz war von Vorteil, insbesondere bei der Anwendung von stark untersampelten konfokalen Daten. Der Vorteil der pAUC-Metrik ist ihre Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen der Signalfrequenz und Amplitude, während die Berechnung der Frequenz eine beträchtliche Anzahl von Schwingungen21erfordert, was mit konventioneller Bildgebung schwer zu erreichen ist. Der begrenzende Faktor der pAUC-Analyse ist seine hohe Empfindlichkeit gegenüber Basisänderungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:779px;" width="779">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">40x/1.3 objective</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Axiovert 200 microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">emission</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">Excitation</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo4</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">&#160; F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector</td>
			<td style="width:277px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; solution&#160;</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liberase</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss LSM510-META confocal system</td>
			<td style="width:277px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells

Pankreas-Islet-Hormone regulieren die Blutzucker-Homöostase. Veränderungen des Blutzuckerspiegels induzieren Schwingungen von zytosolischem Kalzium in Pankreas-Isletzellen, die die Sekretion von drei Haupthormonen auslösen: Insulin (aus den Zellen), Glucagon (Zellen) und Somatostatin (Zellen). Die Zellen, die die Mehrheit der Ischenzellen ausmachen und elektrisch miteinander gekoppelt sind, reagieren auf den Glukosereiz als eine Einheit. Die Erregbarkeit der kleineren Subpopulationen, der Zellen und der Zellen (die etwa 20 % (30 %) ausmachen und 4% (10%) der gesamten Nagetier1 (Mensch2) Islet Zellzahlen, bzw.) ist weniger vorhersehbar und ist daher von besonderem Interesse.
Calciumsensoren werden in die periphere Zellschicht innerhalb der isolierten Islet abgegeben. Die Insel oder eine Gruppe von Inselchen wird dann immobilisiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Die Wahl des Bildgebungsmodus liegt zwischen höherem Durchsatz (Weitfeld) und besserer räumlicher Auflösung (konfokale). Konventionell wird die konfokale Laserscanning-Mikroskopie für die Abbildung von Gewebe verwendet, da sie die beste Trennung des Signals zwischen den benachbarten Zellen bietet. Ein Weitfeldsystem kann auch genutzt werden, wenn das kontaminierende Signal der dominierenden Population der Zellen minimiert wird.
Sobald die Kalziumdynamik als Reaktion auf spezifische Reize aufgezeichnet wurde, werden die Daten in numerischer Form als Fluoreszenzintensität vs. Zeit ausgedrückt, normalisiert auf die anfängliche Fluoreszenz und Baseline-korrigiert, um die Mitwirkungen der Bleiche der Fluorophor. Änderungen der Spitzenfrequenz oder des Teilbereichs unter der Kurve (pAUC) werden im Vergleich zur Zeit berechnet, um die beobachteten Effekte zu quantifizieren. pAUC ist empfindlicher und recht robuster, während die Spiking-Frequenz mehr Informationen über den Mechanismus der Kalziumerhöhung liefert.
Kleinere Zellsubpopulationen können mit funktionellen Reaktionen auf Markerverbindungen wie Adrenalin und Ghrelin identifiziert werden, die Veränderungen des zytosolischen Kalziums in einer bestimmten Population von Ischenzellen induzieren.

Inselchen laden ziemlich gut mit den abfangbaren Farbstoffen (Abbildung 1A), es sei denn, die Lipidzusammensetzung der Membran wurde beeinflusst (z. B. durch chronische Exposition gegenüber Fettsäuren). Der menschliche Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zielt auch auf alle Isletzellen ab (Abbildung 1B). Probleme können auftreten, wenn mehr als ein rekombinanter Sensor in derselben Zelle ausgedrückt wird. Darüber hinaus sind Inse...

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Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Das Protokoll ermöglicht eine schnelle isolierte Funktion kleiner Subpopulationen von Zellen innerhalb der Pankreasinseln von Langerhans. Zu den Vorteilen dieser Technik gehören die Echtzeit-Natur und die hohe statistische Leistung und damit die hohe Reproduzierbarkeit der erfassten Daten. Um die Inseln für die Bildgebung immobilisieren zu können, montieren Sie eine Bildkammer für ein invertiertes Mikroskop und legen Sie einen Glasdeckel in die Kammer.Stellen Sie sicher, dass die Glaskammerschnittstelle wasserdicht ist und bestätigen Sie, dass sich der Abdeckschlupfer in Reichweite des Mikroskopobjektivs befindet. Als nächstes schneiden Sie 20 mal 20 Millimeter Quadrate aus feinem und grobem Mesh und verwenden Sie 45 bis 50 Mikrometer Stücke dicken Klebebandes, um zwei Abstandswände auf einem Stück feinem Netz zu erstellen. Tauchen Sie das grobe Netz und ein Gewicht in eine 35-Millimeter-Petrischale der Bildgebungslösung ein und legen Sie das feine Netz unter ein Sezierendes Mikroskop.Drehen Sie das feine Netz mit den Abstandswänden auf den Kopf und den Abstandshaltern nach oben. Und verwenden Sie eine p20 Pipette, um mehrere Inselchen zwischen den beiden Abstandshaltern zu übertragen. Platzieren Sie das Netz mit Hilfe von Uhrmacherzangen kopfüber in der Bildkammer des invertierten Mikroskops, sodass die Abstandshalter nach unten zeigen, um direkt auf dem Kammerdeckelschlupf zu sitzen und die Inselchen zwischen den Abstandshaltern und dem Netz in der Mitte des Deckschlupfers einzufangen.Achten Sie darauf, dass das Netz gut hydratisiert ist, ohne übermäßige Lösungsvolumina zu enthalten, die die seitliche Bewegung der Probe provozieren würden. Legen Sie dann das grobe Netz und das Gewicht auf das feine Netz in der Kammer, und fügen Sie der Kammer eine Bildlösung hinzu. Sobald die Inselchen immobilisiert sind, wählen Sie den Bildgebungsmodus und das Objektiv auf dem invertierten Mikroskop aus und platzieren Sie die Kammer mit den Inseln auf der temperaturgeregelten Stufe des Mikroskops.Positionieren Sie nach dem Einstellen der Perfusion den Zufluss niedriger als der Abfluss innerhalb der Kammer, und stellen Sie den Abflussfluss so fest, dass er größer als der Zuflussfluss ist. Stellen Sie sicher, dass der Abfluss nur minimalen Kontakt mit der Lösung hat, sodass die Lösung in mehreren sequenziellen kleinen Tröpfchen entfernt wird, wodurch lange Intervalle der kontinuierlichen Lösungsentfernung vermieden werden. Als Nächstes initiieren Sie die Perfusion mit einer bildgebenden Lösung, die drei Millimolarglukose enthält, und wählen Sie den Lichtpfad und die Filter für die Abbildung grüner Fluorophore aus.Führen Sie dann live Bildgebung aus, um die Bildparameter einzurichten und die Ansicht anzupassen, um die interessierten Inselchen zu erfassen. Um das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes zu optimieren, passen Sie die Anregungslichtintensität, die Belichtungszeit und das Binning an, um sicherzustellen, dass die Einstellungen eine unterschiedliche Visualisierung jeder Zelle innerhalb der Inselchen bei minimaler Lichtintensität und Belichtung ermöglichen. Dann bilden Sie die Inselchen bei 0,1 bis fünf Hertz ab und überprüfen Sie die Qualität der erfassten Daten, während sie erfasst werden.Wenn die Alpha-Zell-Aktivität nachweisbar ist, verwenden Sie ein Online-Diagramm der Signaldynamik innerhalb der Erfassungssoftware als möglich und fügen Sie der Badlösung zwei bis fünf Minuten Adrenalin oder Glutamat hinzu. Ein schneller Anstieg des Kalziums, gefolgt von einer Verlangsamung oder Abbruch der Alphazellschwingungen, wird beobachtet. Als nächstes fügen Sie Ghrelin hinzu, das kürzlich berichtet wurde, um Deltazellen selektiv zu aktivieren.Ein schneller reversibler Anstieg von Kalzium wird in einer kleinen Subpopulation von Isletzellen beobachtet. Dann 10 Millimolar Glukose hinzufügen. Eine koordinierte Oszillationsreaktion in der Beta-Zell-Subpopulation wird beobachtet.Beachten Sie auch die Reaktionen von Zellen, die zuvor durch Adrenalin oder Glutamat und Ghrelin aktiviert wurden. Importieren Sie die Daten nach dem Speichern der Bilder in ein entsprechendes Datenanalyse-Softwareprogramm und normalisieren Die Rohfluoreszenzintensitätsdaten auf den Anfangswert der Fluoreszenz. Wenn der Datensatz für die Fluoreszenzintensität szendierartig von Zellen zu Zelle immer noch erheblich ist, definieren Sie einen Regelbereich für den Zeitraum, in dem die Steuerungslösung angewendet wurde.Wenn der Kontrollbereich über ein klares nicht oszillatores Signal verfügt, gehen Sie davon aus, dass die Fluoreszenzintensität nach jeder Anwendung der Steuerungslösung wieder an die Basislinie angestiegen ist. Um die Zeitrafferdaten für jede Zelle zu korrigieren, teilen Sie die Daten in Segmente auf, die durch die Punkte getrennt sind, an denen die Steuerungslösung hinzugefügt wurde, und wenden Sie die lineare Korrektur auf jedes Segment an. Wenn der Regelbereich klare Schwingungen enthält oder zusätzliche Faktoren vorhanden sind, verwenden Sie einen Spike-Erkennungsalgorithmus.Um die Häufigkeit von Kalziumspitzen und die Reaktion auf die Zugabe von Agonisten und Antagonisten zu messen, teilen Sie die Aufzeichnung in gleiche Zeitintervalle auf, zählen Sie die Spitzen innerhalb des Intervalls und normalisieren Sie sich auf die Intervalldauer, um den Zeitverlauf der Teilfrequenz zu berechnen. Alternativ können Sie den Schwellenwert festlegen und den Plateauanteil für jedes Intervall berechnen. Der Anteil gibt den Prozentsatz der Zeit innerhalb des Intervalls an, das die Zelle im angeregten Zustand verbracht hat.Oder berechnen Sie die Teilfläche unter der Kurve für jedes Intervall. Wenn die Lipidzusammensetzung der Membran nicht beeinflusst wurde, laden Sichchen ziemlich gut mit tropischen Farbstoffen. Der menschliche Adenovirus Typ 5 Vektor zielt auch erfolgreich auf Islet-Zellen.Calcium-Spiking in Alpha-Zellen kann leicht bei niedrigen Glukosespiegel nachgewiesen werden, und es gibt eine hohe Zell-für-Zell-Korrelation zwischen der Aktivität bei niedriger Glukose und der Reaktion auf Adrenalin und Glutamat. Ghrelin aktiviert einige adrenalinempfindliche Zellen bei niedriger Glukose, hat aber keinen Einfluss auf die Kalziumdynamik in den meisten Zellen, die durch niedrige Glukose aktiviert werden. Bei der Analyse in Bezug auf partielle Frequenz, Adrenalin oder Ghrelin-stimulierte Zellen zeigen eine erhebliche Zunahme unter den Alles-oder-Nichts-Bedingungen, obwohl die Gesamtänderungen zwischen Basal-Spiking und dem Adrenalin-Effekt subtil sind.Im Gegensatz dazu ist der Teilbereich unter der Kurve empfindlich gegenüber den Veränderungen, die durch Adrenalin in allen Zellen eingeführt werden, selbst wenn die Basalaktivität hoch ist. Stellen Sie sicher, dass alle Netze mit einer bildgebenden Lösung in Kontakt sind, und achten Sie darauf, das Gewebe einigermaßen dicht zu positionieren, um Luftblasen zu vermeiden. Die Methode kann um die künstliche Intelligenz erweitert werden, um zwischen den Zelltypen zu unterscheiden.Die pharmakologischen Marker können durch die Mustererkennungstechnologie ersetzt werden, wodurch die Aufnahmezeit reduziert wird.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Forschung

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Herstellung von Azinuszellen des Pankreas für die Zwecke von Calcium Imaging, Cell Verletzung Messungen und Adenovirus-Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...