Name: imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells
Uploaded: 2019-11-26T12:00:00
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AHは糖尿病英国博士課程の学生シップの受領者であり、EVはOXION-ウェルカム・トラスト・トレーニング・プログラムの支援を受け、AITはオックスフォード生物医学研究評議会の博士研究員を開催しました。

ここで説明するすべての方法は、英国動物(科学的手続き)法(1986)とオックスフォード大学の倫理ガイドラインに従って開発されました。
1. マウス膵島を分離する
<ol><li>培養培地と分離液を準備します。<ol>
<li>培養培地を構成する:RMPI1640(材料表参照)、胎児子牛血清の10%、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを補充する。2つの60ミリメートルプラ...

<ol>
	<li>Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocytochemical+and+morphometric+study+of+the+rat+pancreatic+islets.">An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets.</a> Journal of Anatomy. 186, 629 (1995).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Brereton, M. 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プロトコルには、全体的な成功に不可欠な 3 つの段階があります。胆管へのリベラーゼ酵素の注入の成功は、単離手順の定量的成功だけでなく、単離された島の品質にも影響を与えます。膨張していない膵臓は、単離された小島でいくつかの重要な代謝応答の欠如をもたらす可能性があります。第二に、センサの色素/発現の負荷は、タイムラプス記録の信号対雑音比を定義する。過負荷の小...

この方法の目的は、膵島細胞の小さな部分集団における細胞質カルシウム濃度([Ca2+cyt)のリアルタイム変化を画像化することです。これにより、これらの細胞におけるホルモン分泌を支配するメカニズムを明らかにし、異なる細胞型間のクロストークに関する詳細を明らかにし、潜在的に、集団次元を大きな画像に導入することができます。
島は複数の細胞タイプで構成されています。よりよく知られているインスリン分泌β細胞に加えて、血糖3の調節にも重要な少なくとも2つの亜集団がある。α細胞(島の細胞の約17%を構成する)は、血糖値が低くなりすぎるとグルカゴンを分泌し、肝臓のデポから血流にブドウ糖を放出するシグナルを送ります。過剰なグルカゴンレベル(高グルカゴネミア)およびグルカゴン放出の制御障害(および、技術的には、インスリン感受性障害の糖尿病状態に寄与し得る)4.δ細胞(約2%)グルコース上昇に応答してソマトスタチンを分泌する。このユビキタスペプチドホルモンは、小島内のα-およびβ細胞の近傍に高濃度で存在する可能性が高く、グルカゴンおよびインスリン分泌の両方に強いGi受容体媒介性減衰効果を有する。
α-細胞とδ細胞は、グルコース感知機械の大部分を近い系統親であるβ細胞と共有しています。3種類の全ての細胞にATP感受性K+チャネルが装備されており、これらの興奮性細胞の形質膜電位を制御する精巧な代謝センサ5が備え付けられている。同時に、インスリン、ソマトスタチンおよびグルカゴンの分泌は、グルコースによって異なる方法で調節される。したがって、島細胞の2つの小さな部分集団におけるCa2+ダイナミクスのイメージングは、血糖値と島分泌出力との間のクロストークに関する洞察を提供することができる。
パッチクランプ電気生理学を用いてα細胞およびδ細胞の興奮性をモニタリングする初期の試みは、すぐに単一のα-およびδ細胞におけるCa2+のイメージングに続いた。これらの実験における細胞の同一性は、抗グルカゴンまたは抗ソマトスタチン抗体による後部染色を介して検証した。これらの努力は、イシレット細胞が大口内で、単一の細胞として非常に異なって動作するという発見によってしばしば妨げられた。β細胞は、島の配置の主な恩人であるように見えるかもしれませんが(その強力な電気結合の根底にある圧倒的多数のために)、主な不一致は、驚くべきことに、α細胞に見つかりました。無傷の小有限では、これらの細胞は常に低グルコースで持続的に活性化され、これは単一分散α細胞6の約7%に対してのみ当てはまる。従って無傷の小島内のα−およびδ細胞の活性を報告することは、生体内条件のより近い近似を表すと考えられる。
一般に、α細胞またはδ細胞の部分集団から特異的にCa2+ダイナミクスを報告する2つの方法があります:(i)組織特異的プロモーターを介して遺伝子コードされたCa2+センサーを発現する、または(ii)マーカー化合物を使用して。よりエレガントな前者のアプローチは真の3Dイメージングの実質的な利点を追加し、したがって、小有に細胞分布の研究。しかし、無傷のヒトの小米科材料には適用できません。もう一つの潜在的な懸念は、特に高グルコースに対するβ/α細胞トランス分化またはα細胞応答が実施されている場合に、プロモーターの「漏れ」である。後者のアプローチは、ヒトサンプルまたは培養小島を含む新鮮な単離された組織で使用することができる。しかし、このデータは、イシレットアーキテクチャを変えることなく、より深い層に色素/マーカー分子を送り出すので、イレット細胞の末梢層からのみ収集されます。後者のアプローチの予想外の利点は、広視野イメージングモードとの互換性であり、実験を数百または数百の小島(すなわち数千から数万の細胞)の同時イメージングにスケールアップすることができます。
カルシウムは、遺伝子コードされたGCaMP7(またはペリカム8)ファミリーセンサを用いて生体内で画像化され、これは、カルシウム結合タンパク質カルモジュリンとその標的配列に融合した円形に透過緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異体であり、ミオシン軽鎖キナーゼ7、9のM13断片である。GCaMPは、ナノモルCa2+濃度の範囲で優れた信号対雑音比を有し、高い2光子断面を有し、生体内作業10、11に最適です。組換えセンサーを使用する難しい側面は、細胞への配信です。異種発現は、ウイルスベクターと複数時間のex vivo培養を使用する必要があり、これは細胞機能の潜在的な分化または悪化に関する懸念を頻繁に提起する。GCaMP を表現するように設計されたマウス モデルは、この問題に対処するために事前に設計されていますが、リード タイムを大幅に増やし、作業を非人間モデルに制限することで、新たな課題を追加します。細胞内pHの変化に対する非常に高い感受性は、タンパク質ベースのセンサ12のもう一つの不利な側面であり、しかし、Ca2+のような振動信号を感知する問題は少ない。
トラップ可能な色素(緑色蛍光Fluo4など)の利点は、約1時間以内に新鮮に単離された組織にロードできることです。予想通り、トラップ可能な染料は、組換えの色素よりも信号対雑音比が低く、(はるかに)光安定性が低くなります。トラップ可能色素14の毒性の報告を13件確認することはできないが、染料の過負荷が頻繁に問題となる。
円形順列に基づく赤色組換えCa2+センサーは、2011年15年から急速に進化しており、最近の開発は、赤色光の浸透深さが高いことを考えると、組織イメージングのためのGCaMP16に強い競争を示しています。市販の赤色捕捉性染料は、単一細胞イメージングに確実に使用できますが、組織レベルでは、緑色のアナログとうまく競合することはできません。
焦点が合っていない光が重大な問題となる組織の実験のためのイメージング技術の選択は一見ほとんどない。共焦点システムは、0.3(GCaMP6の場合)または0.8(トラップ可能な色素)上の任意の目的で焦点外光のキャンセルによって許容可能な単一細胞分解能を提供します。技術的な意味では、従来の共焦点顕微鏡は、数百個(GCaMP)または数十個の小島(トラップ可能な色素)から[Ca2+]の円を同時にイメージングするために使用することができます。組織におけるセンサの3D発現の場合の共焦点モードに対する唯一の現実的な代替手段は、おそらく光シート顕微鏡である。
センサーが小別の組織内の細胞の末梢層で発現する場合、物事はわずかに異なります。鮮やかな細胞内発現パターンを持つ明るい組換えセンサの場合、低NA目標の広視野イメージングモードを使用すると、十分な品質を提供し、視野領域の大幅な増加を研究者に報い、したがって、スループット。広いフィールド システムでは、フォーカスの低いライトがキャンセルされないので、空間的な解像度が低くなります。したがって、単一細胞信号が隣接する細胞によって大きく汚染されるため、高NA(被写界深度の低い)目的を持つイメージング組織はあまり有益ではありません。汚染は低NA(被写界深度の高い)目標のためにはるかに小さい。
ただし、高いスループットやサンプリング レートが重要な利点となるタスクもあります。α-細胞とδ細胞は相当な不均一性を示し、サブ集団の寄与を明らかにするために高いサンプルサイズの需要を生み出す。広視野イメージングは高速で感度が高く、工業規模の大きな視野システムは、それぞれ10または1つの小島での共焦点実験と同じ信号対雑音比で数百個(GCaMP)または数十個(Fluo4)の小島をイメージングします。このスループットの違いは、単一細胞分解能を有する集団イメージングに広視野システムを有利にし、δ細胞1のような小さなサブ集団にとって特に重要であり得る。同様に、Ca2+スパイク17からの電気活動を再構築しようとする試みは、広視野イメージングモードによって提供されるより高いサンプリングレートの恩恵を受けるだろう。同時に、支配的なβ細胞部分集団の刺激時の膵臓α細胞の活性のようないくつかの「ニッチ」問題は、共焦点系の使用を必要とする。共焦点モードに向けた決定に影響を与える要因は、β細胞亜集団からの実質的な汚染シグナルの存在である。
イメージング実験後にホルモン特異的抗体染色を用いて細胞の同一性を検証することは依然として選択肢であるが、α-18およびδ細胞19、20におけるCa2+ダイナミクスを選択的に刺激することが示されたアドレナリンおよびグレリンなどの機能マーカー化合物を用いて、マイナー細胞亜集団を同定することができる。
タイムラプスイメージングデータの分析は、集団の不均一性、相関、異なるシグナルの相互作用など、些細な薬理学を超えた情報を提供することを目的としています。従来、撮像データは強度対時間として解析され、初期蛍光に正規化される(F/F0)。ベースライン補正は、蛍光またはpHの変化による蛍光対気のシグナルの漂白または汚染に起因して頻繁に必要である(典型的にはグルコース12のミリモルレベルによって誘発される)。Ca2+データはさまざまな方法で分析できますが、3 つの主な傾向は、スパイク周波数、高原分数、または曲線の下の面積の変化を計算した場合と時間の値を測定することです。後者のアプローチは、特に重くアンダーサンプリングされた共焦点データへの適用において有利であることがわかりました。pAUCメトリックの利点は、信号周波数と振幅の両方の変化に対する感度であるのに対し、周波数を計算するには、従来のイメージングを使用して達成するのが困難であるかなりの数の振動21が必要である。pAUC分析の制限要因は、ベースラインの変化に対する高い感度です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:779px;" width="779">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">40x/1.3 objective</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Axiovert 200 microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">emission</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">Excitation</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo4</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">&#160; F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector</td>
			<td style="width:277px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; solution&#160;</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liberase</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss LSM510-META confocal system</td>
			<td style="width:277px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells

膵島ホルモンは血糖恒常性を調節する。血糖値の変化は、膵島の細胞内の細胞質カルシウムの発振を誘発し、インスリン(β細胞から)、グルカゴン(α細胞)、ソマトスタチン(δ細胞)の3つの主要なホルモンの分泌を引き起こす。大多数の小有限細胞を構成し、互いに電気的に結合しているβ細胞は、グルコース刺激に対して1つの単一の実体として応答する。マイナーな部分集団、α細胞およびδ細胞の興奮性(約20%(30%)を占める4% (10%)総げっ歯類1(ヒト2)島の細胞数のそれぞれ)は、予測しにくいので、特別な関心がある。
カルシウムセンサは、単離された小石内の細胞の末梢層に送達されます。島または小島のグループは、蛍光顕微鏡を使用して固定化され、画像化されます。イメージングモードの選択は、より高いスループット(広視野)とより良い空間分解能(共焦点)の間です。従来、レーザー走査共焦点顕微鏡は、隣接する細胞間のシグナルの最適な分離を提供するので、組織のイメージングに使用される。β細胞の支配集団からの汚染信号が最小限に抑えられるならば、広視野システムも利用することができる。
特定の刺激に応答してカルシウムダイナミクスが記録されると、データは蛍光強度対時間として数値形式で表され、初期蛍光およびベースライン補正に正規化され、漂白に関連する効果を除去する。蛍光体。曲線下のスパイク周波数または部分領域(pAUC)の変化は、観測された効果を定量するために、時間対時間を計算する。pAUCはより敏感で非常に堅牢であるのに対し、スパイク周波数はカルシウム増加のメカニズムに関するより多くの情報を提供します。
マイナーな細胞のサブ集団は、アドレナリンやグレリンなどのマーカー化合物に対する機能的応答を用いて同定することができ、これは島細胞の特定の集団における細胞質カルシウムの変化を誘発する。

イレットは、膜の脂質組成が影響を受けていない限り(例えば、脂肪酸への慢性暴露によって)、トラップ可能な色素(図1A)とかなりよく負荷する。ヒトアデノウイルス5型(Ad5)ベクターも全ての島細胞を標的とする(図1B)。複数の組換えセンサーが同じセル内で発現している場合に問題が発生する可能性があります。さらに、?...

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Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

ここでは、膵島細胞などの異種細胞集団におけるカルシウム動態をイメージングおよび定量するためのプロトコルを提示する。蛍光レポーターは、イヌビレット内の細胞の末梢層に送達され、次いで固定化および画像化され、蛍光強度のダイナミクスの細胞単位分析が行われます。

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

このプロトコルは、ランゲルハンス島内の細胞の小さな亜集団の迅速な単離された機能を可能にする。この手法の利点は、取得したデータのリアルタイムの性質と高い統計的能力、したがって高い再現性が含まれます。イメージング用の小島を固定するには、逆顕微鏡用のイメージングチャンバーを組み立て、ガラスカバースリップをチャンバー内に配置します。ガラス室のインターフェースが水密であることを確認し、カバースリップが顕微鏡の目的の手の届く範囲内であることを確認してください。次に、細かい粗いメッシュの20で20ミリメートルの正方形をカットし、細かいメッシュの部分に2つのスペーサーの壁を作成するために厚い粘着テープの45〜50マイクロメートルの部分を使用しています。粗いメッシュと重量をイメージング液の35ミリメートルのペトリ皿に浸し、細かいメッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。スペーサーの壁を逆さまにして、スペーサーを上向きにして細かいメッシュを回します。そして、2つのスペーサー間でいくつかの小島を転送するためにp20ピペットを使用してください。時計職人の鉗子を使用して、反転した顕微鏡のイメージングチャンバーの中にメッシュを逆さまに置き、スペーサーが下向きに向かってチャンバーカバースリップに直接座るようにし、スペーサーとメッシュの間の小島をカバースリップの真ん中に閉じ込めます。サンプルの横運動を引き起こす過剰な量の溶液を含まずに、メッシュが十分に水分補給されるのに注意してください。次に、粗いメッシュと重量をチャンバー内の細かいメッシュの上に置き、イメージング液をチャンバに加えます。島が固定化されたら、反転顕微鏡で撮像モードと目的を選択し、マイクロスコープの温度制御段階に小島を入れます。灌流を設定した後、インフローをチャンバー内の流出量よりも低く位置し、流出流束を流入フラックスよりも大きく設定する。流出液と溶液との接触が最小限に抑えられるので、連続した複数の小さな液滴で溶液を除去し、連続的な溶液除去の間隔が長くならないようにしてください。次に、3ミリモルグルコースを含むイメージング溶液で灌流を開始し、緑色のフルオロフォアをイメージングするための光路およびフィルタを選択する。次に、ライブイメージングを実行してイメージングパラメータを設定し、ビューを調整して対象の島をキャプチャします。画像の信号対雑音比を最適化するには、励起光強度、露光時間、およびビニングを調整し、設定が最小の光強度と露出で島内の各セルを明確に視覚化できるようにします。次に、0.1~5ヘルツで島を画像化し、取得したデータの品質をキャプチャして確認します。アルファ細胞活性が検出可能な場合は、取得ソフトウェア内のシグナルダイナミクスのオンラインチャートを可能な限り使用し、アドレナリンまたはグルタミン酸を浴液に2〜5分間追加します。カルシウムの急激なジャンプとそれに続くアルファ細胞振動の減速またはキャンセルが観察されます。次に、最近報告されているグレリンを加え、デルタ細胞を選択的に活性化すると報告された。カルシウムの急速な可逆的な増加は、小さな亜集団の小さな小さな小集団で観察される。その後、10ミリモルのグルコースを追加します。ベータ細胞のサブ集団における協調振動応答が観察される。また、アドレナリンまたはグルタミン酸およびグレリンによって以前に活性化された細胞の応答に注意してください。.画像を保存した後、適切なデータ分析ソフトウェアプログラムにデータをインポートし、生蛍光強度データを蛍光の初期値に正規化します。細胞間可変性蛍光強度データセットがまだ相当である場合は、制御溶液が適用された時間の範囲の制御領域を定義する。制御領域に明確な非発振信号がある場合、制御溶液の各適用後に蛍光強度がベースラインに戻ったと仮定する。各セルの時間経過データを修正するには、データを制御解が追加されたポイントで区切られたセグメントに分割し、各セグメントに線形補正を適用します。制御範囲に明確な振動がある場合、または追加の因子が存在する場合は、スパイク検出アルゴリズムを使用します。カルシウムスパイクの頻度とアゴニストとアンタゴニストの添加に対する応答を測定するには、記録を等しい時間間隔に分割し、間隔内のスパイクをカウントし、間隔期間に正規化して部分的な周波数の時間経過を計算します。または、しきい値を設定し、各間隔のプラトー分率を計算します。分数は、セルが励起状態で費やした間隔内の時間の割合を示します。または、各間隔の曲線下の部分領域を計算します。膜の脂質組成が影響を受けていない限り、島は熱帯染料とかなりよく負荷されます。ヒトアデノウイルス型5型ベクターもまた、イレット細胞を標的にすることも成功した。アルファ細胞のスパイクは低グルコースレベルで容易に検出でき、低グルコースでの活性とアドレナリンとグルタミン酸への応答との間には高い細胞ごとの相関関係があります。グレリンは低ブドウ糖でいくつかのアドレナリン応答性細胞を活性化しますが、低グルコースによって活性化される細胞のほとんどでカルシウムダイナミクスに影響を与えなくなります。部分的な頻度の観点から分析すると、アドレナリンまたはグレリン刺激細胞は、基底スパイクとアドレナリン効果の間の全体的な変化は微妙であるが、オールまたはナッシング状態で実質的な増加を表示します。対照的に、曲線下の部分領域は、基底活性が高い場合でも、すべての細胞においてアドレナリンによって導入される変化に敏感である。すべてのメッシュがイメージングソリューションと接触していることを確認し、気泡を避けるために組織を合理的に密集して配置するように注意してください。この方法を展開して、細胞タイプを区別するための人工知能を含めることができます。薬理マーカーは、パターン認識技術によって置き換えることができ、それによって記録時間を短縮する。

Research

JoVE Journal

Biology

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Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

アストロサイトの細胞膜とグローバル細胞内カルシウム動態の近くの測定

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

カルシウムイメージング、細胞傷害測定、およびアデノウイルス感染の目的のための膵臓腺房細胞の調製

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マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

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High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...