Name: imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells
Uploaded: 2019-11-26T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells at JoVE.com

AH var en mottaker av en diabetes UK PhD studentship, EV ble støttet av OXION-Wellcome Trust treningsprogram, holdt AIT en Oxford Biomedical Research Council postdoktor fellesskap.

Alle metoder beskrevet her ble utviklet i samsvar med Storbritannia Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act (1986) og University of Oxford etiske retningslinjer.
1. Isoler mus bukspyttkjertelen holmer
<ol><li>Klargjør kultur mediet og isolasjons løsningen.<ol>
<li>Make up kulturen medium: RMPI1640 (se tabell over materialer), supplert med 10% av fosterets kalv serum, 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml Streptomycin. Dispensere mediet i 2 60 mm plastikk Petri retter (ikke...

<ol>
	<li>Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocytochemical+and+morphometric+study+of+the+rat+pancreatic+islets.">An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets.</a> Journal of Anatomy. 186, 629 (1995).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-,+delta-and+PP-cells:+are+they+the+architectural+cornerstones+of+islet+structure+and+co-ordination.">Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 63 (8), 575-591 (2015).</li><li>F&#230;rch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+is+accompanied+by+increased+fasting+glucagon+and+delayed+glucagon+suppression+in+individuals+with+normal+and+impaired+glucose+regulation.">Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation.</a> Diabetes. 65 (11), 3473-3481 (2016).</li><li>Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+architecture+of+the+ATP-binding+site+of+the+KATP+channel+subunit+Kir6+2.">Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2.</a> The Journal of Physiology. 557 (2), 347-354 (2004).</li><li>Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+store-operated+mechanism+determines+the+activity+of+the+electrically+excitable+glucagon-secreting+pancreatic+alpha-cell.">A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell.</a> Cell Calcium. 35 (4), 357-365 (2004).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca+2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137 (2001).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (6), 3197-3202 (2001).</li><li>Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+activity+in+neural+circuits+with+genetically+encoded+indicators.">Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).</li><li>Tarasov, A. I., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in enzymology. 542, 289-311 (2014).</li><li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+mitochondrial+Ca(2+)+accumulation+regulates+ATP+synthesis+in+pancreatic+&#946;+cells.">Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic &#946; cells.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465 (4), 543-554 (2013).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca2++indicators+directly+inhibit+the+Na,+K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signal. 11 (515), 2039 (2018).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+red+protein+calcium+indicators+for+imaging+neural+activity.">Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity.</a> Elife. 5, 12727 (2016).</li><li>Theis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+Spike+Rate+Inference+in+Population+Calcium+Imaging.">Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging.</a> Neuron. 90 (3), 471-482 (2016).</li><li>Hamilton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adrenaline+Stimulates+Glucagon+Secretion+by+Tpc2-Dependent+Ca(2+)+Mobilization+From+Acidic+Stores+in+Pancreatic+alpha-Cells.">Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells.</a> Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).</li><li>Adriaenssens, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+pancreatic+alpha,+beta+and+delta+cell+populations+identifies+delta+cells+as+a+principal+target+for+ghrelin+in+mouse+islets.">Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets.</a> Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).</li><li>DiGruccio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+alpha,+beta+and+delta+cell+transcriptomes+reveal+that+ghrelin+selectively+activates+delta+cells+and+promotes+somatostatin+release+from+pancreatic+islets.">Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets.</a> Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).</li><li>Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+experimental+design+to+estimate+statistically+significant+periods+of+oscillations+in+time+course+data.">Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data.</a> PloS One. 9 (4), 93826 (2014).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li><li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+is+a+positive+autocrine+signal+for+glucagon+release.">Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release.</a> Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Tarasov, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+real-time+hormone+release+kinetics+via+high-content+3-D+imaging+of+compensatory+endocytosis.">Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2838-2848 (2018).</li><li>Knudsen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+Glucagon+Secretion+by+Hyperglycemia-Induced+Sodium-Dependent+Reduction+of+ATP+Production.">Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production.</a> Cell Metabolism. , (2018).</li><li>Adam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fumarate+hydratase+deletion+in+pancreatic+&#946;+cells+leads+to+progressive+diabetes.">Fumarate hydratase deletion in pancreatic &#946; cells leads to progressive diabetes.</a> Cell Reports. 20 (13), 3135-3148 (2017).</li><li>Wills, Q. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+approaches+and+software+for+clustering+islet+cell+functional+heterogeneity.">Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity.</a> Islets. 8 (2), 48-56 (2016).</li><li>Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+divergent+glucose+effects+on+calcium+metabolism+in+pancreatic+beta-+and+alpha+2-cells.">Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells.</a> Endocrinology. 105 (6), 1463-1468 (1979).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Longo, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillations+in+cytosolic+free+Ca2+,+oxygen+consumption,+and+insulin+secretion+in+glucose-stimulated+rat+pancreatic+islets.">Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 266 (14), 9314-9319 (1991).</li><li>Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+raises+cytoplasmic+calcium+in+pancreatic+alpha+2-cells+by+mobilizing+calcium+incorporated+in+response+to+glucose.">Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose.</a> Cell Calcium. 10 (4), 205-211 (1989).</li><li>Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+cytoplasmic+Ca2++oscillations+in+stimulated+pancreatic+&#946;-cells.">Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic &#946;-cells.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 268 (1), 404-407 (1989).</li><li>Okamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytosolic+Ca2++in+impaired+sensitivity+to+glucose+of+rat+pancreatic+islets+exposed+to+high+glucose+in+vitro.">Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro.</a> Diabetes. 41 (12), 1555-1561 (1992).</li><li>Gilon, P., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+membrane+potential+changes+on+cytoplasmic+Ca2++concentration+in+an+electrically+excitable+cell,+the+insulin-secreting+pancreatic+B-cell.">Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (29), 20713-20720 (1992).</li><li>Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+digital+image+analysis+of+glucose-induced+[Ca2+]i+oscillations+in+mouse+pancreatic+islets+of+Langerhans.">Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42 (8), 1210-1214 (1993).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks:+elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle.">Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li><li>Stout, A. L., Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evanescent+field+excitation+of+fluorescence+by+epi-illumination+microscopy.">Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy.</a> Applied Optics. 28 (24), 5237-5242 (1989).</li><li>Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices.">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638 (2013).</li><li>Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-+and+hormone-induced+cAMP+oscillations+in+alpha-+and+beta-cells+within+intact+pancreatic+islets.">Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets.</a> Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).</li><li>Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+coupling+and+calcium+waves+in+the+pancreatic+islet.">Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet.</a> Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).</li><li>van Gurp, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+intravital+imaging+reveals+in+vivo+dynamics+of+pancreatic+tissue+transplanted+under+the+kidney+capsule+in+mice.">Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice.</a> Diabetologia. 59 (11), 2387-2392 (2016).</li></ol>

Det er tre stadier i protokollen som er avgjørende for total suksess. Vellykket injeksjon av Liberase enzymet i gallekanalen bestemmer ikke bare den kvantitative suksessen til isolasjons prosedyren, men også påvirker kvaliteten på de isolerte holmer. Uninflated pancreata kan føre til mangel på noen viktige metabolske responser i de isolerte holmer. Dernest, lasting av fargestoff/uttrykket av sensoren definerer signal-til-støy forholdet mellom tidsforløp innspillingen. Signalene er fraværende eller dempes i overb...

Formålet med metoden er å image Real-Time endringer i cytosolic kalsium konsentrasjon ([ca2 +]cyt) i mindre subpopulasjoner av bukspyttkjertel Holme celler. Dette gjør avdekke mekanismer styrende hormon sekresjon i disse cellene, avslørende detaljer om kryss-snakk mellom ulike celletyper og, potensielt, innføre en populational dimensjon i større bilde av Holmen signalering.
Holmer består av flere celletyper. I tillegg til de mer kjente insulin-sekresjon β-cellene, er det minst to subpopulasjoner som også er avgjørende for å regulere blodsukkeret3. α-celler (som utgjør rundt 17% av Holme celler) skiller glukagon når blodsukkeret blir for lavt, som signaler for frigjøring av glukose i blodet fra lagre i leveren. Overdreven glukagon nivåer (hyperglucagonemia) og nedsatt kontroll av glukagon-Release følge (og, teknisk, kan bidra til) den prediabetic tilstand av nedsatt insulinfølsomhet4. δ-celler (rundt 2%) skiller somatostatin som svar på glukose høyde. Denne allestedsnærværende peptid hormon vil trolig være til stede ved høye konsentrasjoner i nærheten av α-og β-celler innen holmer, som har en sterk Gjeg reseptor-mediert demping effekt på både glukagon og insulin sekresjon.
α-celler og δ deler en stor del av glukosesensor maskineriet med sine nære slekts slektninger, β-celler. Alle tre celler typer er utstyrt med ATP-sensitive K+ kanaler, utdype metabolske sensorer5 som kontrollerer plasma membran potensialet i disse nervøs celler. På samme tid, sekresjon av insulin, somatostatin og glukagon er regulert forskjellig av glukose. Imaging av ca2 + dynamikk i de to mindre subpopulasjoner av Holme celler kan derfor gi et innblikk i kryss-snakk mellom blodsukker og Holme sekretoriske output.
Tidlige forsøk på å overvåke excitability av α-og δ ved hjelp av patch-Clamp elektrofysiologi ble snart etterfulgt av avbildning av ca2 + i enkelt α-og δ-celler. Identiteten til cellene i disse eksperimentene ble verifisert via en etterkontroll farging med anti-glukagon eller anti-somatostatin antistoffer. Dette arbeidet ble ofte hindret av å finne at Holme celler oppfører seg svært annerledes i Holmen og som enkeltceller. Selv om β-celler kan synes å være den viktigste velgjørere av Holme arrangement (på grunn av deres overveldende flertall som ligger til deres sterke elektriske kopling), var det viktigste avviket, overraskende, funnet i α-celler. Innenfor den intakte Holme er disse cellene konstant og vedvarende aktivert ved lavt glukose, som bare gjelder for rundt 7% av enkelt spredte α-celler6. Å rapportere aktiviteten til α-og δ i intakte holmer antas derfor å representere en tettere tilnærming av in vivo-forhold.
Generelt er det to måter å rapportere ca2 + dynamikk spesifikt fra α-cellen eller δ-subpopulasjoner: (i) å uttrykke en genetisk kodet ca2 + sensor via en vevs spesifikk formidler eller (II) bruke markør forbindelser. Den mer elegante tidligere tilnærmingen gir den betydelige fordelen av ekte 3D-bilde og dermed studere celle distribusjon i Holmen. Det kan imidlertid ikke brukes på intakt menneskelig Holme materiale. En annen potensiell bekymring er "leakiness" av arrangøren, spesielt når β-/α-celle transdifferentiation eller α-celle responsen på høy glukose er på plass. Sistnevnte tilnærming kan brukes med ferskt isolert vev inkludert menneskelige prøver eller kultivert holmer. Dataene er imidlertid samlet utelukkende fra perifere lag av Holme celler, som leverer fargestoff/markør molekylet i dypere lag uten å endre Holme arkitekturen er utfordrende. En uventet fordel med sistnevnte tilnærming er kompatibiliteten med bred-feltet Imaging-modus, som tillater skalering opp eksperimenter til samtidige Imaging av titalls eller hundrevis av holmer (dvs. tusenvis til titusenvis av celler).
Kalsium er avbildet i vivo ved hjelp av genetisk kodede GCaMP7 (eller pericam8) familie sensorer, som er varianter av sirkulært permutated grønne fluorescerende protein (GFP) smeltet til kalsium-bindende protein calmodulin og dens mål sekvens, M13 fragment av myosin lys kjeden kinase7,9. GCaMPs har suveren signal-til-støy-forhold i rekken av nanomolar ca2 + -konsentrasjoner og et høyt 2-Foton tverrsnitt, noe som gjør dem til et ideelt valg for in vivo-arbeid10,11. Det utfordrende aspektet ved bruk av rekombinant sensorer er deres levering i cellene. Heterologous uttrykk krever bruk av en viral vektor og multi-Hour ex vivo dyrking, som ofte reiser bekymringer om potensielle de-differensiering eller forverring av celle funksjoner. Selv om musen modeller pre-konstruert for å uttrykke GCaMP løse dette problemet, legger de nye utfordringer ved å øke ledet tid betydelig og begrense arbeidet til en ikke-menneskelig modell. Svært høy følsomhet for endringer av intracellulære pH er en annen ugunstig side av protein-baserte sensorer12, som er imidlertid mindre av et problem for sensing oscillasjon signaler, for eksempel ca2 +.
Fordelen med oppfangbar fargestoffer (for eksempel grønne fluorescerende Fluo4) er at de kan lastes inn i ferskt isolert vev innen rundt en time. Forutsigbart, oppfangbar fargestoffer har lavere signal-til-støy-forhold og (mye) lavere photostability enn sine rekombinant kolleger. Vi kan ikke bekrefte13 rapporter om toksisitet av oppfangbar fargestoffer14, men, Dye overbelastning er et hyppig problem.
Rød rekombinant ca2 + sensorer basert på sirkulære permutasjon har vært i utvikling raskt siden 201115, og siste utviklingen presentere en sterk konkurranse til GCaMPs16 for vev Imaging, gitt høyere dybde av inntrengning av rødt lys. Kommersielt tilgjengelige røde oppfangbar fargestoffer kan brukes pålitelig for single-celle Imaging, men på vev nivå, kan ikke konkurrere godt med den grønne analogs.
Det er tilsynelatende svært lite utvalg av tenkelig teknologi for eksperimenter i vev hvor ut-av-fokus lys blir et kritisk problem. Den konfokalmikroskopi systemet gir akseptabel enkelt celle oppløsning ved kansellering av ut-av-fokus lys med noen mål på NA over 0,3 (for tilfellet av GCaMP6) eller 0,8 (oppfangbar fargestoff). I teknisk forstand kan et konvensjonelt konfokalmikroskopi mikroskop brukes til samtidig avbildning av [ca2 +]cyt fra hundrevis (GCaMP) eller titalls holmer (oppfangbar fargestoff). Den eneste realistiske alternativ til konfokalmikroskopi modus i tilfelle av 3D-uttrykk for sensoren i vev er kanskje lys-ark mikroskopi.
Ting er litt annerledes for saken Når sensoren uttrykkes i perifere lag av celler i Holmen vev. For lyse rekombinant sensorer som har en levende intracellulære uttrykk mønster, ved hjelp av en bred-feltet Imaging modus med en Low-NA objektiv kan gi tilstrekkelig kvalitet og belønne forskeren med en betydelig økning i synsfeltet området og dermed Gjennomstrømming. Et bredt felt system gir dårligere romlig oppløsning, ettersom lyset utenfor fokuset ikke avbrytes. Derfor Imaging vev med High-NA (lav dybdeskarphet) mål er mindre informativ, som enkelt celle signal er vesentlig forurenset av nabocellene. Forurensningen er mye mindre for Low-NA (høy dybdeskarphet) mål.
Det finnes imidlertid oppgaver der høy gjennomstrømming og/eller samplingsfrekvens blir en kritisk fordel. α-og δ viser betydelige heterogenitet, noe som skaper et behov for høye utvalgsstørrelser for å avdekke subpopulasjoner bidrag. Bred-åker tenkelig er rask og flere følsom, med en industriell-skalaen stor åker-av-utsikt system tenkelig flere hundre (GCaMP) eller spent (Fluo4) av holmer på likt signal-å-bråk forhold idet det konfokalmikroskopi eksperimenter opp på ti eller en enkelt Holme, respectively. Denne forskjellen i gjennomstrømning gjør bredt felt systemet fordelaktig for populational avbildning med en enkelt celle oppløsning, noe som kan være spesielt viktig for små subpopulasjoner, for eksempel δ-cellen. På samme måte, forsøk på å rekonstruere elektrisk aktivitet fra ca2 + skyter17 ville dra nytte av høyere samplingsfrekvens gitt av en bred-feltet Imaging modus. På samme tid, flere "nisje" problemer som aktiviteten av bukspyttkjertelen α-celler ved stimulering av den dominerende β-celle pasientpopulasjonen, krever bruk av et konfokalmikroskopi system. En faktor som påvirker beslutningen mot konfokalmikroskopi modus er tilstedeværelsen av betydelige forurensende signal fra β-celle pasientpopulasjonen.
Selv om du bruker hormon-spesifikke antistoff flekker for å verifisere identiteten til cellene etter Imaging eksperimenter er fortsatt et alternativ, mindre celle subpopulasjoner kan identifiseres ved hjelp av funksjonell markør forbindelser, slik som adrenalin og ghrelin som ble vist å selektivt stimulere ca2 + dynamikk i α-18 og δ-celler19,20, henholdsvis.
Analysen av time-lapse Imaging data som mål å gi informasjon utover trivielle farmakologi, som populational heterogenitet, korrelasjon og samhandling av ulike signaler. Konvensjonelt er bildedata analysert som intensitet kontra tid og normalisert til den opprinnelige fluorescens (F/F0). Baseline korreksjon er ofte nødvendig, på grunn av bleking av fluoroforen signal eller forurensning av endringer i autofluorescence eller pH (vanligvis indusert av millimolar nivåer av glukose12). Ca2 + data kan analyseres på mange forskjellige måter, men tre viktigste trendene er å måle endringer i Spike frekvens, platået brøkdel, eller området under kurven, beregnet kontra tid. Vi fant den sistnevnte tilnærmingen fordelaktig, spesielt i søknaden til tungt undersampled konfokalmikroskopi data. Fordelen med pAUC målingen er dens følsomhet for både endringer i signal frekvens og amplitude, mens databehandling frekvensen krever et betydelig antall svingninger21, som er vanskelig å oppnå ved hjelp av konvensjonell bildebehandling. Den begrensende faktoren for pAUC-analyse er den høye følsomheten for endringer i grunnlinjen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:779px;" width="779">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">40x/1.3 objective</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">Axiovert 200 microscope</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">emission</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">Excitation</td>
			<td style="width:277px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo4</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">&#160; F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector</td>
			<td style="width:277px;">Vector Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; solution&#160;</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Liberase</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-&#1040;ldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI medium</td>
			<td style="width:277px;">ThermoFisher (GibCo, Life Technologies)</td>
			<td style="width:119px;">61870044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss LSM510-META confocal system</td>
			<td style="width:277px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells

Bukspyttkjertel Holme hormoner regulere blod glukose homeostase. Endringer i blodsukkeret induserer svingninger av cytosolic kalsium i bukspyttkjertelen Holme celler som utløser utskillelsen av tre hoved hormoner: insulin (fra β-celler), glukagon (α-celler) og somatostatin (δ-celler). β-celler, som utgjør flertallet av Holmen celler og er elektrisk koplet til hverandre, svare på glukose stimulans som en enkelt enhet. Excitability av de mindre subpopulasjoner, α-cellene og δ cellene (utgjør rundt 20% (30%) og 4% (10%) av den totale gnager1 (Human2) Holme celle tall, henholdsvis) er mindre forutsigbar og er derfor av spesiell interesse.
Kalsium sensorer leveres inn i perifere lag av celler innenfor den isolerte Holmen. Holmen eller en gruppe holmer blir deretter immobilisert og avbildet ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Valget av tenkelig modus er mellom høyere gjennomstrømning (Wide-feltet) og bedre romlig oppløsning (konfokalmikroskopi). Konvensjonelt, laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi brukes for bildebehandling vev, som det gir den beste separasjon av signalet mellom nabocellene. Et bredt felt system kan utnyttes også, hvis forurensende signal fra dominerende befolkning på β-celler er minimert.
Når kalsium dynamikk som svar på spesifikke stimuli er registrert, data uttrykkes i numerisk form som fluorescens intensitet kontra tid, normalisert til den første fluorescens og Baseline-korrigert, for å fjerne effektene knyttet til bleking av fluoroforen. Endringer i Spike frekvens eller delvis område under kurven (pAUC) er beregnet kontra tid, for å kvantifisere de observerte effektene. pAUC er mer følsom og ganske robust, mens skyter frekvens gir mer informasjon om mekanismen for kalsium økning.
Mindre celle subpopulasjoner kan identifiseres ved hjelp av funksjonelle reaksjoner på markør forbindelser, slik som adrenalin og ghrelin, som induserer endringer i cytosolic kalsium i en bestemt populasjon av Holme celler.

Holmer belastning ganske godt med oppfangbar fargestoffer (figur 1A), med mindre lipid sammensetningen av membranen har blitt påvirket (f. eks, ved kronisk eksponering for fettsyrer). Den menneskelige adenovirus type 5 (Ad5) vektor mål også alle Holme celler (figur 1B). Det kan oppstå problemer når mer enn én rekombinant sensor uttrykkes i samme celle. Videre er holmer vanligvis svært godt immobilisert ved hjelp av teknol...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells at JoVE.com

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Her presenterer vi en protokoll for bildebehandling og kvantifisere kalsium dynamikk i heterogene celle populasjoner, som bukspyttkjertelen Holme celler. Fluorescerende journalister leveres inn i perifere lag av celler i Holmen, som deretter immobilisert og avbildet, og per-celle analyse av dynamikken i fluorescens intensitet er utført.

Imaging kalsium Dynamics i subpopulasjoner av mus bukspyttkjertelen Holme celler

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Protokollen tillater rask isolert funksjon av små underpopulasjoner av celler innenfor bukspyttkjertelen holmer av Langerhans. Fordelene med denne teknikken inkluderer sanntidsnatur og høy statistisk kraft, og dermed høy reproduserbarhet, av de oppkjøpte dataene. For å immobilisere holmene for bildebehandling, monter et bildekammer for et omvendt mikroskop og plasser et glassdeksel som glir inn i kammeret.Kontroller at glasskammergrensesnittet er vanntett og kontroller at dekselet glir innenfor rekkevidden til mikroskopet målet. Deretter kutter du 20 av 20 millimeter firkanter med fint og grovt netting og bruker 45 til 50 mikrometer stykker tykk klebrig tape for å lage to avstandsvegger på et stykke fint nett. Dypp det grove nettet og en vekt i en 35 millimeter petriskål av bildeoppløsning, og plasser det fine nettet under et disseksjonsmikroskop.Snu det fine nettet med avstandsveggene opp ned og avstandsslene vendt oppover. Og bruk en p20 pipette til å overføre flere holmer mellom de to avstandsslene. Bruk urmakernes tang, plasser nettet opp ned inne i bildekammeret til det inverterte mikroskopet slik at avstandsslippene vender nedover for å sitte direkte på kammerdekselet, og fanger holmene mellom avstandsslene og nettet midt på dekkslipp.Vær forsiktig med at nettet er godt hydrert uten å inneholde store mengder løsning som ville provosere den laterale bevegelsen til prøven. Legg deretter grovnettet og vekten på toppen av det fine nettet i kammeret, og legg til bildeløsning til kammeret. Når holmene er immobilisert, velger du bildemodus og mål på det inverterte mikroskopet og plasserer kammeret med holmene på det temperaturkontrollerte stadiet av mikroskopet.Etter at perfusjonen er angitt, plasserer du tilsiget lavere enn utløpet i kammeret og setter utløpsstrømmen til å være større enn tilstrømningsstrømmen. Sørg for at utstrømningen har minimal kontakt med løsningen slik at den fjerner løsningen i flere sekvensielle små dråper, og unngår lange intervaller for kontinuerlig fjerning av oppløsning. Deretter starter du perfusjonen med bildeløsning som inneholder tre millimolarglukose, og velger lysbanen og filtrene for avbildning av grønne fluoroforer.Kjør deretter live bildebehandling for å konfigurere bildeparametrene og justere visningen for å fange opp interessens holmer. For å optimalisere signal-til-støy-forholdet til bildet, juster eksitasjonslysintensiteten, eksponeringstiden og binningen, og sikrer at innstillingene tillater en tydelig visualisering av hver celle i holmene ved minimal mulig lysintensitet og eksponering. Deretter bilde holmene på 0,1 til fem hertz, sjekke kvaliteten på de oppkjøpte dataene som det er fanget.Når alfacelleaktiviteten kan oppdages, bruk et nettbasert diagram over signaldynamikken i oppkjøpsprogramvaren som mulig og legg til adrenalin eller glutamat i badeløsningen i to til fem minutter. Et raskt hopp i kalsium etterfulgt av en nedgang eller kansellering av alfacellesvingninger vil bli observert. Deretter legger ghrelin, som nylig har blitt rapportert å aktivere deltaceller selektivt.En rask reversibel økning i kalsium vil bli observert i en liten underpopulasjon av holmeceller. Tilsett deretter 10 millimolar glukose. En koordinert oscillatorisk respons i betacelleunderpopulasjonen vil bli observert.Legg også merke til svarene fra celler som tidligere ble aktivert av adrenalin eller glutamat og ghrelin. Etter lagring av bildene, importerer du dataene til et passende dataanalyseprogram og normaliserer rå fluorescensintensitetsdata til den opprinnelige verdien av fluorescens. Hvis datasettet for cellevariasjonsfluorescensintensitet fortsatt er betydelig, definerer du et kontrollområde for tidsperioden kontrollløsningen ble brukt under.Hvis kontrollområdet har et klart ikke-svingende signal, må du anta at fluorescensintensiteten returnerte til baseline etter hver påføring av kontrollløsningen. Hvis du vil rette opp tidsforløpsdataene for hver celle, deler du dataene i segmenter atskilt med punktene der kontrollløsningen ble lagt til, og bruker lineær korreksjon på hvert segment. Hvis kontrollområdet har klare svingninger eller flere faktorer finnes, bruker du en algoritme for gjenkjenning av pigger.For å måle hyppigheten av kalsiumpigger og responsen på tilsetning av agonister og antagonister, del opptaket i like tidsintervaller, tell toppene innenfor intervallet og normaliser til intervallvarigheten for å beregne tidsforløpet for den delvise frekvensen. Du kan også angi terskelen og beregne platåfraksjonen for hvert av intervallene. Fraksjonen angir prosentandelen av tid innenfor intervallet som cellen brukte i den spente tilstanden.Eller beregne det delvise området under kurven for hvert av intervallene. Med mindre membranens lipidsammensetning har blitt påvirket, laster holmer ganske bra med tropiske fargestoffer. Den menneskelige adenovirus type 5 vektor også vellykket rettet mot holmeceller.Kalsiumspiking i alfaceller kan lett oppdages ved lavt glukosenivå, og det er en høy celle-for-celle korrelasjon mellom aktiviteten ved lavt glukose og responsen på adrenalin og glutamat. Ghrelin aktiverer noen adrenalin responsive celler ved lav glukose, men har ingen effekt på kalsiumdynamikk i de fleste cellene som aktiveres av lav glukose. Når analysert i form av delvis frekvens, adrenalin eller ghrelin-stimulert celler viser en betydelig økning under alt-eller-ingenting forhold, selv om de generelle endringene mellom basal spiking og adrenalin effekten er subtile.I motsetning er det delvise området under kurven følsomt for endringene introdusert av adrenalin i alle cellene, selv når basalaktiviteten er høy. Kontroller at alle nettene er i kontakt med bildeoppløsningen og pass på at vevet er rimelig tett for å unngå luftbobler. Metoden kan utvides til å omfatte kunstig intelligens for differensiering mellom celletypene.De farmakologiske markørene kan erstattes av mønstergjenkjenningsteknologien, og dermed redusere opptakstiden.

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Pancreatic Islet Isolation

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Utarbeidelse av acinøse Cells for hensikten med Kalsium Imaging, celleskade Measurements, og adenovirus infeksjon

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...